馬繼瓊，孫一丁，楊 奕，李進(jìn)斌，陳惠查，焦愛霞，譚金玉，阮仁超，許明輝*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650223;2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205;3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，貴州貴陽 550006)

【研究意義】稻瘟病是全世界范圍內(nèi)水稻生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一。利用抗稻瘟病基因培育抗性品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的手段。廣泛篩選鑒定抗稻瘟病基因資源是培育抗稻瘟病品種的基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】截至目前，已至少報(bào)道了69個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)共84個(gè)主效基因。其中，Pb1，Pia，Pib，Pid2，Pid3，Pik，Pikh，Pi54，Pik-p，Pish，Pit，Pita，Piz-t，Pi1，Pi2，Pi5，Pi9，Pi21，Pi25，Pi36，Pi37，Pi56，Pi63，PiCO39 等 24 個(gè)基因已被成功克?。?］，為利用分子標(biāo)記檢測(cè)這些基因提供了可能性。稻瘟病抗病基因Pikh是對(duì)稻瘟病菌具有廣譜抗性的主效抗病基因，如云南省檢測(cè)282個(gè)稻瘟病菌株的抗性已達(dá)81.7%［2］，廣東省163稻瘟病菌株的抗譜達(dá) 89.6%［3］，四川、貴州、重慶、福建、吉林等地也具有較強(qiáng)的稻瘟病抗性［4－6］，對(duì)病菌具有較寬的抗譜，在水稻抗病育種中有較大的利用價(jià)值。Pi9抗譜相當(dāng)廣，檢測(cè)來自13個(gè)國家的43個(gè)稻瘟病菌株均表現(xiàn)出很高的抗性［7］;在云南及黑龍江等地的水稻育種上具有極高價(jià)值［2，8］，Abdullah 等建議推廣種植攜帶Pi9基因的水稻品種［9］。Pi2的抗譜也較廣，檢測(cè)出對(duì)792個(gè)中國收集的稻瘟小種中絕大部分均表現(xiàn)抗性［10］。Pi5則在溫室人工接種條件下對(duì)PO6-6等5個(gè)稻瘟病小種表現(xiàn)完全抗性［11］。

【本研究切入點(diǎn)】貴州禾類種質(zhì)資源是指原產(chǎn)貴州東南部(特別是從江、黎平、榕江、錦屏等縣)的一種地域性很強(qiáng)的特殊稻類生態(tài)型［12］，是在獨(dú)特的生態(tài)條件及當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族(侗族)特殊的耕作制度下，經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇所形成的一種稻種，主要分布于林間深谷，其山林郁閉嚴(yán)重，霧多、濕度大，陽光直射時(shí)間短，氣候一日間寒熱變化頻繁，從而形成了與自然生態(tài)環(huán)境高度適應(yīng)的具有品質(zhì)優(yōu)良和抗逆性強(qiáng)為主要特點(diǎn)的稻種生態(tài)類型。具有耐陰性、耐冷性和苗期抗旱性極強(qiáng)等特點(diǎn)，并具有廣親和基因［13］。【擬解決的關(guān)鍵問題】文章利用Pikh、Pi2、Pi9、Pi5分子標(biāo)記對(duì)貴州禾進(jìn)行分析，明確每個(gè)地方品種攜帶這4個(gè)抗性基因的狀況，以評(píng)價(jià)貴州禾種質(zhì)資源利用價(jià)值，也將有助于制定新的稻瘟病防治與抗病育種策略。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料均為貴州省地方水稻品種“貴州禾”，共82份，來自貴州省黔東南和黔南2個(gè)州相互接壤的5個(gè)縣，其中從江縣39份、黎平縣28份、荔波縣9份、雷山縣4份、榕江縣2份。均為科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)“貴州農(nóng)業(yè)生物資源調(diào)查(2012FY110200)”調(diào)查隊(duì)2012－2015年調(diào)查中所收集的品種，目前民間仍有種植，感病對(duì)照為“麗江新團(tuán)黑谷”。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物合成 PCR特異性引物參考文獻(xiàn)［14－16］，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列詳情見表1。

1.2.2 基因組總DNA提取 采用CTAB法提取基因組DNA。

1.2.3 PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系20 μl體系:Buffer 2 μl，dNTPs 1 μl，前后引物各 1 μl，Ex Taq 酶 0.4 μl，ddH2O 13.6 μl，DNA 模板 1 μl。反應(yīng)程序:95 ℃，5 min;95℃，40 s;57℃，30 s;72℃，50 s;41個(gè)循環(huán);72 ℃，10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色，紫外燈下觀察拍照。

表1 目標(biāo)基因引物及標(biāo)記片段大小Table 1 Sequences of primers for target gene and expected fragment length

圖1 部分品種Pi9基因分子標(biāo)記檢測(cè)Fig.1 Detection of Pi9 gene molecular markers in some varieties

1.2.4 葉稻瘟病田間抗性調(diào)查 2016－2017年材料種植于昆明市宜良縣(海拔1600 m)，屬稻瘟病嚴(yán)重稻區(qū)。順序排列，每個(gè)材料種植30株，感病對(duì)照為麗江新團(tuán)黑谷，利用蒙古稻進(jìn)行稻瘟病誘發(fā)。于7月上旬(封行期)進(jìn)行葉稻瘟抗性調(diào)查，每個(gè)材料年度抗性級(jí)別有差異的以最高級(jí)別計(jì)。調(diào)查按《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T15790-2009》品種抗性劃分標(biāo)準(zhǔn)葉瘟抗性分級(jí)指標(biāo)進(jìn)行調(diào)查分級(jí):0級(jí):高抗(HR)，無病;1級(jí):抗(R)，只有針尖大小的褐點(diǎn)或稍大褐點(diǎn);2級(jí):中抗(MR)，圓形稍長(zhǎng)的灰色小病斑，邊緣褐色，直徑1～2 mm;3級(jí):中感1(MS1)，典型紡錘型病斑，長(zhǎng)1～2 cm，通常局限于兩條主脈間，病斑面積2%以下;4級(jí):中感2(MS2)，典型病斑，病斑面積2.1% ～10%;5級(jí):感(S1)，典型病斑，病斑面積10.1% ～25%;6級(jí):感(S2)，典型病斑，病斑面積25.1% ～50%;7級(jí):高感1(HS1)，典型病斑，病斑面積50.1% ～75%;8級(jí):高感2(HS2)，葉片全枯死。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻種資源稻瘟病抗性基因分子標(biāo)記檢測(cè)

圖2 部分品種Pi2基因分子標(biāo)記檢測(cè)Fig.2 Detection of Pi2 gene molecular markers in some varieties

圖3 部分品種Pikh基因分子標(biāo)記檢測(cè)Fig.3 Detection of Pikh gene molecular markers in some varieties

利用特異引物對(duì)82份貴州水稻材料和麗江新團(tuán)黑谷、蒙古稻基因組DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，每個(gè)基因均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶(圖1～4)，但有的品種不能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，很可能是該品種基因組引物結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了突變?cè)斐梢锊黄ヅ?Pi9有4個(gè)品種，Pikh和Pi5(圖4中4號(hào)樣)各有1個(gè)品種同時(shí)出現(xiàn)抗感條帶，說明這些品種在此位點(diǎn)是雜合的。

由表2可以看出，通過長(zhǎng)期的人工和自然選擇，各稻瘟病抗性基因頻率不一，Pi5(32.35%)、Pikh(30.86%)相對(duì)較高，而 Pi9(2.56%)和 Pi2(2.47%)頻率較低。云南貴州地處同一高原，地方稻群體存在共同點(diǎn)，也存在差異。共同點(diǎn)是Pi9和Pi2在貴州禾和云南地方稻種頻率均較低，而云南Pi5和Pikh頻率分別為52.17%和65.22%，遠(yuǎn)高于貴州相應(yīng)的基因頻率［17］。

這4個(gè)基因可以組合成0(不攜帶所檢測(cè)的任何基因)、Pikh、Pi5、Pi9、Pi5+Pikh、Pi2+Pi5、Pi9+Pi5等7種基因型，其比例分別是50%、21.95%、14.63%、1.22%、8.54%、2.44%、1.22%(表3)，41個(gè)品種(基因型0)不攜帶所檢測(cè)的任何1個(gè)基因，占50%，攜帶1個(gè)基因的品種(基因型Pikh、Pi5、Pi9)有 31 個(gè)(占 37.8%)，2 個(gè)基因(Pi5+Pikh、Pi2+Pi5 和 Pi9+Pi5)的有 10 個(gè)(占 12.2%)。

圖4 部分品種Pi5基因分子標(biāo)記檢測(cè)Fig.4 Detection of Pi5 gene molecular markers in some varieties

表2 4個(gè)稻瘟病抗性基因頻率Table 2 Frequencies of four rice blast resistance genes

表3 4個(gè)稻瘟病抗性基因組合的基因型及在各縣的分布Table 3 Genotypes of four rice blast resistance genes and their distribution in each county

從表3還可以看出，從江、黎平、榕江、雷山4縣材料是典型的貴州禾，出現(xiàn) 0、Pikh、Pi5、Pi9、Pi5+Pikh和Pi9+Pi5共6種基因型，而Pi2+Pi5基因型只出現(xiàn)在荔波縣;從江縣61.54%品種屬于0型，0型為優(yōu)勢(shì)類型，黎平縣的材料0型(46.43%)和Pikh(42.86%)同為優(yōu)勢(shì)類型，雷山縣和榕江縣由于供試品種少，選材存在一定的偶然性不能判斷。荔波縣雖與從江縣接壤，供試品種少于從江縣和黎平縣，但基因型卻達(dá)到了6種，且沒有明顯的優(yōu)勢(shì)類型，多于從江縣(4種)和黎平縣(3種)，表明荔波縣品種相對(duì)豐富。同時(shí)印證了“貴州禾”的SSR多樣性程度較低的結(jié)果［18］。

2.2 稻種資源田間葉稻瘟抗性表現(xiàn)

在田間稻瘟病誘發(fā)試驗(yàn)中，誘發(fā)品種蒙古稻嚴(yán)重發(fā)病(8級(jí))，感病對(duì)照麗江新團(tuán)黑谷田間表現(xiàn)感病(7級(jí))，表明大田發(fā)病充分。82個(gè)品種中，46個(gè)品種對(duì)葉瘟表現(xiàn)高抗(0～1級(jí))，占56.1%，其中黃鱔血(2013523309)、紅米(2014522141)2個(gè)品種表現(xiàn)高抗(0級(jí))，表明貴州禾在云南宜良具有一定的抗性，這些品種分布在 0、Pikh、Pi5+Pikh、Pi5、Pi2+Pi5、Pi9+Pi5這6種基因型中(表4)。在品種數(shù)較多的0、Pikh、Pi5+Pikh和Pi5這4種基因型中，0型不攜帶所檢測(cè)的任何基因，抗性變異最大，變幅1～6級(jí)，有18個(gè)(43.9%)表現(xiàn)感病(3～6級(jí))，平均抗性2.39級(jí)，而其他3種基因型變幅較小(1～3級(jí))，都有部分品種表現(xiàn)中感(3級(jí))，Pikh型有2個(gè)，Pi5+Pikh和Pi5型各有1個(gè)，3種基因型平均抗性分別為1.28、1.57 和1.17 級(jí)，抗性明顯高于不攜帶所檢測(cè)的任何基因的0型，表明田間抗性與所檢測(cè)的Pi5、Pikh基因有一定的關(guān)聯(lián)。Pikh和Pi5這2個(gè)基因在云南抗稻瘟病現(xiàn)代育種中起到了一定的作用，在現(xiàn)代育成品種中，70%品種攜帶Pikh，38.33%品種攜帶Pi5［17］，攜帶Pikh和Pi5的貴州禾在云南宜良表現(xiàn)一定的抗病性，進(jìn)一步證明這2個(gè)基因在云南水稻生產(chǎn)中的有效性。

表4 各基因型稻瘟病抗性比較Table 4 Comparison of rice blast resistance among 7 genotypes

在0型品種中，雖不攜帶所檢測(cè)的任何一個(gè)抗性基因，但仍有15個(gè)品種在田間也表現(xiàn)出了高抗葉稻瘟，占36.59%，說明這些材料攜帶所檢測(cè)基因之外的抗性基因;也有少部分?jǐn)y帶1～2個(gè)抗性基因的品種表現(xiàn)感病，如高粱糯通過檢測(cè)雖攜帶Pi9，但抗性為7級(jí)(高感)、占里糯禾攜帶Pi5+Pikh，抗性為3級(jí)(中感)，說明品種稻瘟病抗性的表達(dá)較為復(fù)雜，分子標(biāo)記鑒定有一定的局限性。

3 討論

培育抗稻瘟病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一，但稻瘟病抗性有非常強(qiáng)的小種?；?，且稻瘟病菌生理小種的多樣性和易變性，極易導(dǎo)致抗性品種喪失抗性。抗稻瘟病育種和品種布局中，育種家必須要清楚親本及后代品系攜帶的抗病基因種類和數(shù)量，指導(dǎo)品種的搭配和布局。然而傳統(tǒng)的抗病基因分析方法，需要大量的生理小種接種鑒定、抗性遺傳分析等工作，非常繁瑣。在資源研究中，由于資源數(shù)量大，要逐一進(jìn)行接種鑒定工作量十分巨大，攜帶的抗性基因不清很大程度上影響了資源的利用。隨著水稻抗稻瘟病基因的克隆，抗性基因分子標(biāo)記得到了快速的發(fā)展，大大提高抗病基因鑒定及育種選擇的效率，已成為抗病育種的一種簡(jiǎn)單快捷的途徑。抗稻瘟病基因分子標(biāo)記可準(zhǔn)確快速鑒定是否含有抗性基因，且具有操作簡(jiǎn)便、用時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行高通量的篩選，故近年來這一技術(shù)在國內(nèi)水稻育種和資源鑒定中得到了廣泛的應(yīng)用［19－20］。

貴州地處云貴高原的東斜坡面，全境均屬山區(qū)，屬中國亞熱帶高原季風(fēng)濕潤(rùn)氣候?！疤鞜o三日晴”是對(duì)貴州多雨潮濕的生態(tài)條件最形象的描述，在這樣復(fù)雜的生態(tài)條件影響下，稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多樣性和復(fù)雜性。采用基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)(rep-PCR)對(duì)貴州省的稻瘟病菌進(jìn)行基因組指紋分析，黃培英等將200個(gè)供試菌株劃分為19個(gè)遺傳譜系［21］，姜于蘭等將154個(gè)供試菌株分為12個(gè)遺傳譜系，6個(gè)組群21個(gè)小種［22］。在這樣復(fù)雜的稻瘟病菌環(huán)境條件下，對(duì)57個(gè)主栽品種稻瘟病的田間抗性監(jiān)測(cè)表明56個(gè)對(duì)稻瘟病表現(xiàn)出不同程度的感病性，多數(shù)品種不抗稻瘟病或田間抗性表現(xiàn)較差［23］。曾令祥對(duì)來自貴州省79個(gè)縣(市)4 000余份地方品種接種鑒定表明抗稻瘟病種質(zhì)在貴州9個(gè)行政區(qū)域均有分布［24］。

Pi9基因來源于小粒野生稻(Oryza minuta)［25］，亞洲栽培稻(Oryza sativa)內(nèi)的Pi9基因是種間基因交流的結(jié)果。從分析結(jié)果看“貴州禾”中Pi9頻率較低，這與外來稻種基因交流少有關(guān)，仍保持其原始狀態(tài)，值得進(jìn)一步研究，建議貴州抗稻瘟病育種中應(yīng)注意引入Pi9基因。

4 結(jié)論

貴州稻種資源以往的稻瘟病抗性研究均為田間和接種鑒定，本研究利用與 Pikh、Pi2、Pi9、Pi5稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)貴州禾攜帶的稻瘟病抗性基因進(jìn)行分析，明確了各品種攜帶的基因種類和數(shù)量。Pikh、Pi5這2個(gè)基因在貴州禾中出現(xiàn)頻率較高，得到了廣泛保留和利用;田間抗性結(jié)果表明多數(shù)貴州禾對(duì)云南宜良的稻瘟病菌具有一定的抗性，攜帶1～2個(gè)抗性基因的品種一般均表現(xiàn)抗病，抗性與攜帶的基因有一定的關(guān)系。本研究結(jié)果也表明，部分不攜帶這4個(gè)基因的材料田間也表現(xiàn)高抗，表明這些材料還含有其他的抗性基因，所以在實(shí)踐中可利用分子標(biāo)記進(jìn)行基因的初步篩選，再配以傳統(tǒng)的接種鑒定和田間鑒定，才能準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)一個(gè)種質(zhì)。