李永洪，李傳旭，劉成元，何 珊，向箭宇，謝 戎*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所/農(nóng)業(yè)部西南水稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家水稻改良中心瀘州分中心，四川 德陽(yáng) 618000;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070)

【研究意義】水稻葉片是光合作用最重要的器官，其發(fā)育形態(tài)和葉綠素含量直接決定了產(chǎn)量的高低，水稻產(chǎn)量的90% ～95%來(lái)自于葉片的光合作用產(chǎn)物［1］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人研究表明，葉綠素是植物吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換光能最主要的色素，在一定范圍內(nèi)，葉綠素含量和光合速率呈正相關(guān)關(guān)系，而光合速率的高低又直接決定了產(chǎn)量的高低［2－5］。由于氮素是葉綠素的主要組成部分，氮肥不足，葉綠素含量低，造成葉片短小，從而導(dǎo)致減產(chǎn)。但過(guò)多的施用氮肥導(dǎo)致氮素利用率較低，不僅加大農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，也帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題［6－8］。因此，在不影響產(chǎn)量和品質(zhì)的前提下控制化學(xué)肥料的施用量，提高肥料的利用效率，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的必然要求。葉片葉綠素含量的差異，反應(yīng)了不同基因型對(duì)氮素的吸收狀況與葉綠素合成效率的差異，也有利于與氮素吸收相關(guān)基因的發(fā)掘。實(shí)際生產(chǎn)和研究工作中，常用葉綠素含量的高低來(lái)衡量植株?duì)I養(yǎng)水平，光合作用能力和逆境脅迫狀況［9－10］。與水稻許多農(nóng)藝性狀一樣，水稻葉片葉綠素含量也是數(shù)量性狀。近年來(lái)，不同研究者利用不同遺傳群體對(duì)水稻葉片葉綠素含量QTL進(jìn)行大量的定位研究，為闡明葉綠素的分子遺傳機(jī)制和高光效育種奠定了基礎(chǔ)。目前定位出的葉綠素含量相關(guān) QTL較多，但被克隆的卻較少。qLSCHL4是一個(gè)控制葉形和葉綠素含量的主效QTL(qLSCHL4)，圖位克隆和表達(dá)分析表明qLSCHL4是NAL1的等位基因，不僅控制葉形和葉綠素含量，還影響每穗粒數(shù)，屬一因多效［11］。研究發(fā)現(xiàn)Ghd7是自然變異控制葉綠素含量的主效QTL，Ghd7負(fù)向調(diào)節(jié)葉綠素含量［12］。一個(gè)在低氮條件下影響葉綠素含量的主效QTLqFCC7L，可能與水稻耐低氮脅迫能力有關(guān)，并將其定位在第7染色體長(zhǎng)臂124.5 kb的區(qū)間內(nèi)，對(duì)其候選基因分析表明，小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsPRT4(LOC-Os07g41250)最有可能與qFCC7L有關(guān)，雙親在候選基因上存在序列變異和基因表達(dá)量的差異，OsPRT4主要在葉片和根中表達(dá)，這也與推測(cè)其具有吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)氮素的能力相符合［13］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究小組發(fā)掘的秈稻種質(zhì)A232，中抗多種水稻害蟲(chóng)［14］。利用該材料進(jìn)行抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)育研究是本研究團(tuán)隊(duì)近年來(lái)的主要研究?jī)?nèi)容之一。本研究擬利用“崗46B/A232”重組自交系群體，進(jìn)行不同年度及不同葉位葉片葉綠素含量的QTLs分析，【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以期為水稻高光效育種提供新的基因資源，為抗蟲(chóng)種質(zhì)A232的雜交轉(zhuǎn)育及組配出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗蟲(chóng)品種提供分子標(biāo)記及指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以崗46B為母本，A232為父本進(jìn)行雜交，按“一粒傳”法構(gòu)建重組自交系［15］，本研究以重組自交系群體的173個(gè)家系和雙親作為試驗(yàn)材料。

1.2 田間試驗(yàn)及葉綠素測(cè)定

田間試驗(yàn)分別于2016，2017年在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所瀘縣福集鎮(zhèn)試驗(yàn)基地進(jìn)行。2年均于當(dāng)年3月20日播種所有試驗(yàn)材料，秧齡25 d左右移栽。每個(gè)家系種植5行，每行10株，株行距為20.0 cm×26.7 cm。分別于分蘗期(5月30日)和抽穗期(7月15日)用便攜式葉綠素儀(SPAD-502.Monito，Japan)測(cè)定兩親本及各家系主莖的倒1、2和3葉葉片的SPAD值。測(cè)量時(shí)，取葉片中部位置重復(fù)測(cè)定3次，每個(gè)家系測(cè)定10片葉，取平均值用于換算該家系葉片葉綠素含量。計(jì)算分蘗期倒1、2和3葉葉綠素含量(分別簡(jiǎn)稱 CTFL、CTSL和CTTL)，抽穗期倒1、2和3葉葉綠素含量(分別簡(jiǎn)稱CHFL、CHSL和CHTL)，葉綠素儀測(cè)定的SPAD值與葉綠素含量之間的換算公式為:Y=0.1285X－0.5656，式中，X為葉綠素儀測(cè)定的SPAD值，Y為葉綠素含量(mg·dm－2)［16］。

1.3 遺傳圖譜構(gòu)建和QTL分析

采用在兩親本間存在差異且?guī)颓逦?30對(duì)SSR引物對(duì)RIL群體株系進(jìn)行基因型分析，構(gòu)建SSR標(biāo)記遺傳連鎖圖譜［15］。利用 ICIM(QTL Ici-Mapping)軟件對(duì)所考查的葉片葉綠素含量性狀進(jìn)行QTLs定位分析，判斷QTL存在的閥值LOD≥2.50。QTL命名方法參照McCouch等提出的方法［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 RIL群體葉綠素含量與產(chǎn)量性狀間的關(guān)系

從表1可見(jiàn)，各葉綠素含量性狀間呈極顯著正相關(guān)，與單穗重直接相關(guān)系數(shù)不大，抽穗期倒3葉葉綠素含量與谷粒厚兩年中均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，分蘗期倒2葉葉綠素含量與谷粒厚兩年中分別呈極顯著和顯著正相關(guān)。其余各葉綠素含量性狀與各粒形性間的相關(guān)性在2017年均不顯著。而在2016年中，分蘗期倒2葉葉綠素含量與千粒重達(dá)顯著正相關(guān)，分蘗期倒3葉葉綠素含量與谷粒厚達(dá)極顯著正相關(guān)，抽穗期倒1葉葉綠素含量與谷粒長(zhǎng)和谷粒長(zhǎng)寬比達(dá)顯著正相關(guān);抽穗期倒2葉葉綠含量與谷粒長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)，與谷粒厚和千粒重呈極顯著正相關(guān)。

2.2 RIL群體及其親本的葉綠素含量性狀的表型變異

由表2可知，在分蘗期和抽穗期2個(gè)生長(zhǎng)階段，2年中雙親頂部三片葉的葉綠素含量存在明顯差異，崗46B高于A232。在RILs群體中，不同家系間葉綠素含量變異范圍較大，上三葉葉綠素含量均存在超親分離，偏度和峰度分析表明，2年上三葉葉綠素含量均表現(xiàn)近正態(tài)的連續(xù)分布，表明葉片葉綠素含量為多基因控制的數(shù)量遺傳，可以進(jìn)行QTL定位分析。

表1 各葉綠素含量性狀與粒形及產(chǎn)量性狀的相關(guān)分析Table 1 Correlation coefficients among chlorophyll contents and grain shape traits and grain yield in the Gang46B/A232 RIL population

表2 親本與重組自交系群體各時(shí)期的葉綠素含量表現(xiàn)與分布Table 2 Phenotypic variation and distribution of chlorophyll content in the RIL population and its parents at different stages

表3 RIL群體葉片葉綠素含量的QTL位置與遺傳效應(yīng)Table 3 Identification of QTL for chlorophyll content of leaf in RIL population and their genetic parameters estimated

2.3 利用復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)葉綠素含量的QTL檢測(cè)

利用完備區(qū)間作圖法對(duì)崗46B/A232的RIL群體進(jìn)行葉綠素含量QTL分析，2016年共檢測(cè)到18個(gè) QTL，分布于第1、2、3、4、5 和7 染色體，LOD 值介于2..59 ～7.49，單個(gè) QTL 分別解釋相應(yīng)性狀變異的5.91% ～38.69%。對(duì)2017年分蘗期和抽穗期調(diào)查的頂部3片葉的葉綠素含量進(jìn)行分析，共檢測(cè)到12個(gè) QTL，分別位于第1、2、3和4染色體上，LOD值介于2.95～4.83，分別解釋葉片葉綠素含量變異的6.83% ～15.69%(表3)。

2016年控制分蘗期和抽穗期倒1、2和3葉葉綠素含量的QTL在第3染色體RM231-RM3392區(qū)間上，而根據(jù)2017年表型值在此區(qū)間上只有抽穗期的倒1葉和倒2葉葉綠素含量QTL被檢測(cè)到。2016年檢測(cè)到在分蘗期和抽穗期控制倒3葉葉綠素含量QTLq16CTLT-3-1和q16CTLH-3-2，位于第3染色體RM3867～RM1230區(qū)間上，但根據(jù)2017年葉綠素表型值，在此區(qū)間上檢測(cè)到的是控制抽穗期倒1葉葉綠含量的QTLq17CFLH-3-2。根據(jù)2016年表型值，在第1染色體RM140-RM493區(qū)間上檢出的有控制分蘗期倒1葉葉綠素含量QTLq16CFLT-1-1、分蘗期倒3葉葉綠素含量QTLq16CTLT-1-1、抽穗期倒1葉葉綠素含量QTLq16CFLH-1-1和抽穗期倒2葉葉綠素含量QTLq16CSLH-1-1，但根據(jù)2017表型數(shù)據(jù)，未能在此區(qū)間檢測(cè)葉綠素含量相關(guān)性狀QTL。在第2染色體 RM1358～RM71區(qū)間，只有2017年的表型值在此區(qū)間上檢出q17CSLT-2-1和q17CTLT-2-1 2個(gè)葉綠素含量相關(guān)QTL。在抽穗期，2016年表型值檢出4個(gè)控制倒三葉葉綠素含量QTL，但根據(jù)2017的表型值卻未能檢測(cè)到控制倒三葉葉綠素含量的QTL。

3 討論

3.1 葉綠素含量與產(chǎn)量

葉綠素是水稻進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，改善葉片葉綠素含量可以提高光合效率，進(jìn)而提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究簡(jiǎn)單相關(guān)分析表明，各葉綠素含量相關(guān)性狀與單穗重并無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系，但其與產(chǎn)量密切相關(guān)的粒形性狀和千粒重呈現(xiàn)出各種復(fù)雜相關(guān)關(guān)系，有的相關(guān)性達(dá)顯著或極顯著水平?？梢?jiàn)，不同葉位葉綠素含量與水稻產(chǎn)量有著密切的關(guān)系［18－19］，并且可能影響稻谷的品質(zhì)。

3.2 本研究定位的葉綠素含量QTL與前人定位結(jié)果的比較

本研究檢測(cè)到的控制分蘗期倒1葉葉綠素含量QTLq17CFLT-3-2(RM5625～RM1350)與孫小霞等檢測(cè)到的葉綠素含量QTLqChl-3c(RM565～RM168)，姜樹(shù)坤等檢測(cè)到的分蘗期葉綠素含量QTLqCT3a(PM380～RM426)染色體位置區(qū)間部分重疊［20－21］。

胡頌平等定位的葉綠素含量QTLqCC3c(RM22～RM231)，范淑秀等定位的葉綠素含量QTLqChla-3b、qChlb-3b、qChlt-3b 和 qChlxc-3b(RM231 ～RM22)與本研究定位到的葉綠素含量相關(guān)QTL區(qū)間(RM231～RM3392)具有相近或相同的染色體位置［22－23］。本研究中，該區(qū)間兩年共有8次被檢出，說(shuō)明該位點(diǎn)上控制葉片葉綠素含量的基因受環(huán)境影響較小，表達(dá)穩(wěn)定。

孫小霞等檢測(cè)到的qChl-4(RM470～RM451)，胡頌平等定位的qCC4b(RM255～RM349)，Jiang等定位的 qCH4，qCM4b和qCTH4(RM255～RM559)及Zhang等定位的qLSCHL4，阿加拉鐵等檢測(cè)到的qCHL4-1(RM280～RM1113)、qCHL4-2(RM255～RM280)與本研究檢測(cè)到的葉綠素含量QTLq17CTLT-4-1(RM280～RM113)和q17CSLH-4-1(RM5473～RM303)具有相同的染色體位置或位置部分重疊［11，20，22，24－25］。

姜樹(shù)坤等定位的 qCH7(RM478～RM429)、qCM7a(RM214)和 qCM7b(RM18～RM429)區(qū)間，范淑秀等定位的 qChla-7、qChlb-7、qChlt-7和qChlxc-7(RM18～RM118)區(qū)間，Ye等定位的在低氮條件影響頂三葉葉綠素含量的主效QTLqFCC7L均位于本研究檢測(cè)到的q16CFLH-7-2(RM21253～RM248) 區(qū)間上［13，21，23］。本研究中，該位點(diǎn)只在2016年表型值中被檢測(cè)到，且其遺傳效應(yīng)值較大，該位點(diǎn)的表達(dá)是否受低氮條件的影響，需進(jìn)一步確認(rèn)。

3.3 葉綠素含量QTL的多樣性及表達(dá)的穩(wěn)定性

定位用的遺傳群體、分子標(biāo)記種類及QTL作圖方法的不同，以及性狀值受環(huán)境條件影響等因素，前人對(duì)水稻葉片葉綠素含量QTL定位研究結(jié)果差異較大。目前定位出的葉綠素含量相關(guān)QTL較多，但被克隆的卻較少。有研究表明，不同生長(zhǎng)階段和不同葉位葉綠素QTL的表達(dá)表現(xiàn)出明顯特異性，如QTLqFCC7L在始穗期低氮條件影響頂三葉葉綠素含量，在抽穗期低氮條件下也控制倒一和倒三葉葉綠素含量［13］。本研究定位在第3染色體RM5625～RM1350區(qū)段和RM231～RM3392區(qū)段，第4染色體RM280～RM1113區(qū)段和RM5473～RM303區(qū)段，第7染色體RM21253～RM248區(qū)段的葉綠素含量QTL位點(diǎn)與前人研究結(jié)果一致［11，13，20－25］，說(shuō)明這些區(qū)間上的QTLs受環(huán)境影響較小，在水稻不同生長(zhǎng)階段能穩(wěn)定表達(dá)，有利于提高葉片葉綠素含量，增強(qiáng)光合作用，從而能提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)。