孟 迪 ， 梁 震 ， 趙丹慧

(1.北京市創(chuàng)傷骨科研究所 ， 北京 西城 100035 ； 2.北京積水潭醫(yī)院 ， 北京 西城 100035))

3種麻醉方法在小鼠骨科研究中的效果比較

孟 迪1,2， 梁 震1,2， 趙丹慧1,2

(1.北京市創(chuàng)傷骨科研究所 ， 北京 西城 100035 ； 2.北京積水潭醫(yī)院 ， 北京 西城 100035))

目的：比較三種麻醉方法對(duì)C57BL/6小鼠的麻醉效果，分析不同方法在骨科研究中的應(yīng)用價(jià)值。方法：將45只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為A組(復(fù)方氯胺酮組)、B組(戊巴比妥鈉組)、C組(舒泰聯(lián)合多咪靜組)，比較3組的麻醉制動(dòng)時(shí)間、誘導(dǎo)期、麻醉期、蘇醒期以及麻醉深度和死亡率。結(jié)果：A組和C組麻醉期較短，C組較A組誘導(dǎo)期短，麻醉效果好，死亡率為0，安全可靠，但蘇醒期較長(zhǎng)；B組誘導(dǎo)期及麻醉期均較長(zhǎng)，麻醉效果一般，死亡率最高。結(jié)論：C組可作為操作時(shí)間較短的骨科手術(shù)的最佳麻醉方案，B組可作為操作時(shí)間較長(zhǎng)的骨科手術(shù)的麻醉選擇。

小鼠 ； 骨科 ； 麻醉效果

小鼠因其基因組與人類高度同源、易于繁殖和飼養(yǎng)、便于遺傳操作等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于人類疾病研究的動(dòng)物模型。C57BL/6小鼠常被認(rèn)作是“標(biāo)準(zhǔn)”的近交系，在探究基因功能、探尋疾病發(fā)病機(jī)制等方面發(fā)揮重要作用，近年來(lái)逐步成為骨科研究中不可或缺的工具。在骨科手術(shù)動(dòng)物模型中，麻醉效果直接影響到實(shí)驗(yàn)成功與否，以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)可靠性。而小鼠因體格較小，對(duì)麻醉和止痛藥的敏感性多變等問題，在麻醉和止痛方面存在巨大挑戰(zhàn)[1]。氯胺酮和戊巴比妥鈉是目前國(guó)內(nèi)比較常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉藥，但其應(yīng)用存在諸多問題。舒泰和多咪靜為新型麻醉藥，兩者聯(lián)合用藥近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于小動(dòng)物臨床麻醉，然而其對(duì)小鼠的麻醉效果尚有待研究。本文通過對(duì)上述3種麻醉藥對(duì)C57BL/6小鼠的麻醉效果進(jìn)行比較，分析不同方法在骨科手術(shù)中的應(yīng)用價(jià)值，旨在為相關(guān)學(xué)科的科研工作者提供麻醉參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠45只，10周齡，體重25±2g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2013-0011]。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于北京積水潭醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)屏障設(shè)施[SYXK(京) 2012-0027]，IVC籠內(nèi)自由攝食和飲水，飼養(yǎng)溫度為(25±2)℃，濕度為(55±5)%，12小時(shí)晝夜明暗交替。

1.2 試驗(yàn)藥品 復(fù)方氯胺酮注射液(2 mL：0.3 g)，批號(hào)為獸藥字(2011)060022095，沈陽(yáng)市獸藥廠生產(chǎn)；戊巴比妥鈉，批號(hào)為WS20060401，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；舒泰(Zoletil?50)，法國(guó)維克制藥股份有限公司生產(chǎn)；多咪靜(DEXDOMITOR?)，美國(guó)輝瑞(動(dòng)物保健品)有限公司生產(chǎn)；0.9%氯化鈉注射液，批號(hào)H11021192，華潤(rùn)雙鶴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；藥品均用無(wú)菌氯化鈉注射液配制或稀釋至試驗(yàn)所需濃度。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組，15只/組。經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)初步摸索后，確定各組麻藥的使用濃度。A組(復(fù)方氯胺酮組)：按照90 mg/kg體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉。B組(戊巴比妥鈉組)：用0.9%氯化鈉注射液配制濃度為3%戊巴比妥鈉，按照60 mg/kg體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉。C組(舒泰聯(lián)合多咪靜組)：按照舒泰10 mg/kg體重聯(lián)合多咪靜0.1 mg/kg體重的劑量進(jìn)行肌肉注射麻醉。

1.3.2 常規(guī)觀察指標(biāo) 整個(gè)麻醉期間密切觀察小鼠的呼吸、心跳、體溫等生命體征變化，肢體運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、步態(tài)、流涎、肌顫等行為變化。記錄各組的小鼠死亡率。

1.3.3 時(shí)間相關(guān)麻醉監(jiān)測(cè)指標(biāo) 如圖1所示，麻藥注射完畢后即開始計(jì)時(shí)，記錄翻正反射消失時(shí)間，翻正反射恢復(fù)時(shí)間，計(jì)算制動(dòng)時(shí)間(制動(dòng)時(shí)間=翻正反射恢復(fù)時(shí)間-翻正反射消失時(shí)間)。根據(jù)小鼠不同的臨床表現(xiàn)，又將制動(dòng)時(shí)間分為誘導(dǎo)期、麻醉期和蘇醒期(見表1)，誘導(dǎo)期指小鼠失去翻正反射至出現(xiàn)麻醉狀態(tài)的時(shí)間，麻醉期指小鼠出現(xiàn)麻醉臨床表現(xiàn)至出現(xiàn)復(fù)蘇反應(yīng)的時(shí)間，蘇醒期指有復(fù)蘇反應(yīng)至翻正反射恢復(fù)的時(shí)間。

圖1 時(shí)間相關(guān)麻醉監(jiān)測(cè)指標(biāo)

1.3.4 麻醉深度監(jiān)測(cè)指標(biāo) 為評(píng)估小鼠麻醉的深度，參照Sumiko等[2]的方法，使用如下4個(gè)刺激參數(shù)：(1)夾尾反射：無(wú)損傷鑷子輕輕鉗夾近尾端(避開血管)；(2)前肢趾蹼反射：無(wú)損傷鑷子輕輕鉗夾并牽拉前肢趾間組織；(3)后肢趾蹼反射：無(wú)損傷鑷子輕輕鉗夾并牽拉后肢趾間組織；(4)角膜反射：2 mL巴氏滴管輕吹角膜。小鼠對(duì)刺激存在反應(yīng)記為0分，無(wú)反應(yīng)記為1分。翻正反射消失后的第3、5、10、20 min分別給予上述刺激一次，每個(gè)刺激參數(shù)分別計(jì)分，每只小鼠的麻醉深度由4項(xiàng)刺激的得分總和評(píng)估。3分及以上說(shuō)明達(dá)到手術(shù)麻醉要求。

表1 時(shí)間相關(guān)麻醉監(jiān)測(cè)指標(biāo)的小鼠臨床表現(xiàn)

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)觀察 參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，最終確定各組麻醉藥物的使用劑量，正式實(shí)驗(yàn)共納入45只小鼠，A組死亡率6.7%，B組死亡率為13.3%，C組無(wú)死亡個(gè)體。未死亡小鼠在麻醉過程中均呼吸平穩(wěn)，體溫略有降低，可達(dá)到適宜手術(shù)操作的麻醉深度，且完全蘇醒后未出現(xiàn)異常反應(yīng)。

2.2 麻醉時(shí)間比較 時(shí)間相關(guān)麻醉監(jiān)測(cè)指標(biāo)結(jié)果如表2所示：與A組和B組相比，C組翻正反射消失時(shí)間和麻醉誘導(dǎo)期明顯縮短(P<0.01)；A組和C組有效麻醉持續(xù)時(shí)間(麻醉期)差異不顯著，時(shí)長(zhǎng)均顯著少于B組(P<0.01)；翻正反射恢復(fù)時(shí)間、制動(dòng)時(shí)間和麻醉蘇醒期三組間均差異極顯著(P<0.01)。

2.3 麻醉深度比較 三組小鼠的麻醉深度刺激評(píng)分結(jié)果如圖2所示：A組和B組翻正反射消失后3 min的評(píng)分均小于3分(即未達(dá)到手術(shù)麻醉要求)，且顯著低于C組(P<0.01)；A組和C組翻正反射消失后5 min的評(píng)分均大于3分，但C組評(píng)分顯著高于A組(P<0.05)，B組翻正反射消失后5 min的評(píng)分仍小于3分，與C組間差異極顯著(P<0.01)；三組翻正反射消失后10 min的評(píng)分均高于3分，且無(wú)顯著性差異；翻正反射消失后20 min，A組和C組評(píng)分低于3分，動(dòng)物已進(jìn)入蘇醒，B組此時(shí)評(píng)分仍高于3分，麻醉持續(xù)時(shí)間較A組和C組明顯延長(zhǎng)。

3 討論

在骨科相關(guān)的研究中，動(dòng)物模型常常需要進(jìn)行

組別翻正反射消失時(shí)間翻正反射恢復(fù)時(shí)間制動(dòng)時(shí)間誘導(dǎo)期麻醉期蘇醒期A組2．38±0．67A45．73±4．60A43．35±4．29A2．82±1．26A19．60±4．12A20．93±1．35AB組2．94±0．74A91．56±9．86B88．61±9．61B3．55±0．66A58．50±4．40B26．56±6．95BC組1．01±0．32B80．34±6．82C79．94±6．82C1．34±0．57B22．05±2．36A56．56±6．25C

注：同列標(biāo)有不同大寫字母者表示組間差異極顯著(P<0.01)；標(biāo)有相同大寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)

圖2 三組小鼠麻醉深度比較(注：與C組比較，*：P<0.05；**：P<0.01)

復(fù)雜的外科手術(shù)，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的麻醉要求較高。理想的骨科麻醉應(yīng)該做到[3]：(1)誘導(dǎo)期短，麻醉持續(xù)時(shí)間能滿足手術(shù)順利完成；(2)麻醉過程中呼吸、心跳平穩(wěn)，肌肉松弛；(3)鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)，整個(gè)手術(shù)過程中動(dòng)物無(wú)躁動(dòng)；(4)蘇醒期短，術(shù)后無(wú)異常反應(yīng)，死亡率低。效果良好的麻醉不僅是保證試驗(yàn)順利完成的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而且還滿足了國(guó)際上日益關(guān)注的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理道德相關(guān)要求[4]。小鼠由于體格較小、藥物代謝和排泄及其迅速、極易發(fā)生體溫和血糖過低等原因，導(dǎo)致其麻醉存在巨大挑戰(zhàn)[5]。本試驗(yàn)旨在摸索適合C57BL/6小鼠骨科手術(shù)模型的麻醉?xiàng)l件，為相關(guān)研究提供客觀的參考數(shù)據(jù)。

氯胺酮和戊巴比妥鈉是目前國(guó)內(nèi)比較常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉藥[6]。氯胺酮(Ketamine)是苯環(huán)己哌啶的衍生物，屬N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑，是一種非巴比妥類全麻藥，可發(fā)揮“分離性麻醉”作用。氯胺酮具有起效快、鎮(zhèn)痛強(qiáng)、蘇醒快等優(yōu)點(diǎn)[7]。然而，近年來(lái)氯胺酮在娛樂場(chǎng)所的濫用問題日益嚴(yán)重，已被國(guó)家列為管控藥品，購(gòu)買困難，不易獲得。此外，對(duì)于嚙齒類動(dòng)物，氯胺酮的有效麻醉劑量存在顯著的呼吸抑制，致死率極高[1]。戊巴比妥鈉(Pentobarbital Sodium)為長(zhǎng)效類麻醉制劑，在國(guó)外報(bào)道中常需與鎮(zhèn)靜劑合用才能達(dá)到良好的麻醉效果[1]。巴比妥類藥物由于療效指數(shù)的受限，使用通常局限于非生存操作或記錄一些神經(jīng)生理信號(hào)，麻醉時(shí)間較長(zhǎng)，且個(gè)體差異及其顯著[5]，對(duì)循環(huán)和呼吸系統(tǒng)都存在嚴(yán)重的抑制作用[6]。

舒泰(Zoletil)是一種新型的專門針對(duì)動(dòng)物設(shè)計(jì)的注射用麻醉藥，由替來(lái)他明和唑拉西泮按質(zhì)量比1∶1混合而成，替來(lái)他明是一種分離麻醉劑，唑拉西泮兼具鎮(zhèn)定劑和肌松作用[8]。舒泰具有誘導(dǎo)期迅速而平穩(wěn)、副作用小、止痛效果強(qiáng)等特點(diǎn)，且具有良好的耐受性和非常高的安全指數(shù)，近年來(lái)開始被廣泛應(yīng)用于小動(dòng)物臨床麻醉[9]。鹽酸右美托咪定(Dexdomitor，多咪靜)，是一種新型的高特異性α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，可產(chǎn)生鎮(zhèn)靜和止痛作用，可顯著增加麻醉劑的效果，降低麻醉劑的劑量[10]。研究表明，兩藥聯(lián)用可達(dá)到麻醉協(xié)同效果佳且不良反應(yīng)少的效果，故逐漸成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉用藥研究的關(guān)注點(diǎn)。舒泰聯(lián)合多咪靜復(fù)合麻醉在小動(dòng)物臨床中廣泛使用，但其對(duì)小鼠的麻醉效果未見報(bào)道。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，氯胺酮和舒泰復(fù)合多咪靜麻醉的持續(xù)時(shí)間相當(dāng)，均約20 min，與氯胺酮相比，舒泰聯(lián)合多咪靜麻醉的翻正反射消失時(shí)間和誘導(dǎo)期顯著降低，且死亡率為0，麻醉效果更好、更加安全可靠，但缺點(diǎn)為蘇醒期較長(zhǎng)。戊巴比妥鈉的有效麻醉期明顯延長(zhǎng)，但翻正反射消失時(shí)間和誘導(dǎo)期也較長(zhǎng)，且個(gè)體差異明顯，死亡率較高。

4 小結(jié)

試驗(yàn)者可根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求，選擇適宜的麻醉方案進(jìn)行麻醉。綜上所述，對(duì)于造模操作時(shí)間較短(約20 min)的小鼠模型，比如關(guān)節(jié)炎模型，舒泰聯(lián)合多咪靜復(fù)合麻醉方案可作為最佳選擇；對(duì)于操作時(shí)間較長(zhǎng)的造模實(shí)驗(yàn)，可考慮選擇戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。

[1] Davis J A. Mouse and rat anesthesia and analgesia[J]. Curr Protoc Neurosci， 2008, Appendix 4: 4B.

[2] Kawai S, Takagi Y, Kaneko S,etal. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice[J]. Exp Anim，2011, 60(5): 481-487.

[3] 梁佩紅，江斌，陳居銪，等. 三種麻醉方法在骨科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中效果比較[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2012, 22(11): 59-62.

[4] 賀爭(zhēng)鳴. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科學(xué)[M]. 科學(xué)出版社, 2011: 1763.

[5] Gargiulo S, Greco A, Gramanzini M,etal. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research.[J]. Ilar Journal，2012, 53(1): 55-69.

[6] 鄧小明，朱科明. 常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉[M]. 第二軍醫(yī)大學(xué)出版社, 2001.

[7] Kurdi M S, Theerth K A, Deva R S. Ketamine: Current applications in anesthesia, pain, and critical care[J]. Anesth Essays Res，2014, 8(3): 283-290.

[8] 郭優(yōu)勤，郭銳，魏桂林，等. 淺談舒泰麻醉藥在動(dòng)物臨床麻醉中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012(01): 77-78.

[9] Belant J L. Field immobilization of raccoons (Procyon lotor) with Telazol and xylazine[J]. J Wildl Dis，2004, 40(4): 787-790.

[10] Bajwa S, Kulshrestha A. Dexmedetomidine: an adjuvant making large inroads into clinical practice[J]. Ann Med Health Sci Res，2013, 3(4): 475-483.

EffectofThreeTypesofAnestheticMethodsinMiceOrthopedicResearch

MENG Di1,2， LIANG Zhen1,2， ZHAO Dan-hui1,2

(1.Beijing Institute of Traumatology and Orthopedics, Beijing 100035, China；2. Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China)

The effect of three types of anesthetic methods were study to analyze the application value of these methods in orthopedic research.45 C57BL/6 mice were randomly divided into three groups, group A was given with ketamin, group B was injection with pentobarbital sodium and group C was administrated by Zoletil combined with Dexdomitor. The immobilization time, induction time, anesthesia time, recovery time, anesthetic depth and mortality rates were compared after the anesthetic agents were administered.The anesthesia times of group A and group C were shorter, and compared with group A, the induction time of group C was significantly reduced, furthermore, group C had a better anesthetic effect, a mortality rate of 0, which was safe and reliable, but the recovery time of group C was long. In group B, the induction time and the duration of anesthesia time were obviously increased, with general anesthesia effect and highest mortality rate.Group C can be used as the best anesthesia program for orthopedic surgery witch operation time was shorter, and when the operation time was longer, group B can be used as a choice.

Mice ; Orthopedics ; Anesthesia Effect

ZHAO Dan-hui

S865.1+3

A

0529-6005(2017)09-0094-03

2017-09-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81601947)

孟迪(1985-)，女，研究實(shí)習(xí)員，博士，從事骨科疾病致病機(jī)制及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作方面研究，E-mail：vetmeng@163.com

趙丹慧，E-mail：zhaodanhui@263.net