張高翔，金濤，王利

（1.西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，西藏拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，西藏拉薩 850000）

瀕危藥材胡黃連離體再生技術(shù)研究

張高翔1，金濤2，王利1

（1.西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，西藏拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，西藏拉薩 850000）

【目的】旨在為以后人工大面積栽培提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā客ㄟ^對胡黃連再生分化的研究，建立起胡黃連再生體系?！窘Y(jié)果】MS培養(yǎng)中添加一定濃度的6-BA，能較好地誘導(dǎo)不定芽的正常分化，有利于提高胡黃連不定芽分化的6-BA質(zhì)量濃度是2～4 mg/L，芽分化率最高可達(dá)22.2%，且不定芽生長健壯，但過高濃度的 6-BA (5 mg/L) 不利于芽的分化?！窘Y(jié)論】MS培養(yǎng)基中添加6-BA 2 mg/L 和NAA 0.05 mg/L 能夠更好地分化出不定芽，并生健壯，其中不定芽分化率可達(dá)23.0%。

胡黃連；再生；西藏

胡黃連為玄參科胡黃連屬多年生草本植物，是玄參科婆婆納族的最原始類群之一，具有較高的科學(xué)價(jià)值和藥用價(jià)值。目前，胡黃連已被列為國家二級保護(hù)野生珍稀瀕危植物，也是藏東南特有藥材之一，市場上所用胡黃連多來自于西藏亞東地區(qū)其余均為進(jìn)口[1-4]。

本實(shí)驗(yàn)主要對胡黃連離體培養(yǎng)體系進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨在打破傳統(tǒng)繁殖方式，保護(hù)現(xiàn)有的胡黃連野生資源，并對其實(shí)現(xiàn)可持續(xù)的開發(fā)利用，為西藏胡黃連人工栽培奠定基礎(chǔ)，為規(guī)?；a(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，為市場提供穩(wěn)定的藥材，也為進(jìn)一步研究胡黃連的生理習(xí)性及藥用價(jià)值提供條件。

1 材料和方法

1.1 材料

選用西藏地區(qū)野生胡黃連種子作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的培養(yǎng)

先篩選采回的胡黃連種子，由于胡黃連種子細(xì)小，采用水選的方法進(jìn)行篩選。

將篩選過的種子在超凈工作上用75%酒精消毒45～50 s、1 g/L汞消毒10 min，無菌水沖洗3次[5]，接種在MS培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種5～7粒種子，在25℃、16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)，光強(qiáng)2 000～2 500 Lx的條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)。10天后逐漸出現(xiàn)發(fā)芽，30～50天后無菌苗長成（圖1），可以作為離體培養(yǎng)的試材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 胡黃連無菌苗

1.2.2 不定芽誘導(dǎo)和分化

以胡黃連的無菌苗為供試材料，對其幼嫩莖段（1cm左右）進(jìn)行培養(yǎng)。

首先進(jìn)行不同質(zhì)量濃度6-BA的篩選，選出最佳6-BA濃度為2 mg/L；在最佳6-BA質(zhì)量濃度的基礎(chǔ)上篩選出最佳0.4 mg/L NAA的最佳濃度；最后選用2mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA兩種質(zhì)量濃度配比，研究了對胡黃連幼嫩莖段的不定芽誘導(dǎo)效果。

分化率（%）=分化的總芽數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.3 生根誘導(dǎo)

不定芽生長至1.0～1.5 cm高時(shí)，自芽基部切下，轉(zhuǎn)入0.3 mg/L NAA的MS生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，20天后觀察記錄。

1.2.4 再生苗的移栽

當(dāng)有4～7個(gè)不定根分化出后，開瓶口鍛煉10～15天，洗去根部的培養(yǎng)基，栽入培養(yǎng)土（蛭石、珍珠巖、園土的比例為1∶1∶3）中，在溫度20～22℃，空氣相對濕度為80%～90%的室內(nèi)培養(yǎng)7～10周，在幼苗約有3 cm高時(shí)，進(jìn)行正常栽培管理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度激素6-BA對不定芽誘導(dǎo)的影響

由表1可知，MS培養(yǎng)基中加入2 mg/L 6-BA對胡黃連不定芽誘導(dǎo)效果最好，不定芽分化系數(shù)為22.2%（圖2），比對照（CK）有所提升；當(dāng)6-BA為3和4 mg/L時(shí)，仍有較多的不定芽分化，但褐化較多，不定芽生長易徒長，長勢較弱，葉色淺，后期煉苗死亡率較高；5 mg/L 6-BA對不定芽誘導(dǎo)效果最差，無不定芽分化，表明6-BA在較低質(zhì)量濃度（2～4 mg/L）有利于不定芽的誘導(dǎo)分化，而高質(zhì)量濃度（5 mg/L）對不定芽誘導(dǎo)分化有一定的抑制作用，不定芽有待率低，甚至不能誘導(dǎo)出不定芽。

表1 不同濃度6-BA對不定芽的誘導(dǎo)效果

圖2 不定芽的分化

2.2 6-BA與不同質(zhì)量濃度NAA配比對不定芽的誘導(dǎo)影響

由表2可知，在對外植體誘導(dǎo)不定芽中，以MS培養(yǎng)基中添加2mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA和2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA的分化系數(shù)較高，不定芽的分化系數(shù)分別為23.0%和12.5%。因此認(rèn)為，MS+2 mg/L 6-BA中添加0.05 mg/L NAA的激素對不定芽的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用；而2 mg/L 6-BA與相對較低濃度（0.05～0.3 mg/L）NAA配比有利于不定芽誘導(dǎo)，但隨著NAA濃度的提高，反而不利于不定芽的誘導(dǎo)。因此在較低濃度的NAA情況下，有利于不定芽的萌發(fā)。

表2 2 mg/L 6-BA與不同質(zhì)量濃度NAA配比不定芽的誘導(dǎo)結(jié)果

2.3 不定芽生根的誘導(dǎo)及再生苗的移栽

當(dāng)不定芽長至1.0～1.5 cm時(shí)，即可切下接種到生根培養(yǎng)基進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)。以MS培養(yǎng)基添加0.3mg/L NAA為最好。小苗移入生根培養(yǎng)基后約20天即可產(chǎn)生不定根，40天左右便可出瓶。不定根誘導(dǎo)率達(dá)28%。將鍛煉好的幼苗移栽至基質(zhì)中（蛭石、珍珠巖、園土的比例為1∶1∶3），進(jìn)行培養(yǎng)。

3 結(jié)論

影響植物再生頻率的主要因素是培養(yǎng)基中的激素含量[6-7]。本實(shí)驗(yàn)在MS培養(yǎng)中添加一定濃度的6-BA，能較好地誘導(dǎo)不定芽的正常分化，有利于提高胡黃連不定芽分化的6-BA質(zhì)量濃度是2～4 mg/L，芽分化率最高可達(dá)22.2%，且不定芽生長健壯，但過高濃度的6-BA（5 mg/L）不利于芽的分化。

在MS基本培養(yǎng)基中同時(shí)加入細(xì)胞分裂素（6-BA）和生長素（NAA），更有利于不定芽的誘導(dǎo)，本研究表明，MS培養(yǎng)基中添加2 mg/L 6-BA和0.05 mg/L NAA能夠更好地分化出不定芽，并生健壯，其中不定芽分化率可達(dá)23.0%。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，由于胡黃連生長較慢，實(shí)驗(yàn)周期比預(yù)想要長很多，并且外植體較小，在培養(yǎng)過程中死亡率較高；在后期煉苗過程中，由于苗子較小，死亡率較高，這些都是在以后的實(shí)驗(yàn)中需要克服的?？傊?，建立胡黃連的離體快繁體系，打破傳統(tǒng)繁殖方式，為胡黃連人工栽培奠定基礎(chǔ)，為規(guī)?；a(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步研究胡黃連的生理習(xí)性及藥用價(jià)值提供條件，同時(shí)也為胡黃連的種質(zhì)資源保存提供新的思路。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院中藥大辭典編寫組.中藥大辭典(下冊)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1996.

[2]國家藥典委員會(huì).中國藥典(一部)[S].2005.

[3]付立國.中國植物紅皮書—稀有瀕危植物(第一冊)[M].北京:科學(xué)出版社,1992.

[4]澤仁旺姆,于順利,尼珍,等.獨(dú)一味等13個(gè)藏藥植物種在西藏的分布和資源量調(diào)查[J].北京農(nóng)業(yè),2012(12):56-60.

[5]曹孜義,劉國民.實(shí)用植物組織培養(yǎng)教程[M].蘭州:甘肅科學(xué)技術(shù)出版社,1996.

[6]潘瑞幟,董愚得.植物生理學(xué)[M].北京:高等教育出版社,1995.

[7]劉慶昌,吳國良.植物細(xì)胞組織培養(yǎng)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2003.

Tissue Culture and Plantlet Regeneration of Endangered Medicinal-- Picrorhiza scrophulariiflora Pennell

Zhang Gao-xiang1,Jin tao2,Wang li1
(1.Tibet Vocational Technical College，College of agricultural science and technology,Tibet Lhasa 850000；2.Tibet academy of Agriculture and animal husbandry Science,Agricultural resource and environment research institute,Tibet Lhasa 850000)

【Objective】The aim is to provide a theoretical basis for artificial large scale cultivation in the future.【Method】This passage discusses the method for the differentiation of shoot regeneratio .【Result】The differentiation of shoot regeneration was 22.2% with 6-BA 2--4 mg/L.But ,the high concentration of 6-BA (5 mg/L) is not conducive to bud differentiation.【Conclusion】It could improve the differentiation of shoot in MS medium complementing with 6-BA or NAA.

Tibet；Picrorhiza scrophulariiflora Pennell；regeneration

S567.239

A

2096-0387（2017）05-0030-03

2016年度西藏自治區(qū)高校青年教師創(chuàng)新支持計(jì)劃資助項(xiàng)目“瀕危藥材胡黃連立體快繁體系建立的研究”（QCZ2016-87）。

張高翔（1982—），女，河南信陽人，碩士，講師，研究方向：園藝植物栽培及繁育。