蔡亞南 ， 趙麗娟 ， 王 丞 ， 祝學(xué)珍 ， 唐 磊 ， 楊桂連 ， 錢(qián)愛(ài)東 ， 趙 權(quán)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

一例人感染帶絳蟲(chóng)PCR鑒定

蔡亞南 ， 趙麗娟 ， 王 丞 ， 祝學(xué)珍 ， 唐 磊 ， 楊桂連 ， 錢(qián)愛(ài)東 ， 趙 權(quán)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

為了快速鑒別診斷一例人絳蟲(chóng)感染病例，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒?PCR)擴(kuò)增線粒體cox1和Cytb基因片段，對(duì)PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和基因序列測(cè)序。分別與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中帶絳蟲(chóng)cox1 和Cytb基因序列進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)選用MEGA 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果：核酸序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中牛帶絳蟲(chóng)同源性均為99%，進(jìn)化分析表明與牛帶絳蟲(chóng)的親緣性最近。表明該病例屬于牛帶絳蟲(chóng)感染。

牛帶絳蟲(chóng) ；cox1 ；Cytb； 鑒定

牛帶絳蟲(chóng)(Taeniasaginata.Tsa)、亞洲帶絳蟲(chóng)(Taeniaasiatica.Tas)和豬帶絳蟲(chóng)(Taeniasolium.Ts)均可感染人，且從臨床癥狀和蟲(chóng)體形態(tài)上難以區(qū)分。為了鑒定該病人所患蟲(chóng)種，本文通過(guò)PCR方法擴(kuò)增cox1和Cytb基因片段，并對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行分析及構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，從而確定該絳蟲(chóng)種屬，進(jìn)而確定該例患者的病源。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 2016年8月廣西某地一位患者，常常表現(xiàn)腹痛、腹部不適現(xiàn)象，并且伴有體重下降，肛門(mén)瘙癢癥狀，糞便中偶見(jiàn)乳黃色的的絳蟲(chóng)節(jié)片，患病前常吃生肉片和燒烤，疑似患有囊蟲(chóng)病，來(lái)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)囊蟲(chóng)病醫(yī)院就診。給病人口服中藥合劑(新鮮南瓜子和檳榔提取物)，30 min后口服30%水合硫酸鎂(MgSO4·7H2O)。經(jīng)過(guò)3～6 h排出大約1m長(zhǎng)近乎完整的絳蟲(chóng)。置于0.9%生理鹽水中保存，檢測(cè)。

1.2 絳蟲(chóng)基因組提取 取0.5g絳蟲(chóng)孕卵節(jié)片，經(jīng)液氮充分研磨，采用TaKaRa基因組DNA廣譜型小量純化試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)，提取絳蟲(chóng)基因組。

1.3 引物設(shè)計(jì)及克隆 根據(jù)GenBank上cox1和Cytb基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，見(jiàn)表1。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 cox1和Cytb引物

PCR反應(yīng)體系 2X PremixTaq(TaKaRa, Japan)25 μL,去離子水20 μL, Primer-F(10 μmol/L)1.5 μl,Primer-R(10 μmol/L)1.5 μL,模板(gDNA)2 μL,總體積50 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，5 min；變性94 ℃，40 s；退火55 ℃，40 s；延伸72 ℃，1 min；再延伸72 ℃，10 min。循環(huán)數(shù)：35 cycles。取2 μL PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若條帶正確，將剩余PCR產(chǎn)物回收。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，純化(TaKaRa MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0)，取4 μL純化產(chǎn)物連接到1 μL的PMD-18T(pMDTM18-T Vector Cloning Kit)載體中。轉(zhuǎn)化到DH5α(Tiangen)感受態(tài)中，在含有Amp+抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單克隆菌落在含有抗性的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h，取5 ml菌液提取質(zhì)粒。以質(zhì)粒作為模板按以上PCR條件驗(yàn)證，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測(cè)序。

1.4 測(cè)序結(jié)果比對(duì) 對(duì)該絳蟲(chóng)所測(cè)核苷酸序列通過(guò)NCBI(National Center for Biotechnology Information) Blast(Basic Local Alignment Search Tool)工具比對(duì)其同源性。

1.5 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù) GenBank上分別下載牛帶絳蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)、亞洲帶絳蟲(chóng)的cox1和Cytb序列。cox1共15條核苷酸序列，Cytb共10條核苷酸序列。將測(cè)序成功的基因片段分別與GenBank上絳蟲(chóng)線粒體cox1和Cytb核苷酸序列對(duì)比，并使用MEGA(Version6)軟件，采用鄰接法(Neighbor-joining NJ)、選用Kimura 2-parameter模式，Bootstrap值設(shè)定為 1 000 bp 構(gòu)建絳蟲(chóng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 蟲(chóng)體有絳蟲(chóng)孕節(jié)。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，如圖1可見(jiàn)，cox1在接近2 000 bp的位置、Cytb在靠近1 000 bp的位置有明顯單一的條帶。

圖1 cox1和Cytb序列PCR結(jié)果

M：DL-2 000 DNA Marker； 1：cox1； 2：cox1陰性對(duì)照； 3：Cytb； 4：Cytb陰性對(duì)照

2.3 核酸序列比對(duì)結(jié)果cox1 核苷酸序列長(zhǎng)度為1 620 bp，通過(guò)NCBI Blast 顯示分別與牛帶絳蟲(chóng)(GenBank: AB107244)同源性為99%，突變堿基3個(gè)，見(jiàn)表2；亞洲帶絳蟲(chóng)(GenBank: AB107235.1)同源性為96%，突變基因66個(gè)；豬帶絳蟲(chóng)(GenBank: JX535570.1)同源性為92%。Cytb核苷酸序列長(zhǎng)度為1 068 bp，NCBI Blast 顯示分別與牛帶絳蟲(chóng)(GenBank: AB274525.1)同源性為99%，不同堿基8個(gè)，見(jiàn)表2；亞洲帶絳蟲(chóng)(GenBank:AB066580.1)同源性為97%，不同和缺失堿基共35個(gè)；豬帶絳蟲(chóng)(GenBank: FN995661.1)同源性為87%。

2.4 核苷酸序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 采用MEGA 構(gòu)建的絳蟲(chóng)cox1 和Cytb進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖3和圖4，待測(cè)絳蟲(chóng)(Tapeworm)與牛帶絳蟲(chóng)形成一個(gè)單系，親緣關(guān)系最近。

表2 基因cox1和Cytb突變堿基

圖2 cox1基因核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)

圖3 Cytb基因序列進(jìn)化樹(shù)

3 討論

絳蟲(chóng)病是世界衛(wèi)生組織(WHO)公認(rèn)的熱帶病，常用的診斷方法有：蟲(chóng)體形態(tài)學(xué)檢查、血清抗體ELISA檢測(cè)、分子生物學(xué)鑒定。傳統(tǒng)的蟲(chóng)種鑒定主要依據(jù)蟲(chóng)體的形態(tài)，比如頭節(jié)上有無(wú)頂圖和鉤，鏈體長(zhǎng)度，卵巢形態(tài)和睪丸長(zhǎng)度等。但牛帶絳蟲(chóng)和亞洲帶絳蟲(chóng)形態(tài)極其相似，并且部分地區(qū)還有絳蟲(chóng)與蟯蟲(chóng)混合感染的現(xiàn)象，所表現(xiàn)的癥狀與急性闌尾炎相似[1]。常用的分子生物學(xué)技術(shù)有多重PCR、RFLP-PCR、隨機(jī)引物DNA擴(kuò)增等[3]。寄生蟲(chóng)分子學(xué)特征的研究是學(xué)習(xí)和控制寄生蟲(chóng)的流行病學(xué)和傳染的關(guān)鍵因素。近幾年對(duì)寄生蟲(chóng)基因的研究頗多，例如全基因組測(cè)序[2]、線粒體遺傳變異[3]等。

線粒體基因組作為分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于物種鑒定[4-6]，為流行病學(xué)的研究提供來(lái)源。Cytb與cox1在不同種屬之間具有較高的保守性和特異性，可準(zhǔn)確、高效地評(píng)估種間或種內(nèi)的遺傳變異及其親緣關(guān)系[7]。cox1和Cytb完整序列的分析顯示,全世界存在兩個(gè)絳蟲(chóng)系譜：亞洲組和非洲或拉丁美洲組，即使絳蟲(chóng)因不同地理位置的改變而發(fā)生的遺傳變異也可準(zhǔn)確鑒定絳蟲(chóng)病[4]，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可描述物種間的進(jìn)化關(guān)系，并推斷出物種之間的遺傳距離[5]。陳錚宏等[6]、張晨昊等[7]和羅浪等[8]以cox1和mtDNA-Cytb作為基因標(biāo)記，采集大理、怒江和臺(tái)灣等部分地區(qū)帶絳蟲(chóng)標(biāo)本，并成功鑒定了其種屬。本文早在20世紀(jì)末，就有學(xué)者[9; 10]針對(duì)采集臺(tái)灣地區(qū)的絳蟲(chóng)進(jìn)行了基因分析，提出并驗(yàn)證了亞洲帶絳蟲(chóng)可能是牛帶絳蟲(chóng)的一個(gè)亞種，王正蓉[11]并對(duì)此提議進(jìn)行了驗(yàn)證，認(rèn)為將亞洲帶絳蟲(chóng)劃分為牛帶絳蟲(chóng)亞種較為合適。

本文選用線粒體cox1和Cytb基因序列作為分子遺傳標(biāo)記， PCR擴(kuò)增陽(yáng)性結(jié)果經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)序列長(zhǎng)度與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上記錄的cox1和Cytb序列長(zhǎng)度一致，分別是為1 620 bp和1 068 bp。Blast比對(duì)顯示：與牛帶絳蟲(chóng)同源性最高99%。進(jìn)化樹(shù)分析可知，序列分別與牛帶絳蟲(chóng)cox1和Cytb基因同屬于一個(gè)分支，并且Cytb序列與蒙古Cytb序列并為一支，同為亞洲地區(qū)。經(jīng)以上分子生物學(xué)信息分析，證明該蟲(chóng)種與牛帶絳蟲(chóng)為一個(gè)種，屬于亞洲組。

本文絳蟲(chóng)線粒體基因組系統(tǒng)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示，被檢絳蟲(chóng)與亞洲帶絳蟲(chóng)構(gòu)成姊妹支,與牛帶絳蟲(chóng)隸屬于一個(gè)分支，與牛帶絳蟲(chóng)親緣關(guān)系最近。與以往試驗(yàn)數(shù)據(jù)相一致，進(jìn)一步證實(shí)該絳蟲(chóng)屬牛帶絳蟲(chóng)。在我國(guó)一些貧困地區(qū)由于衛(wèi)生條件差、設(shè)施缺乏，仍然存在人畜廁所不分的現(xiàn)象，且部分少數(shù)民族地區(qū)依然保留著吃生肉片和燒烤的習(xí)俗，給囊尾蚴病的傳播創(chuàng)造了有利條件[12]。及時(shí)控制和預(yù)防絳蟲(chóng)病的傳播有利于各地區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)的提高，建議加強(qiáng)公共衛(wèi)生知識(shí)的學(xué)習(xí)、改正不良飲食習(xí)慣、切斷中間宿主的傳播，來(lái)控制和預(yù)防絳蟲(chóng)的傳播。

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B

0529-6005(2017)09-0097-03

2017-04-06

中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014M561308)；吉林省科技廳項(xiàng)目(20160520180JH，20170307016NY)；吉林省教育廳項(xiàng)目(2016193)

蔡亞南(1980-)，男，講師，博士，主要研究方向?yàn)橹胁菟幙辜纳x(chóng)病研究， E-mail：caiyanan@jlau.edu.cn

趙麗娟(1992-)，女，碩士生，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物寄生蟲(chóng)病學(xué)， E-mail：1005676023@qq.com

注：趙麗娟和蔡亞南對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)

趙權(quán)， E-mail：zhaoquan0825@163.com