蒙 成，黃艷花，梁慶平，蔣益敏，吳 地

(廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530007)

【研究意義】玉米大斑病(Northern leaf blight of corn)是玉米的一種重要葉部病害，在我國各地普遍發(fā)生，對(duì)玉米產(chǎn)量影響嚴(yán)重，一般可導(dǎo)致減產(chǎn)20%左右，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)可達(dá)50%［1－4］。該病害由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起，病菌可通過分生孢子實(shí)現(xiàn)病害遠(yuǎn)距離傳播［5］。利用抗病種質(zhì)資源，選育和種植抗病品種是控制玉米大斑病流行的有效措施［6］。在抗病品種選育過程中，必須進(jìn)行抗病性鑒定接種。孢子懸浮液噴霧接種和粉碎玉米病葉接種，受降雨和環(huán)境相對(duì)濕度影響較小，是開展玉米大斑病抗病性鑒定較好的人工接種方法。大田進(jìn)行抗病性鑒定接種需要大量接種體，因此，探索影響分生孢子產(chǎn)生的外界條件，從而獲得大量分生孢子對(duì)玉米大斑病抗病性接種鑒定具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在抗病品種的選育與利用過程中，抗病性鑒定已成為玉米育種及其區(qū)域適應(yīng)性的常規(guī)工作。玉米大斑病抗病性鑒定常用方法有:把保存的玉米大斑病菌接種在PDA斜面上，待產(chǎn)生大量孢子后用無菌水配成孢子懸浮液噴霧接種［7］;采用高粱粒培養(yǎng)基培養(yǎng)玉米大斑病分生孢子做接種體，然后放入玉米心葉內(nèi)接種［8－11］;也有把玉米大斑病病葉粉碎撒在玉米心葉內(nèi)接種［12－13］;劉燁玨等［14］研究結(jié)果表明，菌液灌心和帶菌高粱粒接種可以保證玉米單株接種量一致，同時(shí)，接種體被接種于玉米心葉中，保證了玉米大斑病菌孢子萌發(fā)所需的水分和濕度，提高病菌侵染率;分生孢子在不同營養(yǎng)及培養(yǎng)環(huán)境條件下，其產(chǎn)孢效果差異顯著。沈江衛(wèi)等［15］研究結(jié)果表明:甘薯黑斑病菌(Ceratocystis fimbriata Elliset Halsted)在番茄培養(yǎng)基上生長最好，在胡蘿卜培養(yǎng)基上生長最差;分生孢子產(chǎn)量以在PDA培養(yǎng)基上最多，在玉米粉培養(yǎng)基上最少;菌絲適宜生長溫度25℃，在15℃下分生孢子產(chǎn)孢量最大;光照條件對(duì)黑斑病菌分生孢子產(chǎn)孢量沒有明顯差別。劉海英等［16］認(rèn)為繼代培養(yǎng)一般會(huì)引起微生物退化，但也不排除使微生物增強(qiáng)適應(yīng)性的可能。利用谷物粒(麥粒，玉米粒，高梁粒等)培養(yǎng)基制備接種體是目前病害接種中廣泛使用的方法之一。玉米大斑病分生孢子通常采用高粱粒培養(yǎng)基來培養(yǎng)［17］，但產(chǎn)孢效果不甚理想，且在實(shí)際操作中，制備的接種體往往存在污染率高、滋長小昆蟲、制備慢和操作過程復(fù)雜等缺點(diǎn)。馮勝澤等［18］和姜開梅等［19］利用其他平板培養(yǎng)基來做產(chǎn)孢實(shí)驗(yàn)，但這些產(chǎn)孢方法操作過程繁瑣，不便于大面積抗病鑒定操作，不能用帶病菌組織進(jìn)行接種。目前，關(guān)于玉米大斑病利用谷物粒培養(yǎng)基培養(yǎng)分生孢子，并對(duì)其產(chǎn)孢影響因素進(jìn)行研究尚未見報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為獲得產(chǎn)孢效果好、成本低且操作簡單、便于進(jìn)行大面積抗病性鑒定。以高粱粒、小麥粒、玉米粒為主要材料，以玉米葉、甘露醇、碳酸鉀、硫酸鎂、磷酸鈉等為輔料，組配25種植物組織培養(yǎng)基開展產(chǎn)孢量試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、光照、同一菌株不同代數(shù)等影響產(chǎn)孢因素進(jìn)行探討。【擬解決的關(guān)鍵問題】對(duì)影響玉米大斑病抗病鑒定谷物粒培養(yǎng)基產(chǎn)孢因素進(jìn)行探討，尋找一種谷物粒培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，在玉米大斑病抗病鑒定時(shí)獲得產(chǎn)孢效果好、成本低且操作簡單、便于進(jìn)行大面積抗病性鑒定，可以用帶病菌谷物粒進(jìn)行接種，為玉米大斑病抗病鑒定工作的簡化性、時(shí)效性、準(zhǔn)確性提供保障。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

在玉米大斑病集中發(fā)生期，從田間采集具有典型玉米大斑病癥狀的葉片進(jìn)行病菌分離:在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行單病斑分離(第1代)，經(jīng)純化后(第2代)進(jìn)行單孢子分離(第3代)，獲得野生型玉米大斑病菌菌株，即為供試菌株。

1.2 供試培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基，分別由高粱粒、小麥粒及玉米粒為主要材料，以甘露醇、碳酸鉀、硫酸鎂、磷酸鈉、玉米葉等為輔料，單因素組配25種培養(yǎng)基。高粱粒處理方法:挑選籽粒飽滿、大小一致、無病蟲的帶皮高粱水煮25 min后水洗瀝干備用;小麥粒處理方法:挑選籽粒飽滿、大小一致、無病蟲的帶皮小麥粒浸泡20～25 min后，水煮15～18 min后水洗瀝干備用;玉米粒的處理方法為:挑選大小一致、無病蟲的玉米粒侵泡12～15 h，水煮1h，水洗瀝干備用;玉米葉用從大田采集新鮮嫩葉切成約1 cm2的碎片備用;培養(yǎng)基制作方法:按配方配置，把所需成分混勻，濕度以藥品能溶解，玉米葉能摻和在籽粒上而無滴水為度。配好的培養(yǎng)基裝入250 mL的三角瓶中(簡稱培養(yǎng)瓶，下同)，每瓶裝100 g，經(jīng)121 Pa高壓滅菌45 min備用。

1.3 供試儀器

供試培養(yǎng)箱為珠江牌培養(yǎng)箱，型號(hào):LRH-250-GSB1。

1.4 不同培養(yǎng)條件對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響

1.4.1 培養(yǎng)基對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響 單因素組配25種植物組織培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢量試驗(yàn)，每個(gè)配方一個(gè)處理，共25個(gè)處理(表1)，3次重復(fù)。供試菌株在PDA培養(yǎng)基上擴(kuò)繁6 d，菌絲長滿9 cm培養(yǎng)皿后，用帶PDA培養(yǎng)基的菌絲接種到供試谷物粒培養(yǎng)基上，每份處理接種半皿菌塊(下同)，接種后的培養(yǎng)瓶置于20℃、12 h黑暗12 h光照(光照強(qiáng)度2000 lx)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11 d，測(cè)定產(chǎn)孢量。

1.4.2 溫度對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響 以9號(hào)培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，分別在 8、12、16、20、24、28、32 和36 ℃共8 個(gè)溫度梯度［20］、光周期:12 L∶12 D(光照強(qiáng)度2000 lx)條件下培養(yǎng)，3次重復(fù)，培養(yǎng)11 d后測(cè)定產(chǎn)孢量。

1.4.3 光照條件對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響 以9號(hào)培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，分別在24 D、12 L∶12 D(1500、2000、3000 lx等3種不同光照強(qiáng)度梯度)、24 L(光照強(qiáng)度3000 lx)共5種不同光照處理下20℃恒溫培養(yǎng) 11 d［18］，3 次重復(fù)。

1.4.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響 以9號(hào)培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，接種后的培養(yǎng)瓶分別置于20℃和24℃、12 L∶12 D光照(光照強(qiáng)度2000 lx)條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 次重復(fù)。于第 5、7、9、11、15、20 和25 d測(cè)定產(chǎn)孢量。

1.5 供試菌株不同代數(shù)對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響

將供試菌株(第3代)的菌塊移植在PDA平面培養(yǎng)基上(即為第4代)，置于25～26℃溫箱中培養(yǎng)，同時(shí)移植在PDA斜面培養(yǎng)基上作為分代保存菌種。每一代培養(yǎng)7 d時(shí)用菌塊繼代轉(zhuǎn)移1次，連續(xù)對(duì)菌株進(jìn)行菌塊繼代移植和培養(yǎng)，可獲得該病菌的繼代培養(yǎng)菌種，共移植到第10代，斜面培養(yǎng)基保存的分代菌種培養(yǎng)7 d后放入4℃進(jìn)行保存［21］。試驗(yàn)時(shí)將3～10代的菌種做試驗(yàn)處理，以9號(hào)培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，8個(gè)處理，3次重復(fù)。接種后的培養(yǎng)瓶放入20℃、12 h黑暗12 h光照(光照強(qiáng)度2000 lx)條件下培養(yǎng)11 d后測(cè)定產(chǎn)孢量。

1.6 分生孢子產(chǎn)量的測(cè)定

取各處理菌粒2 g放入50 mL燒杯加水10 mL，用不繡鋼勺子連續(xù)攪拌約100次，以保證能將菌株所產(chǎn)生的分生孢子刮下至孢子脫落水里，過濾得到的孢子懸浮液，用血球記數(shù)板計(jì)算1 mL孢子懸液中所含的孢子數(shù)，折算每g培養(yǎng)基產(chǎn)生的孢子量。每處理取樣3次，每樣品讀數(shù)3次。

表1 25種供試培養(yǎng)基Table 1 25 tested media

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)孢量的影響Fig.1 The effect of different media on conidia production

2 結(jié)果與分析

2.1 不培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)孢量的影響

將供試菌株分別接種在25種不同培養(yǎng)基上，培養(yǎng)11 d后觀察發(fā)現(xiàn)每種培養(yǎng)基上均有分生孢子產(chǎn)生，但其產(chǎn)孢量不同。由圖1可知，18個(gè)不同配方的培養(yǎng)基產(chǎn)胞量顯著高于對(duì)照，配方小麥100 g+甘露醇2.5 g+玉米葉15 g的9號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)孢數(shù)量最多，為1.69 ×105個(gè)/g;配方玉米100 g+甘露醇2.5 g+碳酸鉀0.2 g+玉米葉15 g的20號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)孢量次之，為1.49 ×105個(gè)/g;排第 3、4、5、6、7 的分別為5、3、11、12、19 號(hào)培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量分別為 1.28 ×105、1.18 × 105、1.13 × 105、1.13 × 105、1.09 × 105個(gè)/g;14號(hào)與22號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)孢量相當(dāng)，分別為7.20×104、6.18 ×104個(gè)/g;17、6、8 號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)孢量相同，其與13、21、2、15號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)孢量相當(dāng)，產(chǎn)孢量依次為 2.17 × 104、3.63 × 104、3.44 × 104、2.61 ×104、2.29×104個(gè)/g;1號(hào)和24培養(yǎng)基產(chǎn)孢量相同，產(chǎn)孢量為1.02×104個(gè)/g;25號(hào)常用高粱培養(yǎng)基(CK)產(chǎn)孢量為9.10 ×103個(gè)/g;10、7、18、16、23、4 號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)孢量較對(duì)照少，分別為8.92×103、8.92×103、5.10 × 103、3.18 × 103、2.55 × 103、2.00 × 103個(gè)/g。因此，9號(hào)培養(yǎng)基為玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)基。

圖2 不同溫度對(duì)產(chǎn)孢量的影響Fig.2 The effects of different temperatures on conidia production

2.2 不同溫度條件對(duì)產(chǎn)孢量的影響

由圖2可知，培養(yǎng)溫度對(duì)玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生的影響較大，溫度過低或過高都不利于分生孢子產(chǎn)生。20℃條件下產(chǎn)孢量顯著高于其它，24℃條件下產(chǎn)孢量其次，溫度≤8℃或≥32℃時(shí)，不產(chǎn)生分生孢子。因此，接種后的培養(yǎng)基在20℃條件下培養(yǎng)是玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生的最適宜溫度。

2.3 不同光照條件對(duì)產(chǎn)孢量的影響

圖3 光照對(duì)產(chǎn)孢量的影響Fig.3 Effects of light treatments on conidia production

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)孢量的影響Fig.4 The effects of different culture duration on spore production

由圖3可知，光照條件對(duì)玉米大斑病菌產(chǎn)孢量有一定影響，適量光照對(duì)該病菌產(chǎn)孢有促進(jìn)作用。12 L∶12 D，2000 lx光照強(qiáng)度條件下產(chǎn)孢量顯著高于其它光照條件，產(chǎn)孢量為1.69 ×105個(gè)/g;12 L∶12 D，光照強(qiáng)度1500 lx條件下產(chǎn)孢量次之，產(chǎn)孢量為1.41×105個(gè)/g;高強(qiáng)度光照即12 L∶12 D，光照強(qiáng)度3000 lx條件對(duì)該病菌產(chǎn)孢量有明顯抑制作用，產(chǎn)孢量為2.7×104個(gè)/g;24D條件下不利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為8.99×104個(gè)/g;24 L，光照強(qiáng)度為3000 lx條件下最不利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量僅為1.71×104個(gè)/g。

2.4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)孢量的影響

由圖4可知，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)玉米大斑病菌產(chǎn)孢量影響差異顯著。20和24℃條件下培養(yǎng)時(shí)間7～11 d，培養(yǎng)時(shí)間越長，產(chǎn)孢量顯著增加，20℃條件下培養(yǎng)11 d產(chǎn)孢量最多;培養(yǎng)時(shí)間11～25 d，培養(yǎng)時(shí)間越長，產(chǎn)孢量顯著減少。因此，在20℃條件下，培養(yǎng)時(shí)間在第11天是玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生量最多的時(shí)間。

2.5 供試菌株不同代數(shù)對(duì)產(chǎn)孢量的影響

由圖5可知，玉米大斑病菌經(jīng)菌塊繼代轉(zhuǎn)移和培養(yǎng)，不同代數(shù)對(duì)產(chǎn)孢量影響差異顯著。產(chǎn)孢量隨著代數(shù)增加而遞減。第3代產(chǎn)孢量最高，為1.69×105個(gè)/g;第 4 代其次，產(chǎn)孢量為 1.36 ×105個(gè)/g;因此，第3代菌株最有利于玉米大斑病菌分生孢子生長，產(chǎn)孢量最多。

3 討論

圖5 菌株不同代數(shù)對(duì)產(chǎn)孢量的影響Fig.5 Effects of different strain generations on the conidia yield

在促進(jìn)植物病原真菌產(chǎn)孢的研究進(jìn)程中，方中達(dá)［22］認(rèn)為培養(yǎng)基與孢子產(chǎn)生的關(guān)系最大，采用不同培養(yǎng)基或者改變它們的成分，是促進(jìn)孢子產(chǎn)生的最主要途徑;劉麗麗等［23］認(rèn)為不同培養(yǎng)基對(duì)多數(shù)茄鏈格孢的產(chǎn)孢量有明顯影響;莊義慶等［24］認(rèn)為綠豆湯培養(yǎng)液是蕉斑鐮刀菌液體搖瓶產(chǎn)孢最好的培養(yǎng)液，在適宜條件下，產(chǎn)孢量達(dá)到1×106mL－1;蘭成忠等［25］認(rèn)為辣椒疫霉菌在胡蘿卜、黑麥和燕麥培養(yǎng)基均能產(chǎn)生孢子囊，胡蘿卜培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子囊的數(shù)量最多;馮勝澤等［18］用13種不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)玉米大斑病菌分生孢子的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)使用玉米籽粒葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(CDA)、玉米籽粒瓊脂培養(yǎng)基(CA)及水瓊脂培養(yǎng)基(WA)3種培養(yǎng)基產(chǎn)孢量較低，均≤8.89×103個(gè)/mL，PDA 培養(yǎng)基產(chǎn)孢量為 1.32 ×105個(gè)/mL，而玉米葉片葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(CLDA)最有利于分生孢子的產(chǎn)生，產(chǎn)孢量達(dá)到 1.63×105個(gè)/mL，使用含有玉米葉片的CLDA培養(yǎng)基與使用普通PDA培養(yǎng)基相比產(chǎn)孢量差異顯著。本研究采用25種不同谷物粒培養(yǎng)基誘導(dǎo)玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)使用配方為小麥100 g、甘露醇2.5 g、玉米葉15 g的9號(hào)培養(yǎng)基最佳，產(chǎn)孢量最多，產(chǎn)孢量為1.69 ×105個(gè)/g;配方為玉米 100 g、甘露醇 2.5 g、碳酸鉀0.2 g玉米葉15 g的20號(hào)培養(yǎng)基其次，產(chǎn)孢量第二，產(chǎn)孢量為1.49×105個(gè)/g，說明，這兩種培養(yǎng)基搭配合理，適宜玉米大斑病菌生長。

陳利峰和徐敬友［26］研究結(jié)果表明，玉米大斑病菌分生孢子形成溫度為13～30℃，產(chǎn)孢最適溫度為20℃;馮勝澤等［18］認(rèn)為培養(yǎng)溫度過低或過高都不利于分生孢子的產(chǎn)生，在15、35℃均不產(chǎn)生分生孢子，僅在20、25、30 ℃能夠產(chǎn)生孢子，其中在 20、30℃的產(chǎn)孢量較少，25℃為病菌分生孢子產(chǎn)生的最適宜溫度。本研究認(rèn)為:玉米大斑病菌在溫度≤8℃或≥32℃時(shí)，不產(chǎn)生分生孢子;16～24℃產(chǎn)孢量較多，其中20℃條件下產(chǎn)孢量最多。說明，培養(yǎng)溫度過低或過高都不利于玉米大斑病菌生長，低于8℃或32℃以上病菌停止生長。

光照條件對(duì)玉米大斑病菌生長影響差異顯著，本研究發(fā)現(xiàn)，在全光照培養(yǎng)條件下(光照強(qiáng)度3000 lx)顯著抑制分生孢子產(chǎn)生;12 h黑暗12 h光照培養(yǎng)條件與全黑暗培養(yǎng)相比，光照強(qiáng)度3000 lx抑制分生孢子產(chǎn)生，光照強(qiáng)度2000 lx促進(jìn)分生孢子產(chǎn)生;連續(xù)24 h黑暗條件下不利于分生孢子產(chǎn)生。說明在玉米大斑病菌中不同光照強(qiáng)度對(duì)分生孢子產(chǎn)生的影響不同。由此可見，在不同植物病原真菌中，光照時(shí)間、光照強(qiáng)度、光質(zhì)等對(duì)病菌分生孢子產(chǎn)生均具有不同程度影響，本研究結(jié)果與馮勝澤等［18］研究結(jié)果基本一致。

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)玉米大斑病菌產(chǎn)孢量差異顯著。以配方小麥100 g、甘露醇2.5 g、玉米葉15 g的培養(yǎng)基在20和24℃條件下，培養(yǎng)7～11 d、培養(yǎng)時(shí)間越長，產(chǎn)孢量顯著增加;培養(yǎng)11～25 d培養(yǎng)時(shí)間越長，產(chǎn)孢量顯著減少。因此，該配方的培養(yǎng)基在20和24℃條件下，培養(yǎng)時(shí)間11 d是玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生量最多的時(shí)間。其它配方的培養(yǎng)基，其產(chǎn)孢量與培養(yǎng)時(shí)間關(guān)系是否與該配方培養(yǎng)基相一致，有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果玉米大斑病菌經(jīng)菌塊繼代轉(zhuǎn)移和培養(yǎng)，第3代產(chǎn)孢量最多，從第3～10代產(chǎn)孢量隨著代數(shù)增加而遞減。劉海英等［16］研究認(rèn)為，經(jīng)連續(xù)單孢分離和培養(yǎng)，獲得玉米大斑病菌的22次繼代培養(yǎng)菌株，前13代菌株沒有明顯的生長和發(fā)育變化，從第14代開始，繼代培養(yǎng)對(duì)病菌的生長和發(fā)育存在顯著影響，隨著繼代次數(shù)增加，產(chǎn)孢量下降，本研究結(jié)果與其研究結(jié)果差異較大，原因可能是連續(xù)單孢分離和培養(yǎng)與菌塊繼代轉(zhuǎn)移和培養(yǎng)相比，菌株衰退較慢;也有可能兩者間供試的菌株本身存在較大的差異。

4 結(jié)論

利用單因素組配確定了促進(jìn)玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)量增加的最佳谷物粒培養(yǎng)基配方為小麥100 g、甘露醇2.5 g、玉米葉15 g的9號(hào)培養(yǎng)基;該培養(yǎng)基在20℃、光暗交替各12 h，光照強(qiáng)度為2000 lx條件下，分生孢子產(chǎn)量最高;培養(yǎng)時(shí)間在11 d內(nèi)，培養(yǎng)時(shí)間越長產(chǎn)孢量越高，第11天是玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生量最多的時(shí)間，培養(yǎng)時(shí)間11～25 d，培養(yǎng)時(shí)間越長，產(chǎn)孢量越少;玉米大斑病菌經(jīng)菌塊繼代轉(zhuǎn)移和培養(yǎng)，第3代產(chǎn)孢量最多，從第3～10代產(chǎn)孢量隨著代數(shù)增加而遞減。