吳波, 馮凱, 職曉陽, 何強,5, 許玫英, 鄧曄, 肖凡書, 汪善全, 于玲，魯祺鴻，連英麗，羅麗娟，原珂，陳保衛(wèi)，顏慶云, 仇榮亮, 欒天罡, 賀志理,9

(1.中山大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院環(huán)境微生物組研究中心，廣東 廣州 510006；2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京100085；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；4.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物研究所, 云南 昆明 650091；5.田納西大學(xué)城市與環(huán)境工程系及環(huán)境生物技術(shù)研究中心，田納西 諾克斯維爾 37996；6.廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070；7.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；8.中山大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；9.俄克拉荷馬大學(xué)環(huán)境基因組學(xué)研究所, 俄克拉荷馬 諾曼 73019)

環(huán)境微生物組多樣性及功能研究進展

吳波1, 馮凱2,3, 職曉陽4, 何強1,5, 許玫英6, 鄧曄2, 肖凡書1, 汪善全1, 于玲1，魯祺鴻1，連英麗1，羅麗娟7，原珂8，陳保衛(wèi)8，顏慶云1, 仇榮亮1, 欒天罡7, 賀志理1,9

(1.中山大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院環(huán)境微生物組研究中心，廣東 廣州 510006；2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京100085；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；4.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物研究所, 云南 昆明 650091；5.田納西大學(xué)城市與環(huán)境工程系及環(huán)境生物技術(shù)研究中心，田納西 諾克斯維爾 37996；6.廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070；7.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；8.中山大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；9.俄克拉荷馬大學(xué)環(huán)境基因組學(xué)研究所, 俄克拉荷馬 諾曼 73019)

快速發(fā)展的測序技術(shù)和各種高通量手段使我們能夠深入探索環(huán)境微生物的多樣性及其功能。本文中提及的環(huán)境微生物組(environmental microbiome)界定為特定環(huán)境中所有微生物基因組的集合。環(huán)境微生物組研究的主要目的是解讀特定環(huán)境中微生物的多樣性、結(jié)構(gòu)、功能、相互作用和進化，以及它們與環(huán)境因子和生態(tài)系統(tǒng)功能之間的關(guān)系等。本文重點關(guān)注土壤、水體及空氣中的微生物組研究，回顧了目前的高通量測序技術(shù)和主要的環(huán)境微生物組學(xué)數(shù)據(jù)分析工具，然后綜述了不同的生態(tài)環(huán)境中微生物組研究的主要的進展，最后，提出了環(huán)境微生物組研究中的關(guān)鍵科學(xué)問題，并突出了在未來環(huán)境微生物組研究中微生物功能和生態(tài)機制的重要性。

環(huán)境微生物組；微生物功能；宏基因組；生物信息學(xué)工具

微生物廣泛分布于我們生活的環(huán)境甚至是極端環(huán)境中，且在全球生產(chǎn)力、人類健康、生物地球化學(xué)循環(huán)(如碳、氮、磷、硫、金屬等)、食品和生物資源、以及環(huán)境污染物修復(fù)等方面發(fā)揮著重要的作用。研究表明，土壤微生物能幫助植物抵抗疾病、促進生長、增強抗逆性和影響作物的產(chǎn)量及質(zhì)量等[1-5]。

微生物通常分為3大類：細菌，古菌和真核生物，其個體大小差異非常大，從0.2 μm到200 μm不等，是公認的多樣性最高的生物類群。但是因為檢測限的制約，使得稀有微生物多樣性的檢測受到了極大的挑戰(zhàn)[6]。最近，基于35 000個樣地的高通量分子數(shù)據(jù)，通過相似律結(jié)合對數(shù)正態(tài)模型預(yù)測全球微生物大概有1012種，但目前只有0.001%的種類被鑒定[7]。在此，“微生物組”指的是特定環(huán)境中的微生物基因組的集合，包括主體相關(guān)的生態(tài)系統(tǒng)，而“微生物群”是指微生物的集合。環(huán)境微生物組學(xué)是指分析各種環(huán)境中的微生物基因組信息，包括自然環(huán)境(如土壤、沉積物、水和空氣)和人工環(huán)境(如生物反應(yīng)器、建筑)。環(huán)境微生物組研究的目的是理解微生物群落的多樣性、結(jié)構(gòu)、功能、相互作用、動態(tài)演化等及其與環(huán)境因素和生態(tài)系統(tǒng)功能的關(guān)系。

相對于人類、動物和植物微生物組，環(huán)境微生物組研究面臨著更多的挑戰(zhàn)。 第一，環(huán)境微生物的多樣性和豐度特別高，它們交織在一起形成極為復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)。1 g土壤可能含有數(shù)以百萬計的微生物種類[8-9]；全球海底沉積微生物豐度約為2.9×1029個細胞[10]。因此，表征多樣性極高的微生物群體仍然是一個非常艱巨的任務(wù)。其次，大部分(>99%)的微生物還無法培養(yǎng)[7, 11]，所以研究它們在環(huán)境中的功能更加困難。第三，由于環(huán)境變化，微生物會快速的適應(yīng)和進化，產(chǎn)生了時間變化和生物地理學(xué)的動態(tài)模式。此外，只有少部分的環(huán)境微生物被測序作為參考基因組，這限制了對微生物在環(huán)境中的功能作用和潛在機制的了解。

本文重點關(guān)注土壤、水體和空氣環(huán)境中的微生物組，并回顧了目前環(huán)境微生物組學(xué)技術(shù)的發(fā)展。我們也提出了要解決的關(guān)鍵科學(xué)問題，突出了在未來環(huán)境微生物組研究中對微生物功能、相互作用和潛在機制的理解。

1 環(huán)境微生物組研究中測序技術(shù)及生物信息學(xué)工具的發(fā)展歷程

高通量測序技術(shù)的發(fā)展對我們探索微生物多樣性、組成、功能、作用和演變等基本問題至關(guān)重要。同時，生物信息學(xué)工具的開發(fā)在解析和理解這些由高通量測序產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)中具有不可或缺的作用。因此，我們首先回顧了當前的測序技術(shù)和與環(huán)境微生物組學(xué)分析相關(guān)的生物信息學(xué)工具。

1.1 測序技術(shù)

測序技術(shù)已發(fā)展到第3代：包括第1代傳統(tǒng)的Sanger測序、第2代高通量測序、第3代單分子測序。目前，第2代測序技術(shù)，尤其是Illumina 平臺(例如，Miseq, Hiseq, Hiseq X, Moleculo, NovaSeq等)對于環(huán)境微生物組學(xué)研究有許多優(yōu)點，具有通量高、錯誤率和成本低等特征[12-13]。Illumina 測序平臺具有能獲得不同測序讀長和通量的測序儀，例如，Moleculo能夠產(chǎn)生更長的讀長(>8 kb)[14]。

單分子測序技術(shù)的開發(fā)為微生物的研究提供了更便利的條件。由于不需進行DNA擴增，因此極大地提高了測序精度，降低了錯誤率[12]。目前，最廣泛使用的是太平洋生物科學(xué)公司(PacBio)基于單分子實時(SMRT)測序技術(shù)的平臺[15]，這種測序方法取決于DNA聚合酶和零模波導(dǎo)孔所指示的光能。PacBio測序儀能在很短的時間內(nèi)產(chǎn)生長達10～25 kb的讀長，并且能檢測DNA的甲基化修飾[16]。另外一種有前景的單分子測序由牛津納米科技公司( Oxford Nanopore Technologies )開發(fā)的納米孔測序，其中單個DNA分子在通過納米孔時被直接測序[17]。雖然PacBio和納米孔測序技術(shù)都可以檢測DNA修飾堿基[17]，但是都存在測序通量低，測序錯誤率高的問題[13]，從而限制了它們在環(huán)境微生物組研究中的應(yīng)用。而當單分子測序技術(shù)和第二代測序技術(shù)結(jié)合使用時，Tsai等[18]能夠檢測微生物的單核苷酸多態(tài)性水平的變化，表明這種結(jié)合使用的方法將成為環(huán)境微生物研究中進行宏基因組定量、重建以及功能注釋的強有力手段。

1.2 環(huán)境微生物數(shù)據(jù)分析工具

通常環(huán)境微生物研究可以產(chǎn)生兩種類型的數(shù)據(jù)：擴增子及鳥槍法宏基因組/宏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。由于它們的分析方法不同，因此相應(yīng)地開發(fā)了多種數(shù)據(jù)分析工具。

1.2.1 擴增子測序數(shù)據(jù) 系統(tǒng)發(fā)育和功能性標記基因?qū)τ谔剿鳝h(huán)境微生物的分類學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育以及種群多樣性及其功能具有重要意義。系統(tǒng)進化分子標記基因中，用于標記細菌和古細菌的16S rRNA基因[19]及用于真菌的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)[20]最為常見，因此針對系統(tǒng)發(fā)育標記基因擴增產(chǎn)物的分析開發(fā)出了許多生物信息學(xué)工具(例如，QIIME、Mothur)。

功能基因擴增子測序可以提供與微生物群落功能直接相關(guān)的信息，例如nifH基因與固氮菌[21]，及amoA基因與硝化細菌[22]功能的相關(guān)性，而這些在系統(tǒng)發(fā)育基因中的研究較少。功能基因擴增子分析與基于系統(tǒng)發(fā)育標記的分析類似，但功能基因擴增子分析需要額外的步驟進行移碼校正來預(yù)測蛋白質(zhì)編碼區(qū)，并與相應(yīng)的功能基因數(shù)據(jù)庫比對以獲得相應(yīng)的功能信息。但如果沒有對應(yīng)的功能基因數(shù)據(jù)庫，就需要為每個功能基因家族構(gòu)建一個數(shù)據(jù)庫。值得關(guān)注的是，F(xiàn)unGene提供多種功能基因數(shù)據(jù)庫，涉及多種生態(tài)途徑(如C、N循環(huán))以及集成功能基因分析工具，如mcClust, RDPTools及FrameBot[23]。值得一提的是，其中的一些具體算法和工具，如PICRUSt，Tax4Fun，F(xiàn)APROTAX，F(xiàn)UNGuild及PAPRICA可通過系統(tǒng)發(fā)育標記基因序列推斷微生物功能特征。

1.2.2 鳥槍法宏基因組及宏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù) 鳥槍法宏基因組及宏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)確保了信息從遺傳物質(zhì)到功能角度的傳遞，并為探索所有遺傳要素及其在環(huán)境中的動態(tài)提供了可能[24]。通常宏基因組測序數(shù)據(jù)分析包括基于讀長的分析和基于組裝的分析?；谧x長的分析包括以下5個步驟：① 對原始讀長進行預(yù)處理；② 將序列比對到分類群；③ 基因預(yù)測；④ 功能基因注釋；⑤ 豐度計算及統(tǒng)計分析。基于組裝的分析與基于讀長的分析類似，除了在基因預(yù)測之前需要使用多種組裝方法將短的原始讀長組裝成更長的片段，組裝方法包括基于參考序列的組裝和從頭組裝。

由于對計算資源的高度要求，基于宏基因組測序數(shù)據(jù)的組裝分析一般是以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)的工作流程[25]。目前，常用的宏基因組分析工具/流程是MEGAN[26]，MG-RAST[27]，IMG/M[28]和CAMERA[29]。最近開發(fā)的MEGAN CE可用于大規(guī)模的微生物測序數(shù)據(jù)分析，是MEGAN的更新版本[30]。MEGAN CE結(jié)合了DIAMOND[31]與MganServer，具有大規(guī)模鳥槍法宏基因組測序數(shù)據(jù)分析的能力[30]。MG-RAST[27]使用SEED子系統(tǒng)[32]對宏基因組測序數(shù)據(jù)分析，包含了公共宏基因組數(shù)據(jù)的注釋。IMG/M[28]使用多個能在微生物宏基因組深入分析時使用的參考數(shù)據(jù)庫(如IGM系統(tǒng)的基因組)以進行宏基因組測序數(shù)據(jù)的注釋。CAMERA[29]包含大規(guī)模數(shù)據(jù)庫及多種注釋工具，最近已被納入QIIME[33]。

由于宏基因組測序數(shù)據(jù)分析需要大量的計算機資源并且非常耗時，多種通過宏基因組測序數(shù)據(jù)進行微生物種群檢測或鑒定的算法或方法已被開發(fā)。GSMer是一個新的基于k-mer的方法，其利用現(xiàn)有微生物基因組特異標記(genome-specific markers，GSMS)從菌株/物種水平對原始宏基因組測序數(shù)據(jù)進行標識[34]。潛在菌株分析(latent strain analysis，LSA)可以檢測宏基因組測序數(shù)據(jù)集中的菌株并識別低豐度的菌株(相對豐度小于0.000 01%)[35]。ConStrains采用單核苷酸多態(tài)性模式，從宏基因組測序數(shù)據(jù)中識別同種細菌菌株，并重建這些物種的親緣關(guān)系[36]。這些方法的發(fā)展提供了對宏基因組測序數(shù)據(jù)的快速、高分辨分析的替代手段，進一步提高我們對微生物群落及其在環(huán)境中功能的認識。

宏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析也有與宏基因組測序數(shù)據(jù)分析類似的步驟和工具，但仍需要特殊的組裝及rRNA去除步驟及工具。宏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的組裝工具是基于de Bruijn圖形開發(fā)用于從頭組裝，例如TAG[37]，IDBA-MT[38]，Trinity[39]及Oases[40]。由于參照宏基因組碎片化，TAG有更多的轉(zhuǎn)錄組丟失風(fēng)險[37]。IDBA-MT[38]是一種從頭組裝方法，又進一步發(fā)展為IDBA-MTP[41]，通過利用已知的蛋白數(shù)據(jù)庫及相應(yīng)的核甘酸序列，來進行宏轉(zhuǎn)錄組的組裝，從而有效的組裝mRNAs。從鳥槍法宏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)去除rRNA的工具在有或沒有任何參考數(shù)據(jù)庫的情況下開發(fā)。riboPicker[42]及rRNASelector[43]都可以從宏轉(zhuǎn)錄組序列中選擇并去除rRNA，而rRNAFilter[44]可用在沒有任何參考序列的情況下去除rRNA讀長。此外，SortMeRNA可以識別mRNA和rRNA，從宏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)集中快速過濾、去除rRNA基因片段[45]。對于其他類型的RNA，例如非編碼RNA以及小分子RNA(sRNA)[46]，INFERNAL[47]能夠依靠Rfam數(shù)據(jù)庫搜索RNA結(jié)構(gòu)[48]，對已知的sRNA進行分配和進一步功能注釋，這與通過對多種數(shù)據(jù)庫進行比對的宏基因組測序數(shù)據(jù)分析類似。BioBakery是其中一種宏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析綜合流程，SAMSA[49]是近年開發(fā)的宏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)綜合分析工具。

用于擴增子、宏基因組及宏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析的生物信息學(xué)工具的發(fā)展，使我們能夠表征環(huán)境微生物，并探究它們的多樣性及其在環(huán)境中的功能作用。這樣的數(shù)據(jù)集在大小和樣本數(shù)量上不斷增加，因此需要更加快速、高效、自動、準確及強大的生物信息工具與流程，這將帶領(lǐng)環(huán)境微生物的研究進入一個新紀元。

2 環(huán)境微生物研究進展

測序技術(shù)、組學(xué)技術(shù)以及數(shù)據(jù)處理技術(shù)的發(fā)展，逐漸打破了環(huán)境微生物組研究中的技術(shù)瓶頸。在此，我們對具有代表性的生境中的微生物組研究進行了歸納總結(jié)，包括土壤(農(nóng)田、草地、森林、苔原)、水體(海洋和淡水)以及空氣微生物組。這些研究在環(huán)境微生物的多樣性、組成、功能、相互作用、進化、演替以及環(huán)境生態(tài)功能等方面均有新的突破和見解。

2.1 土壤微生物組

土壤中的微生物多樣性極高，據(jù)估計每克土壤有109個微生物[9]，隸屬104個不同的物種[50]。土壤微生物在地球化學(xué)循環(huán)過程中扮演著重要的角色[11]，同時也是生態(tài)系統(tǒng)的維護者，如維持植物生產(chǎn)力[1]、實現(xiàn)污染物的生物修復(fù)[51]等。已有研究證明生物多樣性是影響生態(tài)系統(tǒng)功能的主要因素[52-54]。但是，以往大部分的研究主要通過分析16S rRNA 和 ITS基因來研究微生物的群落結(jié)構(gòu)，而無法提供重要的功能信息。

宏基因組學(xué)方法(shotgun sequencing)則彌補上述缺陷，為我們提供微生物的功能信息。最近有研究利用宏基因組學(xué)的方法揭示了氮代謝途徑與生境類型、土壤碳、氮含量顯著相關(guān)，同時，該研究有效的將物種與功能聯(lián)系起來，指出在土壤中，一些δ-變形菌(δ-Proteobacteria)具有完整的氮代謝途徑，而參與氮循環(huán)的藍細菌(Cyanobacteria)則只含有一些特定的氮代謝的途徑[55]。本文將重點介紹近年來自農(nóng)田、草原、森林、苔原等生境中土壤微生物組研究進展，尤其是應(yīng)用了宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的研究。

2.1.1 農(nóng)田 作物相關(guān)微生物被認為是作物的第二基因組，其對農(nóng)作物的健康和產(chǎn)量有著至關(guān)重要的作用。研究表明，使用PhyloChip研究抑病土壤的微生物群落，發(fā)現(xiàn)土壤微生物中γ-變形菌(γ-Proteobacteria)通過非核糖體肽合酶介導(dǎo)的抑制真菌的代謝途徑與農(nóng)作物病害抑制率密切相關(guān)[56]。另外，有關(guān)大豆根際微生物群落分類和功能的研究表明，生境選擇(niche-based selection)主導(dǎo)了微生物群落的組成[57]。同時，通過宏轉(zhuǎn)錄組的方法研究大豆根系微生物對高濃度的CO2和O3的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)碳、氮循環(huán)中的關(guān)鍵基因的表達被高含量的CO2刺激上調(diào)，而被O3刺激下調(diào)，從而揭示了土壤微生物應(yīng)對全球氣候變化的潛在機制[58]。這些研究都表明組學(xué)方法在揭示土壤微生物在維持植物健康和應(yīng)對環(huán)境變化的研究中是一個有利的工具。

2.1.2 草地 全球約有40%的土地面積被草地所覆蓋[59]。草地在生物地球化學(xué)循環(huán)中起著重要的作用，草地土壤微生物對環(huán)境及氣候變化的響應(yīng)成為研究熱點[60-63]。英國洛桑研究所通過宏基因組分析公園草地中的土壤微生物發(fā)現(xiàn)，其功能變化受季節(jié)及垂直距離的影響異常地低。同時也發(fā)現(xiàn)，碳代謝相關(guān)基因的豐度最高，cAMP信號因子、Ton和Tol轉(zhuǎn)運系統(tǒng)等的表達量高[64]。

為了洞悉草地對全球氣候變化的相應(yīng)，研究者在加溫2 ℃長達10 年的草地土壤中，分析了微生物的宏基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)碳、氮循環(huán)的關(guān)鍵代謝途徑(如纖維所降解、反硝化等)在加溫條件下被顯著性富集[65]。另一組學(xué)研究調(diào)查了長期高含量CO2對草地土壤微生物組成及其功能的影響，研究表明高含量的CO2提高了有機物降解途徑、異化硝酸鹽還原、氮固定中關(guān)鍵基因的豐度，而谷氨酰胺合成和厭氧氨氧化途徑的關(guān)鍵基因則降低了[66]?？傊莸赝寥牢⑸锏墓δ芴匦栽谘芯坎莸厣鷳B(tài)功能及草地應(yīng)對環(huán)境變化過程中有著十分重要的指示作用。

2.1.3 森林 森林生態(tài)系統(tǒng)是復(fù)雜且差異性大的陸地生境之一，為地球碳循環(huán)和生物多樣性的維持提供了重要的生態(tài)作用[67-68]。森林土壤微生物對森林生態(tài)系統(tǒng)的地球元素循環(huán)有著重要作用[69-70]。有研究利用宏基因組學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)人為擾動對森林土壤微生物功能特性有著顯著性的影響，降低了木質(zhì)素、纖維素、半纖維素和果膠降解相關(guān)功能基因的豐度[71]。而利用宏轉(zhuǎn)錄組方法分析加氮肥對森林土壤微生物影響發(fā)現(xiàn)，氮的添加會引起碳代謝途徑中酶的過表達但不會影響群落結(jié)構(gòu)和生物量的變化[72]。此外，通過系統(tǒng)發(fā)育和功能基因的研究發(fā)現(xiàn)，重金屬污染會顯著影響森林土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，但該研究也證實了森林土壤微生物在重金屬污染壓力下的恢復(fù)性，驗證了金屬濃度與金屬抗性基因之間的關(guān)系，以此闡明了微生物功能分析的重要性[73]。利用宏基因組學(xué)研究森林土壤微生物中編碼鹵化和脫鹵酶這類特異性的功能基因表明，森林土壤微生物中涉及鹵素循環(huán)基因多樣性高，且發(fā)現(xiàn)了多種非特異性脫鹵以及協(xié)同脫鹵基因，表明了自然脫鹵的穩(wěn)健性[70]。以上研究表明，森林土壤微生物有多種多樣的已知和未知新型的功能，包括營養(yǎng)循環(huán)、生物修復(fù)和其他生態(tài)系統(tǒng)功能。

2.1.4 苔原 苔原土壤主要分布在在北極圈和高山(高山林線以上)，是一類沒有樹木生長的生境[74]。其土壤層作為永久凍土帶，儲存了含量巨大的碳元素[75]。由于氣候變暖以及凍土解凍，逐漸升高的地表溫度影響著微生物的活性和相關(guān)的地球元素循環(huán)[76-78]。最近，越來越多的宏基因組學(xué)研究手段應(yīng)用于苔原微生物組學(xué)的研究。例如，對短時(1周)凍土解凍的苔原土壤微生物進行的深度測序，研究表明碳氮循環(huán)相關(guān)基因，尤其是涉及甲烷代謝的相關(guān)基因發(fā)生了快速的響應(yīng)[79]。而且，多組學(xué)研究手段包含16S rRNA擴增子測序，宏基因組以及宏轉(zhuǎn)錄組測序被用于分析不同凍土(完整的凍土，季節(jié)融化的活性層，和熱融沼澤)的微生物組，檢測其分類組成、功能活性的變化，結(jié)果展示了不同代謝(在沼澤中甲烷合成)速率和代謝相關(guān)的組學(xué)數(shù)據(jù)良好的相關(guān)性，而在凍融活性層則發(fā)現(xiàn)了大量的冷激蛋白以及趨化、運動相關(guān)的蛋白的基因[80]。這些有關(guān)苔原的研究闡明了凍土微生物組對全球氣候變化的快速響應(yīng)，但也表明不同的功能微生物菌群在不同的時間和空間上響應(yīng)均有差異。因此，以上的研究有助于我們預(yù)測未來全球變暖對苔原生態(tài)功能的影響。

2.2 水體微生物組

微生物廣泛分布于各類水環(huán)境，并在生物地球化學(xué)過程中扮演著重要的角色，包括水生生態(tài)系統(tǒng)的營養(yǎng)循環(huán)和能量流動[81]。水體生態(tài)系統(tǒng)中的浮游細菌是地球上最廣泛分布的一類微生物[82]，如1mL表層海水中包含了104～106個細菌[83]，全球海洋中的浮游細菌總數(shù)> 3.1×1028[82]。它們不僅在表層水中比較常見，而且在深海海底也有廣泛的分布[84]，被認為是海洋C、N和S循環(huán)的引擎[85]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)這些生物地球化學(xué)過程是由環(huán)境中所有的成員(即群落)發(fā)生復(fù)雜交互作用引起的，而非由特定的某些物種引起[86]。因此，在群落水平上研究水體微生物群落是非常必要的，這樣我們才可以對生態(tài)系統(tǒng)功能有一個比較全面的認識。

2.2.1 海洋 有研究提出海洋微生物的種類是無處不在的[87-88]，但是近來越來越多的研究認為浮游微生物群落的分布主要基于生態(tài)位過程的影響，如發(fā)現(xiàn)某些物種只分布在一些特定的區(qū)域[89-90]。此外，海洋中的細菌群落可反復(fù)出現(xiàn)特定的格局表明微生物群落和組成能夠通過環(huán)境參數(shù)來進行預(yù)測[91]。有些環(huán)境因子，如鹽度[92]、溫度[93]能夠顯著影響浮游細菌的組成。值得一提的是，最近發(fā)現(xiàn)海洋生態(tài)系統(tǒng)中浮游細菌在長時間尺度會隨環(huán)境的周期性改變而重復(fù)演替[94-95]。

雖然仍有不足，但是近期已經(jīng)使用宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細胞測序等技術(shù)證明海洋微生物群落的功能特征。例如，基于單細胞基因組學(xué)對來自海洋“微生物暗物質(zhì)”的201株野生古細和細菌進行的單細胞測序，揭露出野生古菌和細菌細胞令人意想不到的代謝特征[96-97]。利用宏基因組技術(shù)檢測紅海微生物群落的過量表達(over-representation)基因表明海洋微生物群落能獲得特定的環(huán)境適應(yīng)性[98]。對采自Tara海243個樣品的宏基因組測序數(shù)據(jù)分析顯示， 73%以上的海洋微生物與人類消化道菌群具有同樣的功能[99]。一項最近針對紅海微生物的宏基因組研究表明，只有功能協(xié)變模式不會隨著環(huán)境梯度的改變而改變，但是大多數(shù)的變化都是由溫度的改變導(dǎo)致的[100]。

2.2.2 淡水 淡水通常被定義為溶解鹽小于1 000 mg/L的天然水體[101]，包括湖水、河水和地下水等。單細胞基因組學(xué)和宏基因組學(xué)測序分析顯示，淡水湖泊中好氧的化能自養(yǎng)菌比以前的預(yù)測更加普遍[102]。這些研究也為種群間的基因遷移和視紫紅質(zhì)基因重組提供了證據(jù)。宏基因組測序發(fā)現(xiàn)已知同源物微囊藻毒素-降解基因并沒有過多表達，但是生物異源物質(zhì)代謝的基因在微囊藻毒素-修正微生態(tài)中過量表達[103]，表明異生基因在微囊藻毒素降解中非常重要。

宏基因組測序和基于功能推理的方法發(fā)現(xiàn)“核心功能特性(core functional traits)”在密西西比河中是保守的[104]。利用宏基因組和轉(zhuǎn)錄組對哥倫比亞河不同鹽度的水樣品進行測序發(fā)現(xiàn)，宏基因組中的功能基因表達譜是非常類似的，但是與轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的基因表達譜隨著河水鹽度梯度的變化而高度變異[105]。在時間尺度上，通過對河水微生物群落的研究，發(fā)現(xiàn)在水質(zhì)不好的環(huán)境中營養(yǎng)代謝菌和噬菌體大量存在，主要是因為農(nóng)田徑流增加[106]。在空間上，涉及N循環(huán)的大量功能基因被檢測到沿著河流有明顯的變化[107]。

地下水是另一種重要的淡水資源，受到了人類活動的威脅，包括工業(yè)副產(chǎn)物、農(nóng)業(yè)徑流和人類/動物糞便的污染[108]。近年來淡水微生物群落受環(huán)境擾動的響應(yīng)逐漸成為研究的熱點[108-110]宏基因組的比較分析表明受到污染的淡水微生物群落比未受污染的淡水微生物群落更脆弱，功能也衰退，從而營養(yǎng)循環(huán)和適應(yīng)性減弱[108]。Hemme等[111]還發(fā)現(xiàn)淡水微生物群落在進化過程中受到重金屬污染時會發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移。

2.3 大氣微生物組

大氣環(huán)境中的微生物在物種多樣性及豐度(如25.6～124.4 cfu /m3)[112]上都遠低于土壤及水環(huán)境。但大氣微生物組不僅對大氣過程有顯著影響，而且對大氣物理、化學(xué)及氣候變化等都具有重要作用[113]。此外，大氣微生物組對人類健康、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性也極其重要[114]。然而，目前對于大氣微生物組的研究還處于起步階段，主要集中在對于室內(nèi)空氣微生物的研究方面[115]。

截至目前，關(guān)于大氣微生物的研究主要是針對住所、辦公區(qū)、教室、醫(yī)院、公共休息室、博物館和地鐵等環(huán)境的調(diào)查。通常，建筑內(nèi)部的空氣微生物主要來自人類、寵物、植物、城市管道系統(tǒng)、供暖/通風(fēng)/空調(diào)系統(tǒng)、霉菌和灰塵重懸浮以及室外空氣[116]。盡管微生物組成隨著地理位置、季節(jié)、用途和樣品基質(zhì)(是否接近表面)發(fā)生改變，但是這些建筑環(huán)境中豐度最高的通常是變形菌門、厚壁菌門和放線菌門[115]。將建筑周圍空氣中的微生物組與居住者攜帶的微生物組進行對比分析，發(fā)現(xiàn)建筑周圍的空氣是建筑環(huán)境中微生物組的主要來源，而居住者皮膚攜帶的微生物組也是重要來源但其貢獻相對較小。

然而空氣流通、潮濕以及其他因素也可能對大氣微生物組產(chǎn)生重要影響，但很少有研究系統(tǒng)探討這些機制對微生物多樣性、組成及功能的影響。因此，需要開展相關(guān)工作，以評價這些機制在大氣環(huán)境中微生物組形成中的重要性。而大氣環(huán)境微生物組如何影響人類健康則是另一個值得關(guān)注的科學(xué)問題。盡管有許多研究對空氣環(huán)境中微生物的16S rRNA基因進行了測序分析，但關(guān)于大氣環(huán)境中微生物功能和活性的信息卻很少，導(dǎo)致我們很難評估建筑周圍空氣中微生物對人類健康的潛在影響。近期，一種針對宏基因組測序的大氣微生物DNA提取方法被開發(fā)出來，在一定程度上緩解了大氣環(huán)境微生物的生物量過低導(dǎo)致研究難以開展的問題[117]。

3 展 望

多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，如DNA和RNA測序技術(shù)、蛋白和代謝譜分析、功能基因矩陣等提高了我們分析環(huán)境微生物的能力。隨著計算工具、統(tǒng)計和建模手段的發(fā)展，研究人員在過去10年取得了前文所述各項重要進展。然而，大部分研究都集中在不同地點環(huán)境微生物組的生物多樣性，及其對環(huán)境波動(特別是全球變化和環(huán)境污染)和時空變化的響應(yīng)方面，但很少有針對環(huán)境微生物組的功能、代謝活性、相互作用、進化和潛在機制的研究。未來我們在解決微生物生態(tài)學(xué)和環(huán)境科學(xué)方面的實際問題時必須重視以下6個方面的研究內(nèi)容：① 微生物組在環(huán)境中的功能是什么？② 環(huán)境微生物多樣性及功能的形成和維持的機制是什么？③ 微生物群落中的各微生物如何相互作用？④ 關(guān)鍵微生物、優(yōu)勢和稀有物種在生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和生產(chǎn)力中扮演怎樣的角色？⑤ 微生物組、環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)之間如何相互關(guān)聯(lián)？⑥ 如何通過微生物數(shù)據(jù)預(yù)測生態(tài)系統(tǒng)功能？盡管當代的測序技術(shù)和相關(guān)的生物信息工具已極大地提高了我們對環(huán)境微生物組的認識能力，但相關(guān)的技術(shù)挑戰(zhàn)仍然存在，包括測序手段的進一步發(fā)展、更高效的計算和分析軟件、更全面的環(huán)境基因和基因組數(shù)據(jù)庫以及環(huán)境微生物研究者更多的跨學(xué)科訓(xùn)練。

4 結(jié) 論

高通量測序和其他組學(xué)技術(shù)不斷革新了我們認識各種生境如土壤、沉積物、水及空氣中微生物的多樣性、組成、功能、相互作用、進化和演替的能力。在過去10年間，這些研究為我們了解環(huán)境微生物組提供了新的見解。首先，我們對微生物多樣性的認識得到了加強；其次，新的微生物基因、基因組、微生物群體和通路的發(fā)現(xiàn)拓展了我們對環(huán)境中微生物功能的認識。此外，科學(xué)家也開始通過宏轉(zhuǎn)錄組和宏蛋白組分析研究原位微生物群落的活性。不僅如此，也有研究在微生物生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了宏觀生態(tài)學(xué)中的一些時空變化規(guī)律，這能促使我們?nèi)ヌ剿魃锵到y(tǒng)中的普遍規(guī)律。通過上述的研究手段，我們將宏觀生態(tài)學(xué)及環(huán)境科學(xué)的實驗策略、理論和假說應(yīng)用于環(huán)境微生物組研究。最后，研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境微生物組對導(dǎo)致微生物群落形成和調(diào)控其功能的全球環(huán)境變化十分敏感，相應(yīng)地，環(huán)境微生物也可能對生態(tài)系統(tǒng)功能產(chǎn)生反饋。

然而，我們在對環(huán)境微生物組的功能和機制，以及它們與環(huán)境驅(qū)動力和生態(tài)系統(tǒng)功能的相關(guān)性的理解上仍然面臨許多挑戰(zhàn)。因此，未來環(huán)境微生物組研究的方向?qū)⒓杏冢孩?開發(fā)新的測序方法和策略以及更高效的微生物組信息分析工具；② 探討不同生境中微生物功能和活性的機制；③ 了解關(guān)鍵微生物、優(yōu)勢和稀有物種在生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和生產(chǎn)力中的作用；④ 理解微生物之間以及微生物和宿主間的相互作用；⑤ 通過新的分離方法和單細胞基因組學(xué)技術(shù)獲得更多的參考基因組用于以基因組為核心的研究；⑥ 利用微生物數(shù)據(jù)增強對生態(tài)系統(tǒng)功能的預(yù)測能力；⑦ 通過合成生物學(xué)和系統(tǒng)微生物學(xué)方法構(gòu)建理想的功能微生物組；⑧ 利用基因工程微生物提高環(huán)境健康。

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Progressesinenvironmentalmicrobiomediversityandfunctionresearch

WUBo1,FENGKai2,3,ZHIXiaoyang4,HEQiang1,5,XUMeiying6,DENGYe2,XIAOFanshu1,WANGShanquan1,YULing1,LUQihong1,LIANYingli1,LUOLijuan7,YUANKe8,CHENBaowei8,YANQingyun1,QIURongliang1,LUANTiangang7,HEZhili1,9

(1. Environmental Microbiome Research Center and the School of Environmental Science and Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China; 2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China; 3.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4.Yunnan Institute of Microbiology, School of Life Science, Yunnan University, Kunming 650091, China; 5.Department of Civil and Environmental Engineering, The University of Tennessee, Knoxville, TN, 37996 ,USA; 6.Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China;7.School of Marine Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China;8.School of Life Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China;9. Institute for Environmental Genomics, University of Oklahoma, Norman, OK, 73019, USA)

Currently developed sequencing and other high throughput technologies enable us to explore the role of microorganisms in the environment. Here environmental microbiome is defined as the collection of microbial genomes in a particular environment, and the environmental microbiome research (or environmental microbiomics) aims to understand the biodiversity, composition, structure, function, interaction, evolution and dynamics of microbial communities as well as their linkages with environmental drivers and ecosystem functioning. This review is focused on environmental microbiomes from soil, water and air. Firstly, the current advanced sequencing technologies and associated tools for environmental microbiome data analysis are reviewed, then the current research progress in environmental microbiomes were summarized with foci on addressing key scientific questions in microbial ecology and environmental science. This review proposes key scientific questions, and highlights the importance of our understanding of microbial functions and underlying mechanisms in future environmental microbiome studies.

environmental microbiomes; microbial function; metagenome sequencing; bioinformatics tools

X172

A

0529-6579(2017)05-0001-11

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.05.001

2017-07-18

中山大學(xué)千人計劃項目(38000-18821105)；中山大學(xué)百人計劃項目(38000-18821107)

吳波(1986年生)，女；研究方向微生物生態(tài)；E-mail: wubo28@mail.sysu.edu.cn 馮凱(1992年生)，男；研究方向微生物生態(tài)和生物信息；E-mail: kaifeng_st@rcees.ac.cn(以上2人并列第1作者)

賀志理(1965年生)，男;研究方向：微生物組學(xué)；E-mail: hezhili@mail.sysu.edu.cn