孔冬瑞 李 璐

(1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái) 264025； 2.西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院，昆明 650224)

瓊欖小孢子發(fā)生、雄配子體發(fā)育及花粉粒形態(tài)

孔冬瑞1李 璐2

(1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái) 264025； 2.西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院，昆明 650224)

利用光學(xué)顯微技術(shù)和電鏡掃描技術(shù)研究了瓊欖的小孢子發(fā)生、雄配子體發(fā)育和花粉粒形態(tài)以增加廣義心翼果科的胚胎學(xué)和孢粉學(xué)資料。主要結(jié)果如下：(1)花藥四孢囊；(2)花藥壁四層，從外到內(nèi)分別為表皮、具纖維性加厚的藥室內(nèi)壁、退化早的中層和細(xì)胞具2～4核的分泌型絨氈層；(3)小孢子母細(xì)胞胞質(zhì)分裂同時(shí)型，形成四面體型排列的小孢子四分體；(4)成熟花粉粒為二細(xì)胞型；(5)花粉粒具3個(gè)隱形萌發(fā)孔，外壁為網(wǎng)狀紋飾。瓊欖與心翼果屬的小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育特征非常相似，稍有不同。瓊欖的花粉粒形態(tài)特征與同屬其它種基本相同。

瓊欖；小孢子發(fā)生；雄配子體發(fā)育；花粉粒形態(tài)；廣義心翼果科

瓊欖屬(GonocaryumMiquel)為常綠灌木或小喬木，全世界約有10種，分布于東南亞熱帶地區(qū)[1]。我國(guó)有瓊欖(G.lobbianum(Miers) Kurz)和臺(tái)灣瓊欖(G.calleryanum(Baill.)Becc.)兩種，瓊欖分布在海南和云南，臺(tái)灣瓊欖僅生長(zhǎng)在臺(tái)灣[1]。在傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)中，瓊欖屬一直都是茶茱萸科(Icacinaceae(Bentham) Miers)的成員[2～4]。到了分子時(shí)代，瓊欖的系統(tǒng)位置發(fā)生了較大變化。K?rehed根據(jù)對(duì)廣義茶茱萸科(Icacinaceae s.l.)分支分析的研究結(jié)果，把包括瓊欖屬在內(nèi)的至少3個(gè)原茶茱萸科的屬移入單型科—心翼果科(Cardiopteridaceae)，擴(kuò)大了心翼果科的范圍[5]。廣義心翼果科(Cardiopteridaceae s.l.)雖然得到普遍認(rèn)可[6～8]和分子系統(tǒng)研究結(jié)果的支持[9～10]，卻一直缺少形態(tài)學(xué)驗(yàn)證。植物胚胎學(xué)和孢粉學(xué)是廣義形態(tài)學(xué)的重要組成部分，在解決各級(jí)分類學(xué)問(wèn)題時(shí)都有重要的參考價(jià)值[11～12]，但迄今為止，廣義心翼果科的胚胎學(xué)資料卻非常少，已有的資料也主要集中在胚囊發(fā)育方面[13～14]。在小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育方面，僅Tobe研究了心翼果屬心翼果(CardiopterisquinquelobaHassk.)的小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育[14]。在孢粉學(xué)方面，Dahl以原茶茱萸科的成員研究了瓊欖屬4個(gè)種的花粉粒形態(tài)，但瓊欖這個(gè)種未在研究之列[15]。Schori和Furness在研究冬青目(Aquifoliales)的孢粉學(xué)時(shí)，對(duì)心翼果屬、瓊欖屬等心翼果科各屬的花粉粒形態(tài)進(jìn)行了研究，同樣沒(méi)有包括瓊欖這個(gè)種[16]。我們利用常規(guī)石蠟制片技術(shù)研究了瓊欖的小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育，并利用電鏡掃描技術(shù)，觀察了瓊欖的花粉粒形態(tài)，旨在補(bǔ)充廣義心翼果科的胚胎學(xué)及孢粉學(xué)資料，進(jìn)而為驗(yàn)證心翼果科的的擴(kuò)大是否合適提供更多的形態(tài)學(xué)證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料采自中國(guó)科學(xué)院西雙版納植物園(引種號(hào)為3020020065)。取不同發(fā)育時(shí)期的花蕾和花朵，固定并保存于FAA固定液(50%乙醇∶乙酸∶甲醛=90∶6∶4)中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織切片

愛(ài)氏蘇木精整體染色后，常規(guī)石蠟制片法制片。Olympus DP-70顯微攝影系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.2.2 花粉粒整體光鏡觀察

從FAA固定液里取即將開放的花蕾，剝出花藥，用解剖針刺破花藥壁，輕輕擠壓出花粉粒，做成水裝片，在Olympus DP-70顯微攝影系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.2.3 電鏡掃描

取即將開放的花蕾在70%酒精里剝出花藥，經(jīng)梯度酒精和醋酸異戊酯脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥后，用雙面導(dǎo)電膠粘到金屬樣品臺(tái)上，用解剖針戳破花藥壁，輕輕撥動(dòng)花藥壁，使花粉粒散落到導(dǎo)電膠上，離子濺射儀噴金鍍膜后，在Hitachi SC800掃描電鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 花藥壁發(fā)育

瓊欖的花為單性花，每朵雄花含有5枚雄蕊，每枚雄蕊的花藥具有4個(gè)小孢子囊(圖1：A)。初步發(fā)育成熟的花藥壁有四層，由外而內(nèi)分別為表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層(圖1：B)。絨氈層細(xì)胞初為單核，后為2～4核(圖1：B,C)。在花藥壁成熟過(guò)程中，中層和絨氈層先后退化。絨氈層退化時(shí)原位解體,按照Davis的觀點(diǎn)，為分泌型絨氈層[17]。散粉時(shí)，花藥壁只剩下表皮和藥室內(nèi)壁(圖1：D)。表皮細(xì)胞被拉伸破裂，只剩下殘跡。藥室內(nèi)壁細(xì)胞徑向壁明顯伸長(zhǎng)，且具有纖維性加厚(圖1：D)?；ㄋ庨_裂方式為縱裂，裂口在兩個(gè)藥室相接處(圖1：A箭頭所指)。

2.2 小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育

小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中(圖1：E～I(xiàn))，胞質(zhì)分裂為同時(shí)型(圖1：G～I(xiàn))，形成四面體型排列的小孢子四分體(圖1：J)。單核花粉粒經(jīng)歷單核靠邊期(圖1：K)，進(jìn)行一次不均等的有絲分裂，形成一個(gè)小的生殖細(xì)胞和一個(gè)大的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞(圖1：L)。生殖細(xì)胞一開始為凸透鏡狀，緊貼花粉壁(圖1：L)，后來(lái)逐漸脫離花粉壁，進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖1：M)。成熟花粉粒為二細(xì)胞型(圖1：N)。

2.3 花粉粒形態(tài)

在未成熟的花粉粒的切片中，只能看到一個(gè)萌發(fā)孔(圖1：L，M，箭頭所指部位)?；ǚ鄢墒鞎r(shí)，萌發(fā)孔變得不明顯(圖1：N)。但花粉粒水裝片的光學(xué)顯微觀察，部分花粉粒可觀測(cè)到3個(gè)萌發(fā)孔(圖1：Q)。掃描電鏡下瓊欖的花粉粒為圓球形，分辨不出極面和赤道面，也觀察不到萌發(fā)孔?；ǚ弁獗诩y飾為網(wǎng)狀，網(wǎng)壁有穿孔，具雞冠狀的網(wǎng)脊，網(wǎng)眼形狀不規(guī)則，內(nèi)有小柱(圖1：L)。

3 討論

3.1 瓊欖花粉粒形態(tài)

Dahl使用光學(xué)顯微鏡觀察了臺(tái)灣瓊欖、G.gracileMiq.(asG.longeracemosumKing)、G.cognatumElmer和Gonocaryumlitorale(Blume) Sleumer.(as G.fuscum Hochr.)等4個(gè)種的花粉粒形態(tài)，認(rèn)為瓊欖屬的花粉粒具3(偶4)個(gè)萌發(fā)溝，并指出G.gracile和G.cognatu的花粉粒的萌發(fā)溝由于有花粉外壁物質(zhì)跨過(guò)形成“橋”，使萌發(fā)溝不明顯[15]。Schori和Furness同時(shí)使用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察了G.litorale和G.minus兩個(gè)種的花粉粒形態(tài)，認(rèn)為這兩個(gè)種的花粉粒具有3個(gè)隱藏的萌發(fā)孔[16]。我們使用3種不同的處理方法對(duì)瓊欖花粉粒的觀測(cè)結(jié)果顯示：組織切片中，未完全成熟的花粉?？捎^察到一個(gè)明顯的萌發(fā)孔，而成熟的花粉粒萌發(fā)孔則不明顯；掃描電鏡下，在觀察的50個(gè)花粉粒中，沒(méi)有找到一個(gè)具有明顯萌發(fā)孔(溝)的花粉粒；而水裝片的顯微觀察，雖然大部分花粉粒觀察不到萌發(fā)孔或只觀察到一個(gè)萌發(fā)孔，但少數(shù)花粉?？捎^察到3個(gè)萌發(fā)孔。根據(jù)3種觀察結(jié)果，我們認(rèn)為瓊欖的花粉粒應(yīng)該是具有3個(gè)隱藏的萌發(fā)孔。這和G.litorale和G.minus的情況相同，其外壁的網(wǎng)狀紋飾、網(wǎng)脊雞冠狀、網(wǎng)眼內(nèi)具小柱也和G.litorale和G.minus非常相似[16]。綜上所述，花粉粒具有3個(gè)隱藏的萌發(fā)孔在瓊欖屬是比較普遍的，Dahl描述瓊欖屬的花粉粒具三孔溝[15]可能是因?yàn)楣鈱W(xué)顯微觀察結(jié)果不準(zhǔn)確。

圖1 A.花藥橫切，顯示4個(gè)孢子囊，箭頭所指為花藥開裂時(shí)裂口位置；B.四層花藥壁，由外到內(nèi)分別為表皮(ep)、藥室內(nèi)壁(en)、中層(ml)和絨氈層(ta)；C.部分花藥壁橫切，顯示絨氈層細(xì)胞具2～4核；D.即將散粉時(shí)的花藥壁，中層和絨氈層退化，表皮細(xì)胞(ep)僅留殘跡，藥室內(nèi)壁細(xì)胞(en)徑向伸長(zhǎng)，具纖維性加厚；E～I(xiàn).小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂，依次為中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ、前期Ⅱ和末期Ⅱ；J.四面體型四分體；K.單核靠邊期花粉粒；L.單核花粉粒分裂為一個(gè)大的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和一個(gè)小的凸透鏡狀的生殖細(xì)胞。左邊為分裂中期的花粉粒，右邊為剛分裂為兩個(gè)細(xì)胞的花粉粒；M.生殖細(xì)胞進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，萌發(fā)孔明顯；N.成熟花粉粒為二細(xì)胞型，萌發(fā)孔不明顯；O.水裝片里的成熟花粉粒，顯示3個(gè)萌發(fā)孔(箭頭所指)；P.成熟花粉粒電鏡掃描圖片，分辨不出極面和赤道面，觀察不到萌發(fā)孔；Q.花粉粒電鏡掃描圖片部分放大，顯示花粉外壁表面紋飾細(xì)節(jié)Fig.1 A. Transverse section of the anther showing four microsporangia,the arrow points to the site of the slit; B.The anther wall with four layers: the epiders(ep),the endothecium(en),the middle layer(ml) and the tapetum(ta); C.Part of the transverse section of the anther wall showing one tapetal cell contains 2-4 nuclei; D.Transverse section of the anther wall before shedding showing the remains of the epidermis(ep) and the fibouse endothecium(en) with elongate radial wall; E-I.Meiosis of the microspore mother cell,successively showing metaphase Ⅰ,anaphase Ⅰ,telophase Ⅰ,prophase Ⅱ and telophase Ⅱ; J.Tetrahedral microspore tetrad; K.The pollen grain possesses a large vecuole with the nucleus near the pollen wall; L.The pollen grains at the stage of mitosis,the left one at the stage of metaphase,the right one has completed mitosis and resulted into a small lenticular generative cell and a large vegetative cell; M.The generative cell moved into the cytoplasm of the vegetative cell,a pore is clear; N.The 2-celled mature pollen grain with the pore unclear; O.Mature pollen grain in water slice showing three pore(arrows point to); P. SEM(Scanning electron micrograph) of mature pollen grain,the polar plate and equatorial plate can’t be distinguished and the pore can’t be observed; Q.Magnification of SEM of mature pollen grain showing detail of the extine ornamentation

3.2瓊欖屬與心翼果屬小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育特征比較

因其它各屬缺少資料，在廣義心翼果科內(nèi)，我們僅將瓊欖屬和心翼果屬進(jìn)行比較。瓊欖屬和心翼果屬的小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育特征基本一致，但也稍有不同。兩個(gè)屬的相同特征有：花藥四孢囊、花藥壁四層、藥室內(nèi)壁具纖維性加厚、絨氈層為分泌型、小孢子母細(xì)胞胞質(zhì)分裂同時(shí)型、小孢子四分體多為四面體型排列、成熟花粉粒為二細(xì)胞型。不同特征有：(1)瓊欖屬的絨氈層細(xì)胞為2～4核，心翼果屬的為2核；(2)散粉時(shí)，瓊欖的花藥壁表皮僅留殘跡，心翼果的花藥表皮宿存，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；(3)瓊欖屬的花粉粒具隱藏的萌發(fā)孔，而心翼果屬的花粉粒具明顯的三孔溝[14,16]。

瓊欖屬和心翼果屬的小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育特征雖然比較一致，但在大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育方面差異明顯[14]，而且兩屬的這些共同特征在其它被子植物中也較為普遍，因而不能僅憑這些特征判定兩個(gè)屬的親緣關(guān)系近。要想更好地理解瓊欖屬與心翼果屬的親緣關(guān)系，驗(yàn)證將瓊欖屬放入心翼果科是否合適還需要補(bǔ)充更多的廣義形態(tài)學(xué)資料。要想驗(yàn)證心翼果科的擴(kuò)大是否成立，還需要將其它各屬胚胎學(xué)、孢粉學(xué)等廣義形態(tài)學(xué)資料補(bǔ)充完整。

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Startup Fundation for Doctors of Ludong University(LY2015014)

introduction：KONG Dong-Rui(1975—),female,lecturer,mainly interested in plant systematics and plant reproduction.

date:2016-10-31

Microsporogenesis,MaleGametogenesisandPollenMorphologyofGonocaryumlobbianum

KONG Dong-Rui1LI Lu2

(1.School of Life Science,Ludong University,Yantai 264025；2.Yunnan Academy of Biodiversity,Southwest Forestry University,Kunming 650224)

We studied the microsporogenesis, male gametogenesis and pollen morphology ofGonocaryumlobbianumusing light microscopy and scanning electron microscopy to enrich the embryological and palynological data of Cardiopteridaceae s.l. The main results are as follows: (1)The anther is tetrasporangiate; (2)The anther wall comprises the epidermis, fibrous endothecium, ephemeral middle layer and secretory tapetum with 2-4 nuclei in each cell; (3)The microspore mother cell undergo meiosis, cytokinesis is simultaneous and the tetrads are tetrahedral; (4)The mature pollen grains are two-celled; (5)The pollen grains are cryptoaperturate with three pores and the extin is reticulate. The characters of microsporogenesis and male gametogenesis ofGonocaryumare similar to those ofCardiopteriswith a little difference.G.lobbianumis almost the same as the other species in the pollen morphological characters.

Gonocaryumlobbianum;microsporogenesis;male gametogenesis;pollen morphology;Cardiopteridaceae s.l.

魯東大學(xué)博士啟動(dòng)基金(LY2015014)

孔冬瑞(1975—)，女，講師，主要從事植物系統(tǒng)學(xué)和植物生殖生物學(xué)研究。

2016-10-31

S667.5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.02.004