喬能虎 張靜靜 劉德健 湯孝勝 郗麗君 劉建國

（中國石油大學(xué)（華東），青島 266580）

陶厄氏菌Thauera sp. K11對酚類化合物降解作用及途徑研究

喬能虎 張靜靜 劉德健 湯孝勝 郗麗君 劉建國

（中國石油大學(xué)（華東），青島 266580）

旨在分析陶厄氏菌屬（Genus Thuaera）中的一株菌株Thauera sp. K11對含酚廢水中酚類化合物的降解作用和途徑。以石化污水廠分離菌株K11為研究對象，克隆其16S rRNA基因和關(guān)鍵酶基因，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，在基因水平探究苯酚降解機(jī)理；利用氣相色譜技術(shù)檢測酚類化合物降解效果和苯酚降解機(jī)理。結(jié)果顯示，利用16S rRNA系統(tǒng)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)K11是陶厄氏菌屬的一株細(xì)菌。該菌對11種酚類化合物具有降解作用，其中5種酚類化合物72 h的降解率＞90%?？寺〔@得了K11的苯酚羥化酶和鄰苯二酚雙加氧酶基因。酶活性測定表明，K11通過苯酚羥化酶催化苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，然后利用鄰苯二酚-2，3-雙加氧酶催化產(chǎn)生2-HMSA。陶厄氏菌Thauera sp. K11是一株能夠降解多種酚類化合物的菌株，具有較強(qiáng)的酚類污染物降解能力，其通過苯酚→鄰苯二酚→2-HMSA途徑進(jìn)行苯酚降解。

陶厄氏菌屬；石化廢水；酚類化合物；生物降解；苯酚羥化酶；鄰苯二酚雙加氧酶

含酚廢水是紙品制造、塑料生產(chǎn)、皮革紡織、農(nóng)藥醫(yī)藥合成、焦化、煉油等行業(yè)產(chǎn)生的一類污染物，21世紀(jì)初期含酚廢水即被列為我國水污染控制中“重點解決的有害廢水之一”［1］。含酚廢水中主要包含苯酚、氯酚、甲酚、間苯二酚及其他酚類物質(zhì)，其中以苯酚污染尤為嚴(yán)重。酚類化合物是一類離子化、弱酸性的有機(jī)物，具有毒性大、難降解的特點。此外，酚類化合物還被認(rèn)為是一類原生質(zhì)毒物［2］，可造成原生質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)變性凝固。有研究表明，含酚廢水可對人體、水生生物、作物植物等產(chǎn)生巨大危害［3-4］。2013年，我國全年工業(yè)廢水中酚類化合物的排放總量為1 259.1 t［5］，污染形式非常嚴(yán)峻。

目前我國采用的含酚廢水處理方法主要包括物化法（吸附法、萃取法和液膜法）、化學(xué)法（沉淀法、氧氣法、電解法和光催化法）和生化法（酶處理技術(shù)、生物接觸氧化法和生物流化床）三大類［6］。為了提高含酚廢水的處理效果，通常采用多種方法協(xié)同處理。在酚類化合物中以苯酚為例，苯酚的降解途徑為：首先在苯酚羥化酶（Phenol hydxoxylase）的作用下苯酚轉(zhuǎn)化成兒茶酚（Catechol），這是苯酚好氧降解過程中的限速步驟。隨后的兒茶酚降解途徑有兩種：鄰位（Ortho）降解和間位（meta）降解，分別由兒茶酚 1，2-雙加氧酶（Catechol 1，2-dioxygenase）和兒茶酚 2，3-雙加氧酶（Catechol 2，3-dioxygenase）催化［7］。因此，研究苯酚羥化酶和兒茶酚雙加氧酶這兩個關(guān)鍵酶的基因和活性，對于明確微生物的酚類化合物降解途徑具有重要意義。

在含酚廢水處理過程中，生化法因其具有高效低耗的優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用［8］?；钚晕勰喙に囀巧ㄖ凶畛Ｓ玫募夹g(shù)手段，在活性污泥中，起主要作用的是能夠降解污染物的細(xì)菌菌群。因此針對特定細(xì)菌的研究將有利于充分提高含酚廢水的生化處理效果。本課題組前期對東營市墾利石化污水處理廠來源的活性污泥的研究發(fā)現(xiàn)，陶厄氏菌（Genus Thauera）作為活性污泥的優(yōu)勢菌群，在酚類化合物的降解過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［9］。分子生物學(xué)及相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，陶厄氏菌屬不僅能夠降解酚類污染物［10］，還具有脫氮除磷作用［11］和反硝化作用［12-13］。陶厄氏菌的芳香化合物的降解機(jī)制存在較多未解之謎。如以往普遍認(rèn)為的兒茶酚雙加氧酶僅會在有氧條件下催化苯環(huán)的開環(huán)，但研究證實，在陶厄氏菌 T. aromatica K172 中，兒茶酚 1，2-雙加氧酶在厭氧條件下才有活性［14］。因此，研究陶厄氏菌降解酚類物質(zhì)的作用和機(jī)理，對于揭示含酚廢水的生物處理、降低酚類化合物污染等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本研究利用從山東省東營市墾利石化污水處理廠采集的活性污泥樣品，通過“菌懸液接種-樣品篩選-分離-純化-再純化-菌株保存-菌株16S rRNA基因測序”的步驟，篩選出一株具有降解酚類化合物功能的陶厄氏細(xì)菌K11?，F(xiàn)保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC=1.5731）和韓國農(nóng)業(yè)典型菌種保藏中心（KACC=19216）。

1.1.2 主要試劑 實驗所用酚類化合物除苯酚外均購自日本TCI試劑公司，苯酚、乙酸丁酯、氯仿以及無機(jī)鹽培養(yǎng)基成分化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)，酵母提取物、麥芽糖提取物購自O(shè)XOID公司。所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基類型 GYM培養(yǎng)基：葡萄糖，4 g/L；酵母提取物，4 g/L；麥芽糖提取物 10 g/L，調(diào)至pH 7.0。

基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MS）：（NH4）2SO41.32 g/L，K2HPO4·3H2O 2.28 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.47 g/L，MgSO40.12 g/L，ZnSO4·7H2O 0.46 mg/L，CaCl22.63mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.72 mg/L，MnSO40.12 mg/L，調(diào)至pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 陶厄氏細(xì)菌的系統(tǒng)分類學(xué)分析 在無菌的條件下，將陶厄氏細(xì)菌K11接種到GYM培養(yǎng)基，在35℃恒溫?fù)u床上170 r/min培養(yǎng)48 h，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取該細(xì)菌的基因組，利用通用引物27F和1492R擴(kuò)增其基因組，電泳檢測后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

通過對陶厄氏菌K11和相似細(xì)菌基因序列的比對，利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法（Neighbourjoining），自展值1 000（bootstrap value=1 000）構(gòu)建分離菌株及其最相近種屬標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 陶厄氏菌K11對多種酚類化合物降解作用的研究 將K11接種到MS培養(yǎng)基，以類酚類化合物作為唯一碳源，初始酚濃度分別設(shè)定為500 mg/L和1 000 mg/L。在30℃，150 r/min條件下培養(yǎng)72 h，利用含有5 mg/L乙酸丁酯作為內(nèi)標(biāo)物的氯仿作為萃取劑，對發(fā)酵液進(jìn)行萃取處理，萃取樣品進(jìn)行氣相色譜（Agilent 7890A）分析，以確定酚類化合物的降解效果。

色譜條件：選用HP-5色譜柱分流進(jìn)樣，分流進(jìn)樣比為20∶1；進(jìn)樣口溫度320℃；FID檢測器溫度320?；程序升溫，初始溫度為60℃，恒溫1 min，20℃/min升溫至320℃，恒溫3 min；空氣流量為400 mL/min，H2流量為40 mL/min。進(jìn)樣量為1 μL。

1.2.3 陶厄氏菌K11對苯酚降解關(guān)鍵基因的克隆 苯酚的降解首先從苯酚的羥基化作用開始，生成鄰苯二酚或間苯二酚，然后進(jìn)行雙加氧作用開環(huán)，再經(jīng)過后期的酶促反應(yīng)逐步代謝進(jìn)入三羧酸循環(huán)［15］，最終為苯酚降解菌的生長繁殖提供能量。為了驗證苯酚在菌株K11體內(nèi)的降解途徑，根據(jù)Futamata［16］等設(shè)計的苯酚羥化酶基因引物，以及NCBI已發(fā)表的基因組序列，設(shè)計鄰苯二酚雙加氧酶基因的引物，如表1所示。利用K11的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，可獲得該基因的堿基序列信息。

表1 苯酚降解途徑的引物設(shè)計

1.2.4 陶厄氏菌K11對苯酚降解的關(guān)鍵酶活性研究 以500 mg/L苯酚作為唯一碳源，在30℃、150r/min條件下培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液經(jīng)10 000 r/min離心10 min（4℃），取沉淀，用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）清洗兩次后，重新懸浮。將懸浮液在冰浴條件下進(jìn)行超聲波破碎：循環(huán)99次，每次3 s，振蕩3 s，功率120 W。破碎后液體6 000 r/min離心10 min（4℃），去除沉淀得到粗酶液。

1.2.4.1 苯酚羥化作用途徑研究 取2.7 mL緩沖液、0.2 mL 300 mg/L的苯酚溶液及0.2 mL的粗酶液于試管中搖勻，置于40℃恒溫水浴中。在零時刻加入粗酶液，之后分別將試管在10-60 min內(nèi)每隔10 min取出，并煮沸3 min，直至酶失活，反應(yīng)終止。用含有5 mg/L乙酸丁酯作為內(nèi)標(biāo)物的氯仿作為萃取劑，萃取樣品進(jìn)行氣相色譜分析。色譜條件同1.2.2。

1.2.4.2 鄰苯二酚雙加氧酶途徑研究 分別移取2.9mL緩沖溶液、0.1 mL 0.01 mol/L的鄰苯二酚溶液及0.1 mL的粗酶液于試管中搖勻，放入37℃的恒溫水浴中。在零時刻加入粗酶液，之后分別將試管在1-18min內(nèi)每隔1 min取出，并煮沸3 min，直至酶失活，反應(yīng)終止；然后，分別將其放入紫外分光光度計（日本島津UV-2450）中連續(xù)（200-500 nm）掃描其光譜吸收特征。

鄰苯二酚存在兩種分解方式，分別是：1，2-雙加氧酶起作用底物后，產(chǎn)物為內(nèi)酯，在波長為在260 nm處有吸收峰。2，3-雙加氧酶起作用底物后，產(chǎn)物為2-HMSA（2-羥基黏康酸半醛），在波長為在375 nm處有吸收峰。

2 結(jié)果

2.1 陶厄氏細(xì)菌的系統(tǒng)分類學(xué)分析

獲得陶厄氏菌K11基因組的測序結(jié)果，用美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLAST程序?qū)υ摼?6S rRNA基因序列和GenBank已收錄的序列進(jìn)行核苷酸同源性比對發(fā)現(xiàn)，與之序列相似性最大的是已知標(biāo)準(zhǔn)菌株Thauera aromatica DSM6984T（X77118），相似度為97.49%。

利用MEGA6.0軟件，構(gòu)建出陶厄氏菌K11與其相近菌株的16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）發(fā)現(xiàn)K11獨立成簇。

2.2 陶厄氏菌K11對多種酚類化合物降解作用

經(jīng)過氣相色譜檢測，菌株Thauera sp. K11對酚類化合物降解效果（表2）。由表2降解試驗可知，以500 mg/L上述物質(zhì)計，培養(yǎng)72 h后，Thauera sp.K11對苯酚、間甲苯酚、2，4-二甲基苯酚、3，4-二甲基苯酚的降解能力可達(dá)到100%；其次，對鄰甲苯酚、2，5-二甲基苯酚、3-乙基苯酚的降解能力可達(dá)到80%以上；對對甲苯酚、2，6-二甲基苯酚的降解能力可達(dá)到70%以上；再次是對2，3-二甲基苯酚、3，5-二甲基苯酚的降解能力可達(dá)到57%以上。以1 000 mg/L上述物質(zhì)計，Thauera sp. K11對大部分物質(zhì)的降解率可以達(dá)到50%及以上。

圖1 陶厄氏細(xì)11與其標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 氣相色譜檢測酚類化合物降解效果

2.3 陶厄氏菌K11對苯酚降解關(guān)鍵基因的克隆

對K11基因組的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶如圖 2 所示。將目的DNA片段進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示，K11的苯酚羥化酶基因片段長度為 868 bp，與基因組數(shù)據(jù)庫（NCBI）的比對結(jié)果顯示，與之相似度最大的基因是 Thauera sp. HMW106 phenol hydroxylase alpha subunit（pheN）gene， 相 似 度 為99%。鄰苯二酚雙加氧酶片段長度為 927 bp，與基因組數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果顯示，除去基因組與之相似度最大的基因是 Thauera sp. MZ1T catechol 2，3-dioxygenase。將相似性高的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，得到系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)構(gòu)（圖 3），分析 K11的苯酚羥化酶基因和鄰苯二酚雙加氧酶基因在系統(tǒng)發(fā)育樹上的位置發(fā)現(xiàn)，其與 Thauera 屬相關(guān)基因進(jìn)化距離較近。因此，從基因水平上證實了該細(xì)菌是通過苯酚羥化酶和鄰苯二酚雙加氧酶的途徑進(jìn)行苯酚代謝的。

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 陶厄氏菌K11對苯酚降解的關(guān)鍵酶活性研究

2.4.1 苯酚羥化酶 氣相色譜分析結(jié)果（圖4）顯示，隨著酶催化時間的延長，鄰苯二酚在體系中能被檢測到，同時苯酚的含量逐步降低。推測苯酚被催化形成鄰苯二酚，但由于鄰苯二酚雙加氧酶的催化效率較高，鄰苯二酚檢測的含量較低。由實驗結(jié)果可得出，Thauera sp. K11是通過產(chǎn)生苯酚羥化酶，催化生成鄰苯二酚這一途徑降解苯酚。

圖3 菌株K11苯酚羥化酶基因（A）和鄰苯二酚雙加氧酶基因（B）系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4.2 鄰苯二酚雙加氧酶 實驗結(jié)果（圖5）顯示，在375 nm處，在1 min時就有波峰出現(xiàn)。說明此酶分解鄰苯二酚是從苯環(huán)兩羥基的間位斷開的，發(fā)現(xiàn)菌株Thauera sp. K11是通過鄰苯二酚-2，3-雙加氧酶催化酚進(jìn)行降解。

圖4 氣相色譜測定苯酚和鄰苯二酚的含量

圖5 紫外分光光度計掃描鄰苯二酚降解后產(chǎn)物

3 討論

目前陶厄氏細(xì)菌屬（Thuaera）下分離出10余種細(xì)菌，具有酚類化合物降解作用的包括Thuaera aromatic K172［17］、Thuaera aromatic T1［18］、Thuaera aromatic AR-1［19］等，還包括具有硒酸［20］和甲苯［21］降解作用的Thauera selenatis和Thauera sp. DNT-1等。據(jù)王大威［22］報道，在渤海N油田注水中陶厄氏細(xì)菌屬作為優(yōu)勢細(xì)菌屬存在，可見陶厄氏細(xì)菌屬分布之廣泛。酚類化合物是一類原生質(zhì)毒物，對細(xì)胞具有一定的毒害作用，因此這類化合物的微生物降解值得廣泛的關(guān)注。利用微生物分離、純化技術(shù)，在活性污泥樣品中分離到菌株K11，獲得該菌的16S rRNA基因序列，與其相似的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行序列對比發(fā)現(xiàn)，K11的16S rRNA基因相似度較低，豐富了微生物物種多樣性。

探究了該細(xì)菌對酚類化合物的降解作用和效果。通過氣相色譜實驗，當(dāng)酚類化合物濃度為500 mg/L時，經(jīng)過72 h培養(yǎng)可以完全降解苯酚、間甲苯酚、2，4-二甲基苯酚和3，4-二甲基苯酚，鄰甲苯酚、2，5-二甲基苯酚、3-乙基苯酚的降解效果可達(dá)到80%以上；對甲苯酚和2，6-二甲基苯酚的降解效果超過70%。酚類化合物濃度為1 000 mg/L時，細(xì)菌K11通過72 h培養(yǎng)，大部分物質(zhì)的降解率可以達(dá)到50%及以上?？梢缘贸?，陶厄氏菌K11是一株理想的含酚廢水降解細(xì)菌。

為了研究該細(xì)菌對酚類化合物的降解機(jī)理，以苯酚作為降解底物，在基因水平和酶活性水平說明了Thauera sp. K11對苯酚存在以下降解途徑的可能：首先通過表達(dá)苯酚羥化酶基因生成苯酚羥化酶，使苯酚增加一個羥基，變?yōu)猷彵蕉?；然后表達(dá)鄰苯二酚雙加氧酶基因生成鄰苯二酚雙加氧酶，使鄰苯二酚加氧開環(huán)，變成2-HMSA，隨后進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA cycle）被K11同化利用（圖6）。

圖6 Thauera sp. K11對苯酚的降解途徑

4 結(jié)論

在墾利石化污水處理廠的活性污泥中分離獲得一株較為新穎的陶厄氏菌Thauera sp. K11。通過氣相色譜實驗發(fā)現(xiàn)，該菌對11種酚類化合物具有降解作用，其中5種酚類化合物72 h的降解率＞90%。通過基因克隆獲得了K11的苯酚羥化酶和鄰苯二酚雙加氧酶基因。酶活實驗表明，K11通過苯酚羥化酶催化苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，然后利用鄰苯二酚-2，3-雙加氧酶催化產(chǎn)生2-HMSA，通過苯酚→鄰苯二酚→2-HMSA途徑進(jìn)行苯酚降解。因此，可以推斷，Thauera sp. K11是一株能夠降解多種酚類化合物的菌株。

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Study On the Degradation and Mechanism of Phenolic Compounds by the Thauera sp. K11

QIAO Neng-hu ZHANG Jing-jing LIU De-jian TANG Xiao-sheng XI Li-jun LIU Jian-guo
（China University of Petroleum（East China），Qingdao 266580）

The objective of this work is to analyze the degradation and pathways of a Thauera sp. K11 in genus Thauera to phenolic compounds in phenolic wastewater. Thauera sp. K11 was isolated from petrochemical wastewater treatment plant .The 16S rRNA gene and key enzyme gene were cloned and analyzed and phylogenetic analysis was carried out. The mechanism of phenol degradation was explored at the gene level. The degradation efficiency and mechanism of phenolic compounds were studied by gas chromatography. The 16S rRNA phylogenetic analysis revealed that the bacterium Thauera sp. K11 was a species of bacteria from the genus Thauera，which degraded 11 phenolic compounds. The degradation rates of the five phenolic compounds were ＞ 90 % in 72 h. The K11 phenol hydroxylase and catechol dioxygenase genes were cloned，and the enzyme activity assay showed that K11 catalyzed the conversion of phenol to catechol by phenol hydroxylase and then catalyzed the production of 2-HMSA with catechol-2，3-dioxygenase. In conclusion，the bacterium Thauera sp. K11 is a species of Thauera bacterium capable of degrading a variety of phenolic compounds，and possesses the strong capability of degrading phenolic pollutants；the degradation pathway is by phenol→ catechol→ 2-HMSA.

genus Thauera；petrochemical wastewater；phenolic compounds；biodegradation；phenol hydroxylase；catechol-2，3-dioxygenase

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0452

2017-05-31

國家自然科學(xué)基金項目（31400005）

喬能虎，男，碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：qiaonenghu@126.com

郗麗君，女，碩士生導(dǎo)師，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：xilj@upc.edu.cn

（責(zé)任編輯 狄艷紅）