劉思雨，杜廣祖，戶艷霞，王新中，肖關(guān)麗*，陳 斌*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南省煙草公司大理州煙草公司，云南大理 671000)

暗黑鰓金龜幼蟲生防黃綠綠僵菌Ma130821菌株的室內(nèi)培養(yǎng)條件的研究

劉思雨1*，杜廣祖1*，戶艷霞2，王新中2，肖關(guān)麗1**，陳 斌1**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南省煙草公司大理州煙草公司，云南大理 671000)

從云南省玉溪市塔甸鎮(zhèn)玉米地自然罹病的暗黑鰓金龜幼蟲僵蟲上分離純化獲得了黃綠綠僵菌Ma130821，為了弄清該菌株培養(yǎng)條件，為蠐螬生物制劑開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)，本研究在室內(nèi)測定了該菌株在PDA和SDAY培養(yǎng)基上的生長繁殖情況及在不同pH、溫度、光照條件下培養(yǎng)特征及產(chǎn)孢特性。結(jié)果表明：黃綠綠僵菌Ma130821菌株在PDA和SDAY兩種培養(yǎng)基上均能生長，但在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢時間早于SDAY，其中在PDA和SDAY培養(yǎng)基上分別于第6天和9天開始產(chǎn)孢。在25℃時生長最好，平均直徑日增量為0.24 cm/d，第4天時就開始產(chǎn)孢且產(chǎn)孢量最高，為1.091×107孢子/cm2。在16 L ∶8 D的光周期條件下菌落生長最快，產(chǎn)孢時間最早，且產(chǎn)孢量最大。pH 6.5最適宜該黃綠綠僵菌菌株的生長及產(chǎn)孢。綜合以上結(jié)果，PDA培養(yǎng)基可用于黃綠綠僵菌Ma130821菌株的室內(nèi)培養(yǎng)，最適培養(yǎng)條件為pH 6.5、25℃、16 L ∶8 D。該研究結(jié)果將為蠐螬生防黃綠綠僵菌Ma130821制劑的開發(fā)提供依據(jù)。

黃綠綠僵菌；培養(yǎng)條件；菌落生長；產(chǎn)孢時間；產(chǎn)孢量

蠐螬是鞘翅目金龜甲總科幼蟲的總稱，種類多、生活周期長、食性雜、分布廣、危害隱蔽，防治困難，是農(nóng)林作物和植物重要的地下害蟲(張芝利，1984)。近年來，隨著種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整、作物布局的改變，蠐螬的發(fā)生危害日趨嚴(yán)重。長期以來應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥防治蠐螬，雖然也降低了蟲量與為害率，但農(nóng)藥殘留不僅易使蠐螬產(chǎn)生抗藥性，而且會造成水土環(huán)境污染，農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留(姚慶學(xué)等，2003)。由此，利用微生物防治蠐螬已成為綠色植保及生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要途徑(林華峰等，2006)。目前，白僵菌(李蘭珍和宋友發(fā)，1998；趙文琴等，2005；林華峰等，2006)和綠僵菌(陳祝安等，1995；陳斌等，2003；林華峰等，2006；程輝彩等，2007；陳斌等，2010；申劍飛等，2012)對蠐螬的室內(nèi)毒力及田間應(yīng)用試驗都已有一些研究報道。

黃綠綠僵菌Metarhiziumflavoviride屬半知菌類叢梗菌目叢梗霉科綠僵菌屬，在田間自然條件下能侵染褐飛虱(Rombachetal., 1986)、水稻二化螟ChilosuppressalisWalk(劉愛英，1990)、蝗蟲(Thomasetal., 1996)，對馬鈴薯葉甲也具有良好的毒力(郭艷瓊和李友蓮，2007)，主要用于蝗蟲的防治(Thomasetal., 1996; Milner, 1997)。而對于侵染蠐螬的黃綠綠僵菌菌株及其應(yīng)用的系統(tǒng)研究還未見有報道。

綠僵菌菌株具有一定的地理特異性及寄主?；裕煌乩憝h(huán)境、不同寄主來源的綠僵菌菌株在菌落形態(tài)、營養(yǎng)需求、寄主專一性等方面存在明顯差異(孫家寶等，2007；Ansari etal., 2009；蘇宇等，2010)。因此，篩選適合蟲生真菌菌株生長、繁殖的條件是害蟲生防優(yōu)良綠僵菌菌株篩選及開展害蟲生物防治的基礎(chǔ)。本研究以自然條件下在玉米田蠐螬種群中發(fā)生流行很強(qiáng)的一株綠僵菌為研究對象，通過對其菌落生長狀況、培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基種類、pH值、溫度、光照)等生物學(xué)特性的研究，篩選出對其菌落生長及產(chǎn)孢最佳的培養(yǎng)基種類、pH值、溫度、光照等條件，為利用該菌株生物防治蠐螬提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從云南省玉溪市峨山縣塔甸鎮(zhèn)(24°14′34.66″N，102°12′40.75″E，海拔1796 m)玉米田采集罹病暗黑鰓金龜HolotrichiaparallelaMotschulsky幼蟲，在室內(nèi)用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，純化后在4℃冰箱中保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

薩氏葡萄糖瓊脂酵母浸膏(SDAY)培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉10 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1000 mL(蒲蟄龍和李增智，1996)。PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯塊200 g煮汁過濾，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL(蒲蟄龍和李增智，1996)。

1.3 試驗方法

1.3.1培養(yǎng)基對Ma130821菌株生長與產(chǎn)孢的影響

選擇SDAY和PDA培養(yǎng)基，將菌株采用點接法分別接種至2種培養(yǎng)基(90 mm)中央，每個處理重復(fù)3次。然后放入25±1℃的光照培養(yǎng)箱中，黑暗條件下培養(yǎng)，每天觀察菌落直徑，從第4天開始測量，直至產(chǎn)孢結(jié)束。

產(chǎn)孢量的測定。用直徑6 mm的打孔器從每一菌落的中心點至邊緣距離的1/2處打孔截取小菌塊，每皿5個重復(fù)。然后放入含0.05%吐溫-80、20 mL無菌水的三角瓶中，磁力攪拌10 min，打散孢子團(tuán)，獲孢子懸浮液。用微量移取器從三角瓶吸取孢子懸浮液，滴在血球計數(shù)板上，以10倍進(jìn)行稀釋至血球計數(shù)板可數(shù)為止，在顯微鏡下觀察計數(shù)，計算每種培養(yǎng)基上單個菌落的平均產(chǎn)孢量，選擇生長狀況最好的培養(yǎng)基進(jìn)行下面的實驗(楊新軍等，2007)。

1.3.2溫度對Ma130821菌株生長及產(chǎn)孢的影響

選取1.3.1中篩選的最適培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至50℃左右，將每個處理所需的15 mL培養(yǎng)基倒于直徑90 mm滅菌培養(yǎng)皿中，分別在5、10、15、20、25和30℃條件下培養(yǎng)，每個處理重復(fù)3次。

用少量含0.5 mL/L吐溫-80的無菌水洗下斜面綠僵菌分生孢子，放入盛有200 mL無菌水的帶玻璃珠的三角瓶中，振蕩，打散孢子團(tuán)塊。無菌下用微量移取器從三角瓶吸取孢子懸浮液滴于上述已標(biāo)記的平板中央，將平板靜20 min后，倒置，然后放入上述不同溫度的光照培養(yǎng)箱中，不開啟光照燈，黑暗自然培養(yǎng)，每天觀察，從第4天開始進(jìn)行測量菌落直徑，直至產(chǎn)孢結(jié)束，測量方法同1.3.1。菌落生長至孢子變綠后，進(jìn)行孢子計數(shù)，方法同1.3.1，篩選選出最適溫度。

1.3.3光照對Ma130821菌株生長及產(chǎn)孢的影響

采用1.3.2中篩選出的最佳溫度進(jìn)行實驗。分別將光照培養(yǎng)箱的光照時間設(shè)置為L ∶D=24 ∶0、L ∶D=16 ∶8、L ∶D=12 ∶12、L ∶D=8 ∶16、L ∶D=0 ∶24共5個光周期處理(侯穎等，2015)，每個處理3次重復(fù)。接種方法同1.3.2。每天觀察，第4天開始測量菌落直徑，測量方法同1.3.1，直至產(chǎn)孢結(jié)束。菌落長到第12天，菌落表面的分生孢子變?yōu)榫G后，進(jìn)行孢子計數(shù)，方法同1.3.1，確定最佳光照時間。

1.3.4pH值對Ma130821菌株生長及產(chǎn)孢的影響

選取最適培養(yǎng)基，滅菌前用10%HCl溶液和10%NaOH溶液將培養(yǎng)基調(diào)成4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的pH值(殷幼平等，2010)。將滅菌的不同pH的培養(yǎng)基約15 mL分別倒于直徑90 mm的滅菌培養(yǎng)皿中，置于25℃條件下培養(yǎng)，每個處理重復(fù)5次。接種方法同1.3.2。每天觀察，第4天進(jìn)行測量菌落直徑，測量方法同1.3.1，直至產(chǎn)孢結(jié)束。菌落長到第12天，孢子變?yōu)榫G色后，計數(shù)孢子數(shù)量，方法同1.3.1，篩選最適pH。

1.3.5數(shù)據(jù)處理

菌落直徑=(菌落橫徑+菌落縱徑)/2；菌落直徑日增長量(cm/d)=平均菌落直徑/培養(yǎng)天數(shù)；每cm2菌落含孢量=平均每小格孢子數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)/(3.14×0.32)(王萍莉，2006)；每mL孢子總量=80小格內(nèi)孢子總數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)。

實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理、分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對Ma130821菌株生長及產(chǎn)孢的影響

菌落生長結(jié)果表明，黃綠綠僵菌Ma130821在PDA和SDAY兩種培養(yǎng)基上均能生長，菌落平均直徑日增量分別為0.21和0.20 cm/d，二者間無明顯差異(F=0.13，P>0.05)；在兩種培養(yǎng)基上培養(yǎng)至第12天時菌落直徑分別為2.45和2.26 cm，二者間無明顯差異(F=0.11，P>0.05)(圖1)。

圖1 黃綠綠僵菌Ma130821菌株在2種培養(yǎng)基上的菌落直徑變化(cm)Fig.1 The diameter change of colony of Ma130821 on two culture mediums

從產(chǎn)孢時序來看，黃綠綠僵菌Ma130821菌株在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢時間早于SDAY上，其中在PDA和SDAY培養(yǎng)基上分別于第6天和9天開始產(chǎn)孢，在PDA培養(yǎng)基上的最初產(chǎn)孢時間明顯短于在SDAY培養(yǎng)基(F=8.57，P<0.05)。

從產(chǎn)孢量來看，黃綠綠僵菌Ma130821菌株在PDA和SDAY培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量間無明顯差異(F=2.38，P>0.05)，分別為1.49×106孢子/cm2和1.12×106孢子/cm2。

2.2 黃綠綠僵菌Ma130821菌株在不同溫度下的生長及產(chǎn)孢特性

黃綠綠僵菌Ma130821菌株在15℃-30℃內(nèi)均能生長(圖2)，但在不同溫度下菌落生長速率不同，且隨溫度的升高而增加，在30℃條件下菌落生長速率降低。在20℃-25℃條件下的菌落直徑增長速率明顯高于其它溫度范圍，其中在25℃時生長最好，平均直徑日增量為0.24 cm/d，第12天時菌落直徑達(dá)2.63 cm，顯著高于其他溫度下的菌落直徑。其次為20℃，平均直徑日增量為0.18 cm/d，第12天時菌落直徑達(dá)2.37 cm；而>25℃或≤15℃時生長較慢，30℃下綠僵菌孢子前期生長較15℃快，菌落直徑顯著大于15℃下的直徑，而到培養(yǎng)后期以15℃下增長較快，<10℃時菌株則停止生長。

圖2 黃綠綠僵菌Ma130821菌株在不同溫度下的菌落直徑變化(cm)Fig.2 The colony diameter change of Ma130821 under the different temperatures

從黃綠綠僵菌Ma130821菌株在不同溫度下的產(chǎn)孢時序(表1)來看，在15℃、20℃、25℃、30℃下該菌株均能產(chǎn)孢。其中25℃為菌株最佳產(chǎn)孢溫度，其產(chǎn)孢時間最早，第4天時就開始產(chǎn)孢且產(chǎn)孢量最高，為1.091×107孢子/cm2，顯著高于其他溫度下的產(chǎn)孢量；其次為20℃，從第5天開始產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量達(dá)4.60×106孢子/cm2，也顯著高于15、30℃下的產(chǎn)孢量；當(dāng)溫度≤15℃或>25℃時初始產(chǎn)孢時間較晚、產(chǎn)孢量較少，分別從第8天和第10天才開始產(chǎn)孢，較最早產(chǎn)孢時間晚6-8 d，產(chǎn)孢量分別為1.47×106孢子/cm2和1.87×106孢子/cm2，兩者差異不顯著(F=0.4820，P>0.05)；在≤10℃條件下，菌株無明顯的生長和產(chǎn)孢。因此，該菌株的生長最適溫度為25℃。

2.3 光照對黃綠綠僵菌Ma130821菌株菌落生長及產(chǎn)孢的影響

黃綠綠僵菌Ma130821菌株在8 L ∶16 D、12 L ∶12 D、16 L ∶8 D和24 L ∶0 D的光周期下均能生長(圖3)，但在不同光周期下菌株的生長速率不同。在24 L ∶0 D、16 L ∶8 D和12 L ∶12 D三種光周期條件下的生長速率較高于其它光周期，其中以16 L ∶8 D光照下的菌落直徑最大，第12天時菌落直徑達(dá)2.75 cm，平均直徑日增量為0.24 cm/d；其次為24 h光照，菌落直徑達(dá)2.50 cm，平均直徑日增量為0.24 cm/d；12 L ∶12 D光周期下的菌落直徑達(dá)2.47 cm，平均直徑日增量為0.24 cm/d。以上三種光周期下的生長速率均顯著高于其他光周期下的菌落生長，但三者間無明顯差異(F=0.13，P>0.05)。

從不同光周期下Ma130821菌株的產(chǎn)孢特征(表2)可以看出：菌落在16 L ∶8 D、12 L ∶12 D、8 L ∶16 D光周期及全黑暗、全光照環(huán)境下均能產(chǎn)孢，但初始產(chǎn)孢時間和產(chǎn)孢量不同：16 L ∶8 D下產(chǎn)孢時間最早，而且產(chǎn)孢量最高達(dá)1.003×107孢子/cm2。其次為12 L ∶12 D光周期，在該條件下于第3天開始產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量達(dá)9.02×106孢子/cm2；L ∶D=24 h ∶0 h下從第4天開始產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量達(dá)7.84×106個/cm2，均極顯著高于8 L ∶16 D的產(chǎn)孢量，但三者間無明顯差異。8 L ∶16 D與L ∶D=0 h ∶24 h條件下產(chǎn)孢較快，但產(chǎn)孢量少，兩者間無差異(F=0.8120，P>0.05)。

表1 黃綠綠僵菌Ma130821菌株在不同溫度下的生長情況

注：數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，數(shù)據(jù)后的小寫字母表示差異達(dá)5%顯著水平，大寫字母表示差異達(dá)1%顯著水平。Note: Data are mean±SE. Data followed by different lower case letters indicate significant difference at 0.05 level and different upper case letters indicate significant difference at 0.01 level.

圖3 黃綠綠僵菌Ma130821菌株在不同光周期下的菌落直徑(cm)Fig.3 The diameter of colony of Ma130821 under the different photoperiods

表2 黃綠綠僵菌Ma130821菌株在不同光周期下的生長情況

注：數(shù)據(jù)表示方法同表1。Note: The representations of data were similar to table 1.

根據(jù)以上結(jié)果，黃綠綠僵菌Ma130821在16 L ∶8 D的光周期條件下菌落生長最快，產(chǎn)孢時間最早，且產(chǎn)孢量最大。由此表明，黃綠綠僵菌Ma130821菌落生長與產(chǎn)孢的最佳光周期為16 L ∶8 D。

2.4 pH值對黃綠綠僵菌Ma130821菌株生長及產(chǎn)孢的影響

黃綠綠僵菌Ma130821菌株在pH值4.5-7.0的培養(yǎng)基上均可生長(圖4)，但在pH值為6.0-7.0時，菌落生長較好，接種后培養(yǎng)到第8天時pH 6.5培養(yǎng)基上的菌落直徑顯著高于其他pH下的菌落直徑，但從第9天開始，菌落生長速率開始降低。pH 7.0時菌落直徑日增長量較大，菌落直徑也最大，但與其他pH下的菌落直徑間無明顯差異。從整個培養(yǎng)過程來看，該菌株以pH 6.5和pH 7.0時菌落平均直徑日增量分別為0.23 cm/d和0.22 cm/d，而在pH 4.5時菌落生長較為緩慢，平均直徑日增量僅為0.19 cm/d。

圖4 黃綠綠僵菌Ma130821菌株在不同pH下的菌落直徑(cm)Fig.4 The diameter of the colony of Ma130821 at different pHs

黃綠綠僵菌Ma130821菌株在不同pH下的產(chǎn)孢時序結(jié)果表明(表3)，pH 4.5-7.0均能產(chǎn)生分生孢子，在pH 6.5條件下產(chǎn)孢最早，第2天開始產(chǎn)孢；其次是在pH 6.0下從第3天開始產(chǎn)孢；pH 5.5和pH 7.0下，均從第4天開始產(chǎn)孢；pH 4.5下產(chǎn)孢時間最晚，第6天才開始產(chǎn)孢。從產(chǎn)孢量來看，黃綠綠僵菌Ma130821菌株在pH 6.5條件下產(chǎn)孢量最高，為8.67×106孢子/cm2；其次為pH 7.0，產(chǎn)孢量為7.90×106孢子/cm2；pH 6.0條件下產(chǎn)孢量為6.96×106孢子/cm2，但pH 6.0-7.0下的產(chǎn)孢量間無明顯差異；pH 4.5下產(chǎn)孢量最少，僅為2.77×106孢子/cm2。

表3 黃綠綠僵菌Ma130821菌株在不同pH下的生長情況

注：數(shù)據(jù)表示方法同表1。Note: The representations of data were similar to table 1.

由此表明，pH值對黃綠綠僵菌Ma130821菌落的生長具有明顯的影響，其中pH 6.5最適宜該黃綠綠僵菌菌株的生長及產(chǎn)孢。

3 結(jié)論與討論

蟲生真菌常用來分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基主要有PDA和SDAY培養(yǎng)基，本研究中分離自蠐螬的黃綠綠僵菌Ma130821在PDA上除產(chǎn)孢時間較早外，生長速率、產(chǎn)孢量與在SDAY培養(yǎng)基上均無顯明差異。李佳穎等(2013)研究發(fā)現(xiàn)分離自土壤樣品的黃綠綠僵菌菌株SM076在PDA培養(yǎng)基上生長速度、產(chǎn)孢量均顯著高于SDAY培養(yǎng)基。而張松影等(2011)研究發(fā)現(xiàn)從罹病褐飛虱蟲體上新分離出的一種黃綠綠僵菌菌株MetarhiziumflavovirideMf82菌株在SDAY培養(yǎng)基上生長最快，菌落增長率最大，產(chǎn)孢量也最大(張松影等，2011)，但在PDA培養(yǎng)基上菌落直徑增長緩慢、產(chǎn)孢量小，不適合Mf82菌株生長與繁殖。造成這種差異的原因可能是由于菌株寄主來源的差異，但還有待于進(jìn)一步研究。

溫度、光照及培養(yǎng)基pH是影響蟲生真菌菌株生長、產(chǎn)孢時間和產(chǎn)孢量的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，黃綠綠僵菌菌株Ma130821生長最適溫度為25℃，最適pH 6.0，與張松影等(2011)發(fā)現(xiàn)分離自褐飛虱Nilaparvatalugens的黃綠綠僵菌mf82菌株的生長最適溫度條件相同，但與李佳穎等(2013)發(fā)現(xiàn)的分離自華南地區(qū)土壤樣品中的黃綠綠僵菌SM076菌株生長繁殖最適溫度條件不同。此外，從光照條件來看，本研究中該菌株Ma130821生長最適的光照條件為16 L ∶8 D，這與張松影等(2011)報道的mf82菌株的光照條件不同，究其原因可能與地理來源及寄主來源有關(guān)，但具體原因還有待進(jìn)一步研究。

綠僵菌作為一種傳統(tǒng)的蟲生真菌，在害蟲種群的自然控制中具有重要作用(蒲蟄龍和李增智，1996)，黃綠綠僵菌在蝗蟲的生物防治中發(fā)揮了重要作用(Thomasetal., 1996; Lomeretal., 1997; Milner, 1997)。本研究中發(fā)現(xiàn)的菌株分離自玉米田暗黑鰓金龜幼蟲，在玉米田暗黑鰓金龜幼蟲種群中具有很強(qiáng)的流行性，且對培養(yǎng)條件的要求不是很苛刻，因此對暗黑鰓金龜生防制劑的開發(fā)具有良好潛力。黃綠綠僵菌的生長和生殖不僅受到環(huán)境溫度的影響，而且還需要一定的營養(yǎng)物質(zhì)。其中碳水化合物、氮素和礦物質(zhì)作為黃綠綠僵菌生長發(fā)育的主要營養(yǎng)物質(zhì)，Jenkins等(1994)研究發(fā)現(xiàn)分離自Acridoidae hosts的幾株黃綠綠僵菌的產(chǎn)孢受碳源(蔗糖)和氮源(酵母膏)的影響較大，發(fā)現(xiàn)適合的配方為蛋白胨5 g、蔗糖30 g、馬鈴薯200 g、瓊脂20 g和水1000 mL。而李佳穎等(2013)研究發(fā)現(xiàn)分離自華南地區(qū)土壤的黃綠綠僵菌SM076菌株以淀粉作為碳源的PDA培養(yǎng)基上生長最快、產(chǎn)孢量最高。本研究尚未對碳源及氮源對該黃綠綠僵菌菌株生長繁殖及產(chǎn)孢的影響進(jìn)行研究，為了對該菌株進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用，這也將是下一步值得深入研究的內(nèi)容。

References)

Ansari MA, Evans M, Butt TM. Identification of pathogenic strains of entomopathogenic nematodes and fungi for wireworm control [J].CropProtection, 2009, 28 (3): 269-272.

Chen B, Li ZY, Gui FR,etal. Potential evaluation of biological control aboutMetarhiziumanisopliaestrain and its virulence againstPolyphyllalaticollalaticollisLewis in potato field [J].YunnanAgriculturalScienceandTechnology, 2003, S1: 147-150. [陳斌, 李正躍, 桂富榮, 等. 金龜子綠僵菌對馬鈴薯田小云斑鰓金龜子的生物防治潛力評價[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技, 2003, S1: 147-150]

Chen B, Li ZY, He SQ. Virulence ofMetarihizumanisopliaestrain KMa0107 against three white grub [J].ChineseJournalofBiologicalControl, 2010, 26 (1): 18-23. [陳斌, 李正躍, 和淑琪. 金龜子綠僵菌KMa0107菌株對三種瑪絹金龜幼蟲的致病力[J]. 中國生物防治學(xué)報, 2010, 26 (1): 18-23]

Chen ZA, Xie PH, Huang JR,etal. Infectivity ofMetarhiziumanisopliaeagainst the mulberry brown chaferHolotrichiaparallela[J].ChineseJournalofBiologicalControl, 1995, 11 (2): 54-55. [陳祝安, 謝佩華, 黃基榮, 等. 綠僵菌對暗黑金龜蠐螬的室內(nèi)致病力測定[J]. 中國生物防治學(xué)報, 1995, 11 (2): 54-55]

Cheng HC, Liu LY, Zhang LP,etal. Experiment on the efficacy ofMetarhiziumanisopliaefor controlling the white grub ofAnomalacorpulenta[J].ModernAgrochemicals, 2007, 6 (5): 40-41. [程輝彩, 劉麗云, 張麗萍, 等. 綠僵菌防治銅綠麗金龜蠐螬藥效試驗[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥, 2007, 6 (5): 40-41]

Guo YQ, Li YL. Effects ofMetarhiziumflavovirideon the activity of several enzyme systems inHenosepilachnavigintioctomaculata[J].PlantProtection, 2007, 33 (3): 39-42. [郭艷瓊, 李友蓮. 黃綠綠僵菌對馬鈴薯瓢蟲體內(nèi)幾種種胞外酶溶解寄主表皮是病原真菌侵入寄主體內(nèi)的酶活性的影響[J]. 植物保護(hù), 2007, 33 (3): 39-42]

Jenkins NE,Lomer CJ.Development of new procedure for the mass production of conidia ofMetarhiziumflavoviride[J].BulletinOilbSrop,1994,17:181-184.

Hou Y, Xia YF, Xu JQ,etal. Identification and biological characteristics of aMetarhiziumstrain and its virulence against oriental migratory locust [J].ChineseJournalofBiologicalControl, 2015, 31 (3): 333-339. [侯穎, 夏彥飛, 徐建強(qiáng), 等. 一株綠僵菌的鑒定、生物學(xué)特性及對東亞飛蝗的致病力[J]. 中國生物防治學(xué)報, 2015, 31 (3): 333-339]

Li JY, Xu QA, Dai XY,etal. Study on the biological characteristics ofMetarhiziumflavoviride[J].GuangdongAgriculturalSciences, 2013, 40 (9): 71-73. [李佳穎, 許齊愛, 代曉彥, 等. 黃綠綠僵菌SM076菌株生物學(xué)特性研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 40 (9): 71-73]

Li LZ, Song YF. Study of using entomopathogenic fungiBeauveriabrongniatiito control white grubs in forest nursery [J].JournalofNortheastForestryUniversity, 1998, 26 (2): 33-36. [李蘭珍, 宋友發(fā). 卵孢白僵菌防治苗圃地蠐螬的研究[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1998, 26 (2): 33-36]

Lin HF, Li SG, Zhang L,etal. Biological characteristics ofMetarhiziumanisopliaevar.majorand its virulence to white grubs [J].ChineseJournalofAppliedEcology, 2006, 17 (2): 351-353. [林華峰, 李世廣, 張磊, 等. 綠僵菌大孢變種的生物學(xué)特征及其對蠐螬的毒力研究[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2006, 17 (2): 351-353]

Lin HF, Wang PL, Zhang L,etal. Growth ofBeauveriabrongniartiiand two varieties ofMetarhiziumanisopliaeand their virulence against white grubs [J].ChineseJournalofBiologicalControl, 2006, 22 (2): 123-127. [林華峰, 王萍莉, 張磊, 等. 布氏白僵菌和金龜子綠僵菌兩變種的生長性狀及其對蠐螬的毒力測定[J]. 中國生物防治, 2006, 22 (2): 123-127]

Liu AY. A strain ofMetarhiziumflavovirideisolated fromChilosuppressalis[J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences, 1990, 3 (3): 40-41. [劉愛英. 一株分離自二化螟的黃綠綠僵菌[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 1990, 3 (3): 40-41]

Lomer CJ, Thomas MB, Dourokpindou OK,etal. Control of grasshoppers, particularlyHieroglyphusdaganensis, in northern benin usingMetarhiziumflavoviride[J].MicrobialControlofGrasshoppers&Locusts, 1997, 129 (171): 301-311.

Milner RJ.Metarhiziumflavoviride(FI985) as a promising mycoinsecticide for Australian aeridids [J].MemoirsoftheEntomologicalSocietyofCanada, 1997, 111 (171): 287-300.

Pu ZL, Li ZZ. Insect Mycology [M]. Hefei: Anhui Publishing House of Science and Technology, 1996. [蒲蟄龍, 李增智. 昆蟲真菌學(xué)[M]. 合肥: 安徽科學(xué)技術(shù)出版社, 1996]

Rombach MC, Aguda RM, Shepard BM,etal. Infection of rice brown planthopper,Nilaparvatalugens(Homoptera: Delphacidae), by field application of entomopathogenicHyphomycetes(Deuteromycotina) [J].EnvironmentalEntomology, 1986, 15 (5): 1070-1073.

Shen JF, Wang ZK, Zhang JW,etal. Identification of twoMetarhiziumspecies and bioassay of their virulence against the white grubs of peanut [J].ChineseJournalofBiologicalControl, 2012, 28 (3): 334-340. [申劍飛, 王中康, 張建偉, 等. 兩株綠僵菌菌株的分離鑒定及其對花生蠐螬的致病力[J]. 中國生物防治學(xué)報, 2012, 28 (3): 334-340]

Su Y, Nong XQ, Zhang ZH. Genetic polymorphism ofMetarhiziumanisopliaeisolates and its association with geographic origin and host species [J].ChineseJournalofBiologicalControl, 2010, 26 (4): 428-435. [蘇宇, 農(nóng)向群, 張澤華. 綠僵菌菌株遺傳多態(tài)性與地理來源及寄主種群分化的關(guān)聯(lián)性[J]. 中國生物防治學(xué)報, 2010, 26 (4): 428-435]

Sun JB, Deng X, Song XS. Biological property and virulence measurement ofMetarhiziumanisopliae[J].ForestBy-ProductandSpecialityinChina, 2007, 3: 17-18. [孫家寶, 鄧勛, 宋小雙. 金龜子綠僵菌的生物學(xué)特性及毒力測定[J]. 中國林副特產(chǎn), 2007, 3: 17-18]

Thomas M, Gbongboui C, Lomer C. Between-season survival of the grasshopper pathogenMetarhiziumflavoviridein the Sahel [J].BiocontrolScienceandTechnology, 1996, 6 (4): 569-573.

Wang PL. Biology ofMeterhiziumanisopliaeand Application in Controlling the Peanut White Grubs [D]. Hefei: Anhui Agricultural University, 2006. [王萍莉. 金龜子綠僵菌的生物學(xué)及其在花生蠐螬防治中的應(yīng)用[D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006]

Yang XJ, Lin HF, Li MY,etal. Cultural characteristics ofNomuraearileyiNr05 and its virulence toSpodopteralitura[J].ChineseJournalofBiologicalControl, 2007, 23 (1): 44-48. [楊新軍, 林華峰, 李茂業(yè), 等. 萊氏野村菌Nr05菌株的培養(yǎng)性狀及其對斜紋夜蛾的毒力[J]. 中國生物防治, 2007, 23 (1): 44-48]

Yao QX, Zhang Y, Din Y. Review on the advance and prospect of scarabs control research [J].JournalofNortheastForestryUniversity, 2003, 31 (3): 64-66. [姚慶學(xué), 張勇, 丁巖. 金龜子防治研究的回顧與展望[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2003, 31 (3): 64-66]

Yin YP, Song ZY, Xie N,etal. Nutrition requirement and culture characteristic ofMetarhiziumanisopliaestrain CQMall7 [J].ChineseJournalofBiologicalControl, 2010, 26 (2): 206-210. [殷幼平, 宋章永, 謝寧, 等. 金龜子綠僵菌CQMa117的營養(yǎng)要求與培養(yǎng)特性初探[J]. 中國生物防治, 2010, 26 (2): 206-210]

Zhang SY, Lin HF, Li MY,etal. Culturing characteristics of entomogenous fungi strains and their virulence toNilaparvatalugens(Stal) [J].ChineseJournalofAppliedEntomology, 2011, 48 (5): 1407-1411. [張松影, 林華峰, 李茂業(yè), 等. 幾種蟲生真菌菌株的培養(yǎng)性狀及其對褐飛虱的毒力[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報, 2011, 48 (5): 1407-1411]

Zhang ZL. Chinese Economic Insect Fauna: Coleoptera Scarabaeoidae Larvae [M]. Beijing: Science Press, 1984: 18-63. [張芝利. 中國經(jīng)濟(jì)昆蟲志: 鞘翅目金龜總科幼蟲[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1984: 18-63]

Zhao WQ, Fan MZ, Cai SP,etal. The virulence test of different strains ofMetarhiziumandBeauveriaagainstAnomalacorpulentamoltsch [J].JournalofBiology, 2005, 22 (5): 43-45. [趙文琴, 樊美珍, 蔡守平, 等. 不同綠僵菌、白僵菌菌株對銅綠麗金龜幼蟲的毒力生物測定[J]. 生物學(xué)雜志, 2005, 22 (5): 43-45]

StudyonthecultureconditionforthebiocontrolstrainMa130821ofMetarhiziumflavovirideagainstthechaferofHolotrichiaparallela

LIU Si-Yu1*, DU Guang-Zu1*, HU Yan-Xia2, WANG Xin-Zhong2, XIAO Guan-Li1**, CHEN Bin1**

(1. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources in Yunnan, College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Dali Tobacco Company, Dali 665000, Yunnan Province, China)

The biocontrol strain Ma130821 ofMetarhiziumflavoviridefor pest insect was isolated from the chafer ofHolotrichiaparallelaMotschulsky in corn field in Tadian town of Yuxi city, Yunnan Province. A study on the culture conditions for the stain Ma130821 was conducted in laboratory in order to research and develop biological control agents for chafers. The growth and sporulation of Ma130821 was tested on different culture medium under different pHs, temperature and photoperiods. The results showed that the strain Ma130821 can be cultured on PDA and SDAY medium, but the sporulation on PDA was earlier than on SDAY, which was on the 6thday after the culture. The optimal temperature for the growth of Ma130821 on PDA medium was at 25℃, the daily increase rate of colony diameter was 0.24 cm/d, it produced spores on the 4thday after the culture and with a maximum sporulation of 1.091×107spores/cm2. The most rapid growth rate of colony, the earliest and the greatest sporulation was at the photoperiod of 16 h light and 8 h darkness. The optimal pH for the growth of Ma130821 was pH 6.5. Based on the above results, the PDA medium is suitable for the culture of Ma130821, the optimal condition for its growth and development was pH6.5, 25℃ and 16 h photoperiod. All the results will provide a theoretical base for the development of biological control agents for chafers.

Metarhiziumflavoviride; culture condition; colony growth; sporulation time; sporulation number

劉思雨，杜廣祖，戶艷霞,等.暗黑鰓金龜幼蟲生防黃綠綠僵菌Ma130821菌株的室內(nèi)培養(yǎng)條件的研究[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報，2017,39(5):1007-1014.

Q965;S476

A

1674-0858(2017)05-1007-08

云南省煙草公司科技計劃項目(2014YN16)；國家自然科學(xué)基金項目(31660537)；云南省農(nóng)業(yè)生物多樣性利用與保護(hù)省部共建國家重點實驗室學(xué)生科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)行動基金項目(ZBPG03)

劉思雨，男，1991年生，陜西扶風(fēng)縣人，碩士研究生，研究方向為害蟲綜合防治研究，E-mail：779350009@qq.com

*共同第一作者, E-mail: 15288457381@163.com

**通信作者Author for correspondence, E-mail: chbins@163.com; glxiao9@163.com

Received: 2016-12-01; 接受日期Accepted: 2017-04-23