何士成, 孫曼鈺, 孫忠?guī)r, 舒月力, 賈士儒, 鐘 成

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457)

HE Shicheng

蒸汽爆破與堿法協(xié)同預(yù)處理對小麥秸稈結(jié)構(gòu)及酶解的影響

何士成, 孫曼鈺, 孫忠?guī)r, 舒月力, 賈士儒, 鐘 成*

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457)

以小麥秸稈為原料，采用蒸汽爆破預(yù)處理(SP)、堿法預(yù)處理(AP)以及兩者協(xié)同預(yù)處理的方式分別進行預(yù)處理，通過掃描電鏡(SEM)和傅里葉紅外光譜(FT-IR)等方法，分析了預(yù)處理前后麥稈形態(tài)和化學(xué)成分的變化規(guī)律，研究了堿處理與蒸汽爆破的不同組合對麥稈成分及后續(xù)酶解的影響。研究表明：相比先堿法后蒸汽爆破預(yù)處理(ASP)，先蒸汽爆破后堿法預(yù)處理(SAP)的麥稈中纖維素質(zhì)量分數(shù)高達88.15%，半纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)分別減少到5.55%和4.13%。SEM和FT-IR分析結(jié)果及低底物濃度酶解結(jié)果表明，與其他預(yù)處理方法相比，SAP對麥稈的物理結(jié)構(gòu)破壞程度更大，對木質(zhì)素的去除效果更顯著，纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率也明顯優(yōu)于其他預(yù)處理樣品。以分批補料的手段對各預(yù)處理后麥稈進行高底物濃度酶解，SAP樣品在底物質(zhì)量濃度高達180 g/L時，酶解120 h,纖維素轉(zhuǎn)化率可達80.53%。蒸汽爆破與堿處理的不同組合方式對麥稈的預(yù)處理效果不同，SAP的方法能極大的提高麥稈的酶解效率。

堿法預(yù)處理；蒸汽爆破預(yù)處理；麥稈；酶解

用化石原料作為能源，以及生產(chǎn)許多有益的產(chǎn)品是人類歷史上的一個偉大的發(fā)現(xiàn)[1]。然而，由于化石原料是一種不可再生資源，難以滿足日益增長的能源需求，近年來迫切需要尋求一種可再生的替代能源[2]。木質(zhì)纖維原料是一種極具潛力的可再生生物質(zhì)資源[3]，僅2015年全球小麥的產(chǎn)量就達250萬噸[4]。大部分小麥秸稈(麥稈)被直接燃燒處理，既浪費了資源也污染了環(huán)境。因此通過適當(dāng)?shù)姆椒▽Ⅺ湺捹Y源化利用具有極其重要的意義。木質(zhì)纖維原料是一種高度結(jié)晶、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的超分子聚合物，主要由約40%～50%的纖維素、15%～30%的半纖維素以及15%～30%的木質(zhì)素組成[5]。在植物細胞壁中，木質(zhì)素填充于纖維素和半纖維素之間，通過氫鍵和共價鍵與糖類聚合物連接在一起[6]。這種結(jié)構(gòu)嚴重阻礙了纖維素的降解，合適的預(yù)處理過程，是打破這種抗性的有效手段。常用的預(yù)處理方法有物理法、化學(xué)法和物理化學(xué)法等，其中堿法預(yù)處理是一種備受關(guān)注的化學(xué)預(yù)處理方法，堿法預(yù)處理可有效去除原料中的部分木質(zhì)素，提高纖維素酶的可及性；而蒸汽爆破預(yù)處理方法是一種常用的物理化學(xué)方法，該方法能夠有效去除半纖維成分，破壞木質(zhì)纖維原料的物理結(jié)構(gòu)。單一的預(yù)處理方法對木質(zhì)纖維原料的預(yù)處理效果往往不是很令人滿意。Zhu等[7]曾將蒸汽爆破和堿性過氧化氫(AHP)方法結(jié)合預(yù)處理杜仲，預(yù)處理后的杜仲中葡聚糖、木聚糖和木質(zhì)素的質(zhì)量分數(shù)分別約為82%、1.7%和2.4%，酶解轉(zhuǎn)化率最高達91.69%。本研究將堿法與蒸汽爆破法聯(lián)合，重點研究了兩種方法的不同組合方式對麥稈中三大素組成的影響，并對預(yù)處理后的麥稈進行酶解，旨在為麥稈高效資源化利用提供參考數(shù)據(jù)。

1 實 驗

1.1原料、試劑與儀器

麥稈來自山東省棗莊市，自然風(fēng)干，剪成2～3 cm小段，粉碎后過篩，選取粒徑≤0.83 mm的原料作為未處理麥稈(UW)樣品。

纖維素酶(43.21 FPU/mL)，湖南尤特爾生物試劑有限公司;β-葡萄糖苷酶(372 IU/mL)、木聚糖酶(250 IU/mL)、D(+)-葡萄糖、D-(+)-木糖和L-(+)-阿拉伯糖標準品,Sigma公司；其余試劑均為市售分析純。

FZ102微型植物粉碎機；JSM-IT300掃描電鏡(SEM)；BRUCKER傅里葉紅外光譜(FT-IR)儀；Agilent1200高效液相色譜(HPLC)儀。

1.2麥稈預(yù)處理

1.2.1堿法預(yù)處理(AP) 將剪成小段的100 g麥稈與0.1 mol/L NaOH溶液按料液比1∶20(g:mL)混合，于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃預(yù)處理1 h。預(yù)處理后的樣品經(jīng)過紗布過濾，并用大量的去離子水洗滌至洗液呈中性，過濾，棄去上清液，保留固體殘渣，待晾干后粉碎并過篩，取粒徑≤0.83 mm部分備用。

1.2.2蒸汽爆破預(yù)處理(SP) 取剪成小段的麥稈200 g，于5 L反應(yīng)罐中進行蒸汽爆破處理，蒸汽壓力2.2 MPa，保壓時間5 min。蒸汽爆破預(yù)處理后的麥稈用大量的去離子水洗滌至洗液呈中性，過濾，棄去上清液，保留固體殘渣，待晾干后粉碎并過篩,取粒徑≤0.83 mm部分備用。

1.2.3堿法-蒸汽爆破協(xié)同預(yù)處理(ASP) 麥稈經(jīng)1.2.1節(jié)堿處理后再經(jīng)過蒸汽爆破預(yù)處理，預(yù)處理后的麥稈用大量的去離子水洗滌至洗液呈中性，過濾，棄去上清液，保留固體殘渣，待晾干后粉碎并過篩，取粒徑≤0.83 mm部分備用。

1.2.4蒸汽爆破-堿法協(xié)同預(yù)處理(SAP) 麥稈經(jīng)過1.2.2節(jié)蒸汽爆破預(yù)處理后再經(jīng)過堿法預(yù)處理，預(yù)處理后的麥稈用大量的去離子水洗滌至中性，過濾，棄去上清液，保留固體殘渣，待晾干后粉碎并過篩，取粒徑≤0.83 mm部分備用。

1.3不同預(yù)處理對麥稈酶解的影響

1.3.1酶解實驗及酶解效率 酶解反應(yīng)的總體積為20 mL，在100 mL的三角瓶中進行。酶解實驗所使用的底物分別為UW、AP、SP、ASP和SAP；底物質(zhì)量濃度(以纖維素質(zhì)量計，下同)為10 g/L;纖維素酶用量為15FPU/g(以纖維素質(zhì)量計，下同)，β-葡萄糖苷酶用量為129 IU/g，木聚糖酶用量為 87 IU/g；反應(yīng)溫度50 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min。

在酶解過程中取樣，用HPLC測酶解液中的糖質(zhì)量濃度，并計算纖維素的轉(zhuǎn)化率(YC)和木聚糖的轉(zhuǎn)化率(YX)。

式中：cg—酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，g/L；cX—酶解液中木糖的質(zhì)量濃度，g/L；V—酶解液體積，mL；mg—酶解初始條件下纖維素的質(zhì)量，g；mX—酶解初始條件下木聚糖的質(zhì)量，g。

1.3.2初次補料時間的確定 初始底物質(zhì)量濃度為40 g/L，纖維素酶添加量為35 FPU/g時。各批次樣品分別在酶解6、12和24 h進行第一次補料。補加底物的量為初始底物質(zhì)量濃度的一半，同時補加相應(yīng)體積的酶，其他實驗條件同1.3.1節(jié)。

2.2 入院血常規(guī)檢測 入院當(dāng)天行血常規(guī)檢查，死亡組白細胞、紅細胞、血紅蛋白均低于存活組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

1.3.3分批補料酶解 分別在酶解進行6、12和24 h各補加底物一次，之后再每間隔24 h補加底物一次。每次補料后使體系中底物質(zhì)量濃度依次增加20 g/L，同時補加相應(yīng)體積的酶。其他實驗條件同1.3.1節(jié)。

1.4預(yù)處理前后麥稈的結(jié)構(gòu)和成分分析

1.4.1掃描電鏡(SEM)分析 用掃描電鏡觀察預(yù)處理前后麥稈的表面結(jié)構(gòu)。樣品觀察前先噴金處理，電壓5～15 kV。

1.4.2紅外光譜(FT-IR)分析 用傅里葉紅外光譜儀測定AP、SP、ASP和SAP這4種預(yù)處理前后麥稈的成分變化，儀器分辨率4 cm-1，波數(shù)范圍400～4000 cm-1，掃描次數(shù)16次，樣品處理采用KBr壓片法。

1.4.3成分分析 預(yù)處理前后麥稈中的纖維素、半纖維素(木聚糖)和酸不溶性木質(zhì)素的含量參照美國可再生能源實驗室(NREL)的實驗方法進行測定[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1不同預(yù)處理方式對麥稈結(jié)構(gòu)和成分的影響

2.1.1麥稈組成成分 如表1所示，與未處理麥稈(UW)相比，堿法預(yù)處理(AP)去除了近15個百分點的木質(zhì)素和少許半纖維素，使纖維素質(zhì)量分數(shù)提高到65.08%。只進行蒸汽爆破預(yù)處理(SP)時，原料中半纖維素的質(zhì)量分數(shù)下降十分明顯，由27.77%下降到3.49%，使得纖維素和木質(zhì)素的含量均相應(yīng)升高。根據(jù)文獻報道，木質(zhì)纖維原料在蒸汽爆破過程中會由于高溫的作用導(dǎo)致半纖維素降解[9]，半纖維素成分被去除后，纖維素的比表面積增加，進而提高纖維素酶的可及性，同時高溫過程也會引起纖維素成分的部分降解[10]。然而，高溫下由于木質(zhì)素會重新分布在纖維表面使得蒸汽爆破對原料中木質(zhì)素的去除效果不明顯[11]。與單獨堿法預(yù)處理相比，ASP只去除了原料中少量的半纖維素，木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)反而稍微提高約4個百分點?？赡苁窃诮?jīng)過堿處理后，原料顆粒內(nèi)部間隙中部分堿中和了蒸汽爆破過程中半纖維素乙?；纬傻囊宜幔瑥亩魅趿擞袡C酸對半纖維素的降解作用。

表1 不同方法預(yù)處理后麥稈主要成分含量Table 1 Compositional contents in wheat strawpretreated by different pretreatment methods

1) UW:未處理麥稈untreated wheat straw; AP:堿法預(yù)處理alkaline pretreatment; SP:蒸汽爆破預(yù)處理steam explosion pretreatment； ASP: 堿法-蒸汽爆破協(xié)同預(yù)處理pretreatment of alkali-steam explosion； SAP: 蒸汽爆破-堿法協(xié)同預(yù)處理pretreatment of steam explosion-alkali

據(jù)相關(guān)研究報道，堿法預(yù)處理可使木質(zhì)纖維原料中木質(zhì)素和半纖維素之間的分子間酯鍵發(fā)生皂化反應(yīng)，使得纖維素、半纖維素和木質(zhì)素間的交叉連接作用減弱，從而使木質(zhì)纖維原料的孔隙度增加[14]。堿法預(yù)處理可使纖維素膨脹，聚合度下降，增大纖維素比表面積，使木質(zhì)素和碳水化合物之間的連接斷裂，破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)[15]。因此，經(jīng)過堿法預(yù)處理后，大部分的木質(zhì)素被去除。實驗證明，在半纖維素和木質(zhì)素成分去除方面，SAP的效果要優(yōu)于ASP的效果。

2.1.2SEM分析 預(yù)處理前后麥稈樣品的SEM圖片見圖1。

圖1 不同方法預(yù)處理前后麥稈SEM圖片

圖2 不同方法預(yù)處理后麥稈FT-IR圖譜Fig.2 FT-IR spectra of wheat straws pretreated by different pretreatment methods

從圖1可以看出，堿法預(yù)處理(AP)的麥稈樣品表面仍比較光滑致密，物理形態(tài)變化不大，堿處理主要去除了樣品中的木質(zhì)素成分；相比之下，經(jīng)蒸汽爆破預(yù)處理(SP)麥稈樣品的物理結(jié)構(gòu)變化較大；經(jīng)過蒸汽爆破處理后又經(jīng)過堿處理(SAP)的麥稈樣品物理結(jié)構(gòu)變化更顯著，該組合預(yù)處理方法對麥稈物理結(jié)構(gòu)的破壞作用更大，表面褶皺更明顯，有的只留下一些網(wǎng)狀的物理結(jié)構(gòu)，結(jié)合成分分析的結(jié)果，該組合預(yù)處理方法去除了樣品中大部分的半纖維素和木質(zhì)素成分，被保留下來的主要是纖維素成分。相比SP的麥稈樣品，ASP的麥稈樣品的物理結(jié)構(gòu)變化不明顯；與SAP的麥稈樣品相比，ASP預(yù)處理的效果似乎并不理想。蒸汽爆破過程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)使半纖維素解聚，堿法預(yù)處理后麥稈中殘留的堿中和了蒸汽爆破過程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)，使得預(yù)處理效果變差。

從FT-IR分析結(jié)果也可以得出，SAP無論是對纖維素的保留還是對半纖維素和木質(zhì)素的去除都表現(xiàn)出較優(yōu)的效果。

圖3 不同預(yù)處理對麥稈酶解效果的影響Fig.3 The effect of different pretreatments on enzymatic hydrolysis of wheat straw

2.2不同預(yù)處理方式對麥稈酶解的影響

2.2.1酶解效率 預(yù)處理前后的麥稈在底物質(zhì)量濃度 10 g/L 的條件下酶解結(jié)果見圖3。由圖可知，經(jīng)過各種預(yù)處理后的麥稈樣品的纖維素轉(zhuǎn)化率均顯著高于未處理麥稈。然而，SAP處理之后的麥稈對應(yīng)的纖維素轉(zhuǎn)化率又明顯優(yōu)于其他預(yù)處理，酶解72 h時，SAP樣品的纖維素轉(zhuǎn)化率約75%，且仍有緩慢升高的趨勢；而經(jīng)過AP、ASP和SP這3種方式預(yù)處理的麥稈在酶解24 h后，纖維素的轉(zhuǎn)化率已趨于平穩(wěn)，SAP樣品纖維素的轉(zhuǎn)化率較高得益于SAP去除了絕大部分的半纖維素和木質(zhì)素，使纖維素酶的可及性提高，酶解效率提高。

2.2.2初次補料時間 在初始底物質(zhì)量濃度40 g/L和酶用量35FPU/g的基礎(chǔ)上，以SAP為底物，采用分批補料進行酶解，初次補加底物的量為初始底物質(zhì)量濃度的一半。初次補料時間對酶解效果的影響見圖4。

圖4 不同初次補料時間下的酶解效果

從纖維素轉(zhuǎn)化率來看，在每次補料后纖維素的轉(zhuǎn)化率都要經(jīng)過一個減緩過程，這是由于底物的加入使得酶解體系中的固體含量升高，酶解效果降低。另外，新加入的底物原料需要一段時間才能轉(zhuǎn)化出對應(yīng)的單糖產(chǎn)物，因此使酶解轉(zhuǎn)化率增長緩慢。從葡萄糖質(zhì)量濃度的增長趨勢也可以看出，在每次補加底物之后，糖質(zhì)量濃度較其它組有明顯的增長，而增加的這部分糖質(zhì)量濃度來源于新補加進底物的轉(zhuǎn)化，在酶解進行48～72 h時，各體系中單糖質(zhì)量濃度和轉(zhuǎn)化率已基本一致。為了縮短酶解的總時間，可考慮增加補料次數(shù)以提高酶解體系最終固體含量，故選擇6 h作為初次補料的時間。

圖5 分批補料酶解過程中酶解時間與纖維素轉(zhuǎn)化率的關(guān)系Fig.5 The relationship between time and the conversion of cellulose in the process of fed batch enzymatic hydrolysis

2.2.3分批補料酶解 為了評價各種預(yù)處理方法得到的樣品在分批酶解過程中效果的差異，分別在酶解進行6、12和24 h各補加底物一次，之后再每間隔24 h補加底物一次。每次補料后使體系中底物質(zhì)量濃度依次增加20 g/L，同時補加相應(yīng)體積的酶，實驗結(jié)果如圖5所示。AP樣品的纖維素轉(zhuǎn)化率明顯低于其他預(yù)處理樣品，這是因為AP樣品中保留的半纖維素和木質(zhì)素成分較多，隨著底物質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，隨之引入過多的半纖維素和木質(zhì)素成分，加之酶解體系中固體增加，酶解體系的黏滯阻力增大，使得酶解效率降低。而SP樣品保留了過多的木質(zhì)素，補料的同時會引起較多的木質(zhì)素積聚，過多積累的木質(zhì)素又會造成酶的無效吸附，所以使得AP、SP樣品在酶解72 h時，即底物質(zhì)量濃度為 140 g/L 時，接下來的補料過程使酶解體系呈現(xiàn)固體狀態(tài)，無法進行后續(xù)的酶解過程。類似的原因，ASP樣品在酶解96 h后，無法進行后續(xù)的酶解。然而，經(jīng)過SAP預(yù)處理后，麥稈中的半纖維素和木質(zhì)素基本被去除，纖維素的質(zhì)量分數(shù)高達88%以上，酶解進行120 h時，酶解體系仍然呈現(xiàn)明顯的流體狀態(tài)，纖維素轉(zhuǎn)化率達到80.53%，此時仍然具備繼續(xù)補料酶解的條件。以上實驗證明，SAP樣品更適合進行高底物質(zhì)量濃度的酶解，為產(chǎn)生高濃度的可發(fā)酵糖提供有利條件。

3 結(jié) 論

3.1SAP樣品的纖維素、半纖維素(木聚糖)和木質(zhì)素的質(zhì)量分數(shù)分別為88.15%、5.55%和4.13%，表明SAP可以有效脫除木質(zhì)素，得到纖維素含量高的木質(zhì)纖維原料。

3.2在底物質(zhì)量濃度(以纖維素質(zhì)量計，下同)為10 g/L的酶解過程中，SAP樣品的酶解效率明顯高于其他預(yù)處理后樣品，表明SAP可有效增強預(yù)處理后麥稈的酶解效率。

3.3在高底物質(zhì)量濃度分批補料酶解過程中，酶解120 h時SAP樣品的底物質(zhì)量濃度可達到180 g/L，纖維素轉(zhuǎn)化率達到80.53%，酶解體系仍呈流體狀態(tài)，仍然具有繼續(xù)補料酶解的條件，表明SAP樣品更適合高底物質(zhì)量濃度的酶解，且為獲得高濃度可發(fā)酵糖提供有利條件。

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The Effect of Integrated Processes of Steam Explosion and Alkaline Pretreatment on the Structure of Wheat Straw and Its Enzymatic Hydrolysis

HE Shicheng, SUN Manyu, SUN Zhongyan, SHU Yueli, JIA Shiru, ZHONG Cheng

(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China)

Various combined processes of steam explosion and alkaline pretreatment were experimentally compared and evaluated on wheat straw materials. The morphological characterizations of pretreated wheat straw were performed by scanning electron microscope and FT-IR spectroscopy, to qualitatively determine the composition changes of pretreated wheat straw. Comparing to the single process or the combination of alkaline pretreatment followed by steam explosion(ASP), the steam explosion followed by alkaline process(SAP) pretreatment removed most of lignin, degraded hemicelluloses, and incurred a higher surface area of the cellulose-rich substrates. And the remaining contents of cellulose, xylan and lignin in SAP sample were 88.15%, 5.55%, 4.13%, respectively. Moreover, SAP enhanced the fed batch enzymatic hydrolysis of cellulose-rich substrates to a maximum value of 80.53% even at the high cellulose loading of 18%. The results indicated that the SAP process is advantageous scheme for the enhancement of enzymatic efficiency.

alkaline pretreatment；steam explosion pretreatment；wheat straw；enzymatic hydrolysis

2017- 01- 07

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201503135-15)

何士成(1991— ),男,山東棗莊人，碩士生，主要從事木質(zhì)纖維素預(yù)處理及酶解研究

*通訊作者：鐘 成，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事纖維素的生物合成代謝與降解機理研究；E-mail: czhong@tust.edu.cn。

10.3969/j.issn.0253-2417.2017.05.017

TQ35

A

0253-2417(2017)05- 0126- 07

何士成,孫曼鈺,孫忠?guī)r,等.蒸汽爆破與堿法協(xié)同預(yù)處理對小麥秸稈結(jié)構(gòu)及酶解的影響[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2017，37(5)：126 - 132.