毛旭華， 湯俊明， 喬國洪， 陳姝穎， 王海嘯

論 著

高分辨率熔解曲線技術(shù)檢測結(jié)直腸癌患者KRAS基因突變

毛旭華， 湯俊明， 喬國洪， 陳姝穎， 王海嘯

目的探討高分辨率熔解曲線技術(shù)(HRM)檢測結(jié)直腸癌患者KRAS基因突變的可行性及其臨床意義。方法采用HRM技術(shù)檢測60例結(jié)直腸癌患者石蠟包埋組織標(biāo)本KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變，并與Sanger測序法檢測結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果HRM法檢測結(jié)直腸癌患者KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變檢出率為36.67%(22/60)，Sanger測序法檢測突變檢出率為33.33%(20/60)。HRM法檢測突變檢出率高于Sanger測序法，HRM法檢測敏感性為100%，特異性為95.24%。結(jié)論HRM法檢測KRAS基因突變，靈敏度高，敏感性和特異性好，具有操作簡便、節(jié)約時(shí)間、成本低的特點(diǎn)，方法可行。

結(jié)直腸腫瘤； 基因，KRAS； 突變； 高分辨率熔解曲線

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有140萬例患者診斷為結(jié)直腸癌，其中有近70 萬人死于該病[1-2]。KRAS基因是常見的致癌基因之一，其中30%～50%結(jié)直腸癌患者伴有KRAS基因突變。KRAS基因是否突變是了解腫瘤發(fā)展、預(yù)后、療效的關(guān)鍵指標(biāo)。KRAS基因最常見的突變?yōu)?號(hào)外顯子12和13位密碼子點(diǎn)突變，約90%的突變發(fā)生于此，極少部分發(fā)生于61、63、117和146位密碼子[3-4]。高分辨率熔解曲線(high resolution melting，HRM)是2003 年興起的一種基因序列分析新技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)、閉管操作等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。本研究采用HRM法針對(duì)結(jié)直腸癌患者KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變檢測進(jìn)行研究，并探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本收集

2015年1月至2016年12月，江蘇大學(xué)附屬宜興市人民醫(yī)院收治的經(jīng)病理診斷為結(jié)直腸癌的石蠟包埋組織樣本60例，其中男34例，女26例，年齡38～72歲，中位年齡62歲。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物 設(shè)計(jì)適用于HRM技術(shù)檢測KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變的引物，引物序列如下：正向引物：5’-AAGGCCTGCTGAAAATGAC-3’，反向引物：5’-TGGTCCTGCACCAGTAATATG-3’。

1.2.2 HRM反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 HRM技術(shù)檢測KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變反應(yīng)體系為：DNA模板，200 nM primers，3 mM MgCl2和LightCycler HRM Master Reaction Mix (瑞士Roche公司)，反應(yīng)體積20 μl。采用儀器為Roche LightCycler 480 system。HRM技術(shù)檢測KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃變性10 s，65 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)(采用touchdown技術(shù)[7]，前10個(gè)循環(huán)退火溫度從65 ℃降到55 ℃，每個(gè)循環(huán)降1 ℃)。擴(kuò)增結(jié)束進(jìn)行熔解曲線分析，反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，熔解曲線數(shù)據(jù)收集從70 ℃到95 ℃，溫度上升速率為1 ℃/s。40 ℃冷卻。

1.2.3 HRM技術(shù)檢測KRAS基因 2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變結(jié)果均與Sanger測序法檢測結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。分析其特異性和敏感性。

2 結(jié)果

2.1 HRM法和Sanger測序法檢測KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析

在60例結(jié)直腸癌患者中，HRM法共檢測出KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變22例，檢出率為36.67%。其中G12S檢出6例，G12D檢出7例，G12V檢出3例，G12C檢出2例，G13D檢出4例。Sanger測序法檢測到KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變20例，檢出率為33.33%。其中G12S檢出6例，G12D檢出6例，G12V檢出2例，G12C檢出2例，G13D檢出4例。結(jié)果見表1。圖1為實(shí)驗(yàn)中選取的HRM法檢測KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變示意圖，圖2為Sanger測序法檢測KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變示意圖。

表1 HRM法和Sanger測序法檢測KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變結(jié)果

2.2 HRM法特異性和敏感性

以Sanger測序法結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，HRM法檢測KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變，敏感性為100.00%，特異性為95.24%。

3 討論

KRAS基因是一種重要的原癌基因，是RAS基因家族成員之一，其定位于12p12.1，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為21kD，具有GTP 酶活性的p21 蛋白[8-9]。突變型KRAS基因，在無需活化EGFR的條件下，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞的生長、增殖和凋亡發(fā)生異常。細(xì)胞傳導(dǎo)信號(hào)的紊亂以及增殖的失控會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞癌變[7]。KRAS基因突變主要在2號(hào)外顯子12和13位密碼子上發(fā)生點(diǎn)突變?yōu)橹鳌RAS基因是否突變是了解腫瘤發(fā)展、預(yù)后、療效的關(guān)鍵指標(biāo)。目前，KRAS基因突變的檢測已得到廣泛的認(rèn)同和使用，《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》指出，結(jié)直腸癌患者應(yīng)該檢測KRAS基因的狀態(tài)，只有KRAS基因野生型的患者才建議使用表皮生長因子受體抑制劑的治療。

檢測KRAS基因突變的方法有很多，直接測序法、二代測序法、Taqman探針法、變性高效液相色譜法、突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)法等。目前，國內(nèi)臨床檢測KRAS 基因突變主要采用Sanger測序法和ARMS法。Sanger測序法被公認(rèn)為是基因檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但隨著時(shí)代的發(fā)展，基因檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，Sanger測序方法學(xué)的限制，其檢測靈敏度已不能滿足基因檢測的需要。對(duì)于腫瘤組織DNA含量少，基因突變比例低的樣本，Sanger測序法無法準(zhǔn)確檢測，易產(chǎn)生假陰性。ARMS法操作簡便，靈敏度高，但其價(jià)格昂貴。因此尋找并建立一個(gè)成本低、操作簡單、準(zhǔn)確可靠的檢測方法，并推廣到臨床應(yīng)用，顯得尤為重要。

圖1 HRM法檢測KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變示意圖

HRM 技術(shù)是PCR 擴(kuò)增技術(shù)與熔解曲線分析技術(shù)相結(jié)合，依靠高分辨溫度檢測PCR儀和新型飽和熒光染料實(shí)現(xiàn)基因序列分析的新技術(shù)[6]。HRM法的原理在擴(kuò)增含突變位點(diǎn)基因的過程中，由于突變位點(diǎn)不匹配導(dǎo)致雙鏈 DNA在升溫過程中會(huì)先解開,熒光染料從局部解鏈的 DNA分子上釋放，從熒光強(qiáng)度與時(shí)間曲線上就可以判斷是否存在突變位點(diǎn)[7]。HRM技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)、閉管操作等優(yōu)點(diǎn)[6]，同時(shí)HRM技術(shù)具有較高的靈敏度。文獻(xiàn)報(bào)道，HRM技術(shù)檢測限為5%[6]，有學(xué)者指出，HRM方法檢測基因突變的檢出限可達(dá)1%[10]。其唯一不足之處是無法得知具體突變類型，對(duì)于KRAS基因這類已廣泛深入研究的基因檢測而言，此不足在實(shí)際臨床檢測工作中影響甚小。

本研究中，HRM法檢測KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變，檢出率為36.67%，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]的30%～40%檢出率相似。本研究結(jié)果顯示，HRM法突變檢出率略高于Sanger測序法，已初步表現(xiàn)出HRM法檢測靈敏度的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，敏感性和特異性均符合臨床應(yīng)用要求。本研究中HRM法比Sanger測序法多檢出的突變是否存在假陽性，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以及臨床療效觀察驗(yàn)證。

總之，HRM法檢測KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變，靈敏度高，敏感性和特異性好，操作簡便，節(jié)約時(shí)間，成本低的特點(diǎn)，適合臨床應(yīng)用。

圖2 Sanger測序法檢測KRAS基因2號(hào)外顯子12和13位密碼子突變示意圖

[1] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(1):7-30.

[2] 潘雪峰, 范乃軍, 高春芳. LncRNA與結(jié)直腸癌診斷治療的研究進(jìn)展[J].腫瘤學(xué)雜志,2017,23(2):111-115.

[3] 凌云, 應(yīng)建明, 邱田, 等. 結(jié)直腸癌患者KRAS、BRAF及PIK3CA基因突變檢測分析[J].中華病理學(xué)雜志,2012,41(9):590-594.

[4] Lea IA, Jackson MA, Li X, et al. Genetic pathways and mutation profiles of human cancers: site- and exposure-specific patterns[J]. Carcinogenesis, 2007,28(9):1851-1858.

[5] Gundry CN, Vandersteen JG, Reed GH, et al. Amplicon melting analysis with labeled primers: a closed-tube method for differentiating homozygotes and heterozygotes[J]. Clin Chem, 2003,49(3):396-406.

[6] 王姣, 尤崇革. 高分辨率熔解曲線技術(shù)及應(yīng)用新進(jìn)展[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,42(5):55-61.

[7] 王卓, 井昶雯, 曹海霞, 等. 高分辨率熔解曲線分析技術(shù)檢測 EGFR 基因突變方法的建立及其初步臨床應(yīng)用[J].中國腫瘤外科雜志,2014,(4):236-239.

[8] Tan C,Du X.KRAS mutation testing in metastatic colorectal cancer[J].World J Gastroenterol, 2012,18(37):5171-5180.

[9] 李麗娟, 羅婉珊, 張家彬, 等. 基于下一代測序平臺(tái)的結(jié)直腸癌KRAS基因檢測[J].分子診斷與治療雜志,2016,8(6):401-406.

[10] 劉麗琴. 結(jié)直腸癌和肺癌KRAS和BRAF基因突變HRM檢測方法的建立[D].廣州: 南方醫(yī)科大學(xué),2012.

[11] 劉影, 鄭細(xì)閏, 朱亞珍, 等. 252例結(jié)直腸癌組織中KRAS、NRAS、 BRAF、PIK3CA的基因突變分析[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2016,32(8):851-855,859.

[12] 祁秀敏, 張熔熔, 唐威. Kras、Nras、Braf基因突變聯(lián)合檢測在轉(zhuǎn)移性大腸癌中的意義[J].廣東醫(yī)學(xué),2017,38(2):276-279.

DetectionofKRASmutationsincolorectalcancerpatientsbyhighresolutionmelting

MAOXuhua1,TANGJunming1,QIAOGuohong1,CHENShuying2,WANGHaixiao3.

(1.ClinicalLaboratory,AffiliatedYixingPeople’sHospital,JiangsuUniversity,Wuxi214200,China；2.DepartmentofPathology,AffiliatedYixing’sPeopleHospital,JiangsuUniversity,Wuxi214200,China；3.DepartmentofGastrointestinalSurgery,Huai’anFirstPeople’sHospital,NanjingMedicalUniversity,Huai’an223300,China)

WANGHaixiao,Email:whxnjmu@163.com

ObjectiveTo explore the clinical significance of detecting KRAS mutations in colorectal cancer (CRC) patients by high resolution melting (HRM).MethodsThe mutations of KRAS 12 and 13 codons in exon 2 were detected with HRM in 60 formalin-fixed paraffin-embedded samples,and compared with Sanger sequencing.ResultsThe KRAS mutation rate of 12 and 13 codons in exon 2 was 36.67% (22/60) detected by HRM and was 33.33% (20/60) detected by Sanger sequencing.The KRAS mutation rate detected by HRM was higher than that by Sanger sequencing.Compared with Sanger sequencing,the sensitivity of HRM was 100%, and the specificity of HRM was 95.24%.ConclusionsDetecting KRAS mutations by HRM possesses high specificity,good sensitivity,simple operation,saving time and low cost quality.It is feasible,and suitable for promotion.

Colorectal neoplasms; Genes, KRAS; Mutation; High resolution melting analysis

2016年宜興市科技局民生項(xiàng)目(社會(huì)發(fā)展類)

214200 江蘇 無錫，江蘇大學(xué)附屬宜興市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科(毛旭華，湯俊明，喬國洪)； 病理科(陳姝穎)； 223300 江蘇 淮安，南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院 胃腸外科(王海嘯)

王海嘯，Email：whxnjmu@163.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.05.006

1674-4136(2017)05-0296-04

2017-07-05] [本文編輯：李慶]