陳傳平，陳乃東，劉國(guó)瑞

(1.皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，安徽 六安 237005；2.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012)

不同光照處理對(duì)霍山石斛多酚含量積累的影響

陳傳平1，陳乃東2，劉國(guó)瑞2

(1.皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，安徽 六安 237005；2.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012)

為探究不同光照處理對(duì)霍山石斛根、莖和葉中多酚的含量及種類的影響，分別采用紅藍(lán)光照和模擬自然光照處理霍山石斛根、莖和葉，用比色法測(cè)定其不同光照條件處理下的多酚含量，運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀，通過(guò)沉淀敲除法和制得的樣品進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)多酚種類。研究表明，霍山石斛根、莖和葉多酚含量依次增多，紅藍(lán)光照處理根、莖和葉各部分多酚含量比模擬自然光照處理的少，但多酚種類則是紅藍(lán)光照處理的較多。因此，不同光照對(duì)霍山石斛多酚的積累及種類有明顯影響。

霍山石斛；毛細(xì)管電泳；多酚；光照處理；沉淀敲除

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseTang et Cheng)，又稱米斛，主產(chǎn)于安徽省霍山縣等地，是蘭科石斛屬的草本植物，有生津益胃、益智除驚、輕身延年、抗腫瘤、降糖保肝和抗白內(nèi)障等多種功效[1-3]。多酚(Polyphenols)是植物的主要次生代謝產(chǎn)物之一，為多羥基酚類化合物的總稱，有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等作用，是石斛中重要的生物活性物質(zhì)之一[4-6]。

文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，光照條件改變可以對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的積累產(chǎn)生影響[7-8]。本實(shí)驗(yàn)用模擬自然光、紅藍(lán)光分別處理霍山石斛，測(cè)定了其多酚的含量和種類，初步探究了光照條件與其多酚積累及種類的關(guān)系，為進(jìn)一步研究霍山石斛多酚提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

兩年生霍山石斛(2016年10月采自安徽省霍山縣，品種經(jīng)品種經(jīng)安徽省皖西學(xué)院陳乃東博士鑒定為霍山石斛)，經(jīng)盆栽4周預(yù)培養(yǎng)后，隨機(jī)分組置模擬自然光及紅藍(lán)光下培養(yǎng)。模擬自然光組，用波長(zhǎng)460～760 nm、光強(qiáng)300 lux LED燈光照射；紅藍(lán)光組，用波長(zhǎng)630 nm(紅色)、光強(qiáng)160 lux及波長(zhǎng)460 nm(藍(lán)色)、光強(qiáng)160 lux LED燈光同時(shí)照射；兩組光照時(shí)間均為12 h/d，生長(zhǎng)溫度25 ℃/16 ℃(日/夜)[9]，同條件水肥培養(yǎng)。50 d后采集洗凈、晾干，根、莖和葉分開，置電熱恒溫干燥箱中40 ℃烘至恒重，備用。

1.2 主要儀器

XPE-30、XPR-20、XPB-20型LED燈(深圳市格美芯光科技有限公司)，GJ14-DGF3006型電熱恒溫干燥箱(金壇市榮華儀器制造有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市國(guó)華電器有限公司)；FA-1004型電子天平(上海精科天平廠)；RE-52D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海浦滬儀器廠)；K1060型毛細(xì)管電泳儀(北京凱奧科技發(fā)展有限公司)；TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

1.3 主要試劑

無(wú)水乙醇(AR,上海振興化工一廠)；乙酸乙酯(AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水三氯化鐵(AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲酸(AR,天津博迪化工股份有限公司)；甲醇(色譜純，上海星可生化有限公司)；福林酚(MYM生物科技有限公司)；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海金穗生物科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 石斛中多酚的提取

烘干至恒重的霍山石斛根、莖和葉，粉碎過(guò)30目篩。

天平稱取一定量的不同方法處理的石斛根、莖和葉，置于250 mL燒瓶中，按料液比1∶15(g/mL)加80%乙醇， 80 ℃條件下冷凝回流提取3次，每次1.5 h。合并提取液，減壓濃縮至適量，置于燒杯中揮去剩余乙醇，倒入容量瓶中蒸餾水定容，得總多酚提取液，4 ℃保存[10]。

1.4.2 石斛多酚含量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定樣品中總多酚的含量[11]。稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，配置成25 ug/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5、3.0 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，依次加入2.5 mL福林酚試劑，2 mL 7.5%的NaCO3(4～6 min內(nèi))和1.0 mL 甲醇，最后加H2O至10 mL，在黑暗中反應(yīng)60 min， 517 nm處測(cè)定吸光度值(A)。以吸光度值為縱坐標(biāo)(Y)，多酚含量為橫坐標(biāo)(X)，繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1.0 mL總多酚提取液，按同樣方法測(cè)定A，用H2O作空白對(duì)照，每組測(cè)三次取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同光照處理的霍山石斛根、莖和葉多酚的含量。

1.4.3 毛細(xì)管電泳法測(cè)多酚的種類

1.4.3.1 樣品預(yù)處理

分別取制備好的不同光照處過(guò)的霍山石斛根、莖和葉總多酚提取液一定量，真空干燥后，精密稱取配置成1.0 mg/mL的水溶液，用0.45 μm纖維素膜過(guò)濾備用。

1.4.3.2 毛細(xì)管電泳條件的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[12]及預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇硼砂作為緩沖溶液，測(cè)定波長(zhǎng)為254 nm、分離電壓15.0 KV、緩沖液pH為9以及離子濃度為0.1 mol/L作為毛細(xì)管電泳條件。

1.4.3.3 石斛多酚組分測(cè)定

將上述處理后的石斛多酚水溶液用注射器吸取放入Doff管中。毛細(xì)管電泳儀用0.3 mol/L的NaOH、H2O和緩沖液分別沖洗，預(yù)熱3～5 min，設(shè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣30 s，啟動(dòng)毛細(xì)管電泳儀，記錄所得圖譜。

1.4.3.4 未知石斛多酚組分的沉淀敲除鑒定

精密吸取1.0 mL石斛多酚配置成的水溶液，與三氯化鐵沉淀試劑(2 mg/mL)等體積混合，搖勻，3 000 rmp離心10 min，重復(fù)三次操作獲得敲除石斛多酚組分的上清液，用0.45 μm纖維素膜過(guò)濾。同上述測(cè)定未與沉淀試劑反應(yīng)的不同光照處理的霍山石斛根、莖和葉用毛細(xì)管測(cè)定圖譜方法相同，所得圖譜結(jié)果與上述測(cè)定的石斛多酚提取物水溶液含量比較，消失或面積明顯下降的峰為多酚類組分峰[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 霍山石斛多酚含量

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的不同條件光照處理的霍山石斛根、莖和葉多酚含量見表1。

由表1可知：模擬自然光照和紅藍(lán)光照處理的霍山石斛根、莖和葉多酚含量依次增多，其中模擬自然光照處理根、莖和葉中多酚含量較高，這可能是由于光照不同影響多酚的積累。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

組分用量(g)總提液(mL)吸光度(A)含量(%)紅藍(lán)光石斛根7.309500.2030.735自然光石斛根3.3139500.2420.783紅藍(lán)光石斛莖2.73881000.2170.87自然光石斛莖1.03411000.1131.58紅藍(lán)光石斛葉1.5407500.21.28自然光石斛葉0.4284500.161.47

2.2 霍山石斛多酚組成的毛細(xì)管電泳分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)測(cè)得模擬自然光照處理霍山石斛根、莖和葉的多酚提取物HPCE分析結(jié)果見圖2～4。

圖2 自然光照霍山石斛根HPCE圖譜注：a：三氯化鐵沉淀試劑；b：模擬自然光照霍山石斛根提取液；c：加沉淀試劑的根提取液

圖3 自然光照霍山石斛莖HPCE圖譜注：a：三氯化鐵沉淀試劑；b：模擬自然光照霍山石斛莖提取液；c：加沉淀試劑的莖提取

圖4 自然光照霍山石斛葉HPCE圖譜注：a：三氯化鐵沉淀試劑；b：加沉淀試劑的葉提取液；c：模擬自然光照霍山石斛葉提取液

由圖2可見6～8 min峰2內(nèi)敲除后的峰響應(yīng)、峰面積值明顯降低，表明模擬自然光照處理的霍山石斛根里含有1種多酚。圖3中，敲除后的峰4、5、6、7和8響應(yīng)、峰面積值有所降低，表明模擬自然光照處理的霍山石斛莖里含有5種多酚。圖4可見敲除后的峰6、7、8、9、10、11、12和13響應(yīng)、峰面積值明顯降低，表明模擬自然光照處理的霍山石斛莖里含有8種多酚。圖2～4比較，從峰面積來(lái)看莖中多酚含量較高，而多酚種類莖和葉中較多。

2.3 紅藍(lán)光照處理霍山石斛根、莖及葉的多酚提取物HPCE分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)測(cè)得紅藍(lán)光照處理霍山石斛的根、莖及葉的多酚提取物HPCE分析結(jié)果見圖5～7。

圖5 紅藍(lán)光照霍山石斛根HPCE圖譜注：a：三氯化鐵沉淀試劑；b：紅藍(lán)光照霍山石斛根提取液；c：加沉淀試劑的葉提取液

圖6 紅藍(lán)光照霍山石斛莖HPCE圖譜注：a：三氯化鐵沉淀試劑；b：紅藍(lán)光照霍山石斛莖提取液；c：加沉淀試劑的莖提取液

圖7 紅藍(lán)光照霍山石斛葉HPCE圖譜注：a：三氯化鐵沉淀試劑；b：紅藍(lán)光照霍山石斛葉提取液；c：加沉淀試劑的葉提取液

圖5中，6～8 min時(shí)峰3、4敲除后有一個(gè)的峰的響應(yīng)值和面積明顯下降，表明紅藍(lán)光照處理的霍山石斛根里含有2種多酚。圖6中，敲除后的峰8、9、10、14、15、16、17、18、19和20響應(yīng)、峰面積值明顯降低，表明紅藍(lán)光照處理的霍山石斛莖里含有10種多酚。圖7可見敲除后的3、4、6、7、8、10、11、12、13、14和15響應(yīng)、峰面積值明顯降低，表明紅藍(lán)光照處理的霍山石斛莖里含有11種多酚。圖5～7比較，其中根、莖和葉中有一種共有多酚(圖5峰5、圖6峰9和圖7峰11)，從峰面積來(lái)看葉中這些種多酚含量最高。

上述結(jié)果表明，模擬自然光照和紅藍(lán)光照處理的霍山石斛根、莖和葉酚種類含量與種類都有所差別，其中紅藍(lán)光照處理的霍山石斛多酚種類要多，而含量則是模擬自然光照處理的較高。

3 討論

本研究中，緩沖液pH的選擇對(duì)樣品出峰的效果有很大的影響，檢測(cè)多酚物質(zhì)時(shí)緩沖液pH要大于7，但太高會(huì)引起基線不穩(wěn)。出峰的時(shí)間與電壓、緩沖液濃度有關(guān)，電壓太大出峰快但峰可能會(huì)有左右肩峰，緩沖液離子濃度大會(huì)加快出峰速度但相應(yīng)電流會(huì)增加。最后，出峰時(shí)間還和毛細(xì)管的長(zhǎng)度有關(guān)，毛細(xì)管越短，出峰越快。

研究表明，霍山石斛多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)[15]。酚類化合物是一種天然抗氧化劑，其中多酚中酚羥基結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu)，同時(shí)對(duì)活性氧等自由基具有很強(qiáng)的捕捉能力，這使得多酚具有較強(qiáng)的抗氧化性以及清除自由基的能力，且抗氧化活性的強(qiáng)弱與其所含多酚類含量及種類具有較高的相關(guān)性[16]。

道地藥材霍山石斛產(chǎn)業(yè)化發(fā)展目前尚處于起步階段，已經(jīng)制定了相關(guān)產(chǎn)地、種苗生產(chǎn)、栽培技術(shù)等標(biāo)準(zhǔn)[1-3,17]，但其在化學(xué)成分方面的鑒別和量化尚無(wú)明確標(biāo)準(zhǔn)。藥用植物有效物質(zhì)的合成與累積受自身遺傳特征、自然環(huán)境、采收等多方面的影響，從而使有效物質(zhì)的含量發(fā)生變化，影響到藥材的內(nèi)在質(zhì)量。殷培蕾等人研究表明，光照不僅影響植物中多酚的種類和生物量，還會(huì)改變抗氧化活性[18]。本研究通過(guò)Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定樣品中總多酚的含量以及用毛細(xì)管電泳儀通過(guò)沉淀敲除的方法和制得的樣品進(jìn)樣對(duì)照測(cè)定了多酚種類。結(jié)果發(fā)現(xiàn)霍山石斛的根、莖、葉在相同條件下出峰不同，不同光照處理的石斛相同部位峰也不太相同，模擬自然光照的霍山石斛多酚含量較紅藍(lán)光處理的要多，這可為探索霍山石斛產(chǎn)業(yè)化栽培條件及建立霍山石斛化學(xué)成分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考[19]。

[1]孟海濤，何祥林，張淇軍，等.山石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀與對(duì)策分析[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥，2015，17(6)：521-524.

[2]吳胡琦，羅建平.霍山石斛的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(1)：208-211.

[3]陳存武，戴軍，姚厚軍，等.霍山石斛資源與鑒定研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2013，27(3)：84-87.

[4]魏明，劉艷艷，蔡為榮，等.霍山石斛多酚超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J].食品與機(jī)械，2016(7)：136-140.

[5]陳乃東，陳翰，于丹，等.亳芍多酚提取工藝及栽培年限對(duì)總多酚積累的影響研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27(S)：135-139.

[6]黃琴，沈楊霞，張成靜，等.鐵皮石斛多酚和黃酮含量及與抗氧化活性的相關(guān)性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2014(3)：438-442.

[7]唐龍飛，鐘紅梅，陳堅(jiān).不同光照條件下4種滿江紅(Azolla)品系體內(nèi)多酚氧化酶活性的變化[J].植物生理學(xué)報(bào)，1999(1)：98-102.

[8]馮世鑫，馬小軍，閆志剛，等.光照強(qiáng)度對(duì)金果橄欖光合特性和生長(zhǎng)品質(zhì)的影響[J].激光生物學(xué)報(bào)，2011，20(4)：462-467.

[9]唐德英，楊春勇，王云強(qiáng)，等.鼓糙石解生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律研究[J].中草藥，2006，37(10)：1572-1574.

[10]費(fèi)雯，淳澤，何沁嶷，等.金釵石斛總多酚提取工藝及體外抗氧化活性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2015(4)：623-628.

[11]Moretti M, Cossignanib L, Messina F, et al. Antigenotoxic Effect, Composition and Antioxidant Activity ofDendrobiumSpeciosum[J]. Food Chemistry, 2013,140(4): 660-665.

[12]陳乃東，胡平，羅志強(qiáng)，等.黃酒及其酸敗組分的高效毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法的研究[J].食品工業(yè)科技，2014，35(8)：69-78.

[13]Hallenbeck PC, Grogger M, Mraz M, et al. The Use of Design of Experiments and Response Surface Methodology to Optimize Biomass and Lipid Production by the Oleaginous Marine Green Alga,NannochloropsisGaditanain Response to Light Intensity, Inoculum Size and CO2[J]. Bioresource Technology,2015,184(5):161-168.

[14]Guihéneuf F, Stengel DB. Towards the Biorefinery Concept: Interaction of Light, Temperature and Nitrogen for Optimizing the Co-production of High-value Compounds inPorphyridiumPurpureum[J].Algal Research,2015,10(7):152-163.

[15]魏明，劉艷艷，蔡為榮，等.霍山石斛多酚超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J].食品與機(jī)械，2016，32(7)：136-140.

[16]張文華，曹明容.常見分類化合物抗油脂氧化活性結(jié)構(gòu)關(guān)系理論研究[J].皮革科學(xué)與工程，2010，20(5)：10-15.

[17]吳胡琦，羅建平.霍山石斛的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2001，21(1)：208-211.

[18]殷培蕾，李靜，鄧園園，等.光照對(duì)苦蕎芽多酚類物質(zhì)及抗氧化活性的影響[J].成都大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2015，34(3)：209-213.

[19]周旋，周海燕，李向東，等.霍山石斛商品質(zhì)量研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2015，17(6)：533-539.

EffectofLightontheAccumulationofthePolyphenolsinDendrobiumhuoshanenseTangetChen

CHEN Chuanping1, CHEN Naidong2, LIU Guorui2

(1.WestAnhuiHeathVocationalCollege,Lu’an237005,China; 2.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,WestAnhuiUniversity,Lu’an237012,China)

[Objective] To investigate the effects of different light treatments on the accumulation of polyphenol in roots, stems and leaves ofDendrobiumhuoshanenseTang et Cheng, [Method] Respectively treated by red and blue light as well as imitation of natural light for 50 days, the polyphenols accumulating in the root, stems and leaves ofD.huoshanensewere analyzed by colorimetric method and high performance capillary electrophoresis combined with precipitation and knockout pretreatment. [Results] The accumulating rates of polyphenols were increased in the orders with root

Dendrobiumhuoshanense; capillary electrophoresis; polyphenols; light treatment; precipitation knockout

S567.2

A

1009-9735(2017)05-0006-04

2017-07-18

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2015A361)；國(guó)家自然科學(xué)基金(81573536，81274021)；中國(guó)博士基金特別資助(第后9批)(2016T90559)；中國(guó)博士后研究面上項(xiàng)目(2014M551791)；安徽省自然基金面上項(xiàng)目(1608085MH221)。

陳傳平(1972-)，男，安徽廬江人，副教授，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)與利用。