陳灶萍， 劉 軍， 查兵兵， 丁和遠(yuǎn)， 吳躍躍

復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,上海 200240

·論著·

老年Wistar大鼠脂聯(lián)素與脂蛋白脂肪酶的相關(guān)性

陳灶萍， 劉 軍*， 查兵兵， 丁和遠(yuǎn)， 吳躍躍

復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,上海 200240

目的探討老年Wistar大鼠脂聯(lián)素與血脂代謝紊亂及脂蛋白脂肪酶(LPL)的相關(guān)性。方法根據(jù)月齡，將Wistar大鼠分為老年組(20個(gè)月齡)、中年組(7個(gè)月齡)和青年組(3個(gè)月齡)。分別測(cè)定各組大鼠血清空腹血糖(FBG)、血脂和脂聯(lián)素。應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)大鼠皮下脂肪組織脂聯(lián)素mRNA、LPL mRNA及肝臟LPL mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果隨著月齡增加，血清脂聯(lián)素及脂肪脂聯(lián)素mRNA、LPL mRNA及肝臟LPL mRNA表達(dá)水平逐漸下降；老年組上述指標(biāo)顯著低于青年組(P<0.01)。老年組總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)、FBG水平高于青年組，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)低于青年組(P<0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示，血清脂聯(lián)素與脂肪LPL mRNA、肝臟LPL mRNA和HDL-C正相關(guān)(P<0.05)，與體質(zhì)量、月齡、TC、LDL-C、VLDL-C和TG負(fù)相關(guān)(P<0.05)；脂肪脂聯(lián)素mRNA與脂肪LPL mRNA、肝臟LPL mRNA、血清脂聯(lián)素、HDL-C正相關(guān)(P<0.05)，與體質(zhì)量、月齡、TC、LDL-C、VLDL-C負(fù)相關(guān)(P<0.05)；脂肪LPL mRNA與脂肪脂聯(lián)素mRNA、肝臟LPL mRNA、血清脂聯(lián)素、HDL-C正相關(guān)(P<0.05)，與體質(zhì)量、月齡、TC、LDL-C、VLDL-C、TG負(fù)相關(guān)(P<0.05)。多元逐步回歸分析顯示，血清脂聯(lián)素與VLDL-C呈獨(dú)立負(fù)相關(guān)(P<0.05)；脂肪脂聯(lián)素mRNA與TC、月齡獨(dú)立負(fù)相關(guān)(P<0.05)；脂肪LPL mRNA與月齡獨(dú)立負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論老年大鼠皮下脂肪和血清脂聯(lián)素水平降低；脂聯(lián)素水平下降與老年大鼠脂代謝紊亂有關(guān)，其可能通過調(diào)節(jié)LPL表達(dá)來影響血脂代謝。

老年；脂聯(lián)素；血脂代謝；脂蛋白脂肪酶

近年來，老年人血脂代謝異常的患病率明顯升高，但機(jī)制尚不明確[1]。脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過程的關(guān)鍵酶。研究[2]發(fā)現(xiàn)，LPL和脂聯(lián)素在嚴(yán)重的代謝綜合征患者中均減少，且脂聯(lián)素與LPL活性正相關(guān)。我們的既往研究[3]發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加，脂聯(lián)素水平逐漸降低，推測(cè)老年人脂質(zhì)紊亂可能與低脂聯(lián)素水平導(dǎo)致LPL活性下降有關(guān)。因此，本研究擬在大鼠模型中通過分析年齡增加、脂聯(lián)素、LPL變化的關(guān)系，探討脂代謝紊亂的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源及標(biāo)本留取 健康雄性Wistar大鼠36只(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)按月齡分為3組(n=12)：老年組(20個(gè)月齡)，中年組(7個(gè)月齡)，青年組(3個(gè)月齡)。大鼠自由進(jìn)食、水，環(huán)境溫度為(25±1)℃，晝夜周期為12 h/12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，所有動(dòng)物均空腹處死，處死前稱體質(zhì)量，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，取5 mm×5 mm×5 mm大小肝臟組織及皮下脂肪組織各2塊。血標(biāo)本離心后留取血清，肝臟及脂肪組織置于1.5 mL的EP管中，液氮冷卻后轉(zhuǎn)-70℃低溫冰箱保存，用于RNA提取。

1.2 血清脂聯(lián)素及血脂譜、血糖測(cè)定 血清脂聯(lián)素與極低密度脂蛋白-膽固醇(VLDL-C)采用ELISA法(試劑盒購自美國B-Bridge公司)。總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)采用酶法?？崭寡?FBG)采用己糖激酶法(浙江奧的特生物技術(shù)有限公司)。血清血糖、血脂采用羅氏全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.3 脂肪組織脂聯(lián)素mRNA、LPL mRNA和肝臟LPL mRNA測(cè)定 分別采用TRIzol試劑抽提組織RNA 1 μg，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列。脂聯(lián)素引物，上游：5′-GTT CCT CTT AAT CCT GCC CAG TC-3′，下游：5′-GTC ACC CTT AGG ACC AAG AAC AC-3′；產(chǎn)物長214 bp。LPL引物，上游：5′-GCA CAG TGG CTG AAA GTG AGA AC-3′，下游：5′-GAC CAG CGG AAG TAG GAG TCG TT-3′；產(chǎn)物長151 bp。每一標(biāo)本取cDNA模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，SYBR Premix ExTaq10 μL，ddH2O 8.2 μL，最后反應(yīng)總體積為20 μL。用封口膜(熒光定量專用)覆蓋96孔PCR板瞬間離心后放入熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：先在95℃預(yù)變性5 min，然后95℃20 s、60℃30 s、72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。將預(yù)試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物以10倍濃度梯度稀釋，以稀釋產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)生成反應(yīng)數(shù)據(jù)，應(yīng)用軟件Rotor-Gene 6.0生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過此標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算Ct值，經(jīng)內(nèi)參照GAPDH校正，校正值用2-ΔΔCt進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量及血清檢測(cè)結(jié)果比較 結(jié)果(表1)顯示：隨著月齡增加，血清脂聯(lián)素水平逐漸下降，老年組顯著低于青年組(P<0.01)。老年組TC、TG、LDL-C、VLDL-C水平最高，中年組次之，青年組最低。其中，老年組TC、TG、LDL-C水平顯著高于青年組(P<0.05)，而中年組較青年組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三組間兩兩比較VLDL-C水平及體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。老年組及中年組FBG水平高于青年組(P<0.05)。老年組HDL-C水平低于青年組(P<0.05)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及血清檢測(cè)結(jié)果的比較 n=12,

*P<0.05,**P<0.01與青年組相比；△P<0.05與中年組相比

2.2 總RNA提取及RT-PCR結(jié)果的鑒定 結(jié)果顯示：總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見5 S、18 S、28 S 3個(gè)條帶，說明所提取的RNA的完整性較好。RT-PCR產(chǎn)物電泳顯示目的基因片段與預(yù)期設(shè)計(jì)的目的基因片段大小相符，提示成功擴(kuò)增了目的基因。2.3 各組大鼠脂肪組織脂聯(lián)素mRNA、LPL mRNA及肝臟LPL mRNA表達(dá)水平比較 結(jié)果(表2)顯示：青年組脂肪脂聯(lián)素mRNA、脂肪LPL mRNA表達(dá)水平最高，中年組次之，老年組最低(P<0.05)。老年組、中年組肝臟LPL mRNA表達(dá)水平高于青年組(P<0.05)。

表2 各組間脂肪脂聯(lián)素 mRNA、LPL mRNA及肝臟LPL mRNA表達(dá)水平的比較 n=12,

*P<0.05,**P<0.01與青年組相比；△P<0.05 與中年組相比

2.4 Pearson相關(guān)分析 結(jié)果(表3)顯示：血清脂聯(lián)素水平與HDL-C正相關(guān)，與體質(zhì)量、月齡、TC、LDL-C、VLDL-C、TG負(fù)相關(guān)。

脂肪脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平與脂肪LPL mRNA、肝臟LPL mRNA、血清脂聯(lián)素、HDL-C水平正相關(guān)，與體質(zhì)量、月齡、TC、LDL-C和VLDL-C負(fù)相關(guān)。

脂肪LPL mRNA表達(dá)水平與脂肪脂聯(lián)素mRNA、肝臟LPL mRNA表達(dá)水平、血清脂聯(lián)素和HDL-C正相關(guān)，與體質(zhì)量、月齡、TC、LDL-C、VLDL-C、TG水平負(fù)相關(guān)。

2.5 Logistic多因素回歸分析 分別以血清脂聯(lián)素水平、脂肪脂聯(lián)素mRNA表達(dá)、脂肪LPL mRNA表達(dá)為因變量，月齡、體質(zhì)量、血脂為自變量進(jìn)行多元逐步回歸分析。結(jié)果顯示：血清脂聯(lián)素水平與VLDL-C獨(dú)立負(fù)相關(guān)(P=0.000)；脂肪脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平與TC(P=0.040)、月齡(P=0.000)獨(dú)立負(fù)相關(guān)；脂肪LPL mRNA表達(dá)水平與月齡獨(dú)立負(fù)相關(guān)(P=0.000)。

表3 血清脂聯(lián)素、脂肪脂聯(lián)素mRNA、脂肪LDL mRNA與相關(guān)代謝指標(biāo)的Pearson相關(guān)分析

3 討 論

人類血脂水平與年齡密切相關(guān)，老年人血脂異常患病率明顯增加，以總TC、TG增高及高密度脂蛋白(HDL)降低為主[4]。Wistar大鼠的平均壽命為2.5～3年, 20個(gè)月齡Wistar大鼠已經(jīng)進(jìn)入老年，相當(dāng)于人類70歲。本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠自然衰老的進(jìn)程中，TC、TG、LDL-C、VLDL-C、FBG均逐漸升高，HDL-C逐漸降低，與人類基本相符。該結(jié)果可能與脂聯(lián)素水平下降有關(guān)。本研究證實(shí)，隨著月齡增加，大鼠血清脂聯(lián)素濃度降低。該結(jié)果與我們之前對(duì)糖尿病患者一級(jí)非糖尿病親屬的5年隨訪中觀察得出的結(jié)論一致[3]。

脂聯(lián)素與糖脂代謝的調(diào)控關(guān)系密切[5]。低脂聯(lián)素血癥常伴有HDL-C降低和TG水平升高[6-7]，肥胖患者、2型糖尿病患者的脂聯(lián)素水平降低[2，8-9]。血清脂聯(lián)素水平的下降主要與脂肪脂聯(lián)素mRNA表達(dá)下降有關(guān)[10]。本研究證實(shí)，隨著月齡增加，大鼠脂肪脂聯(lián)素mRNA表達(dá)降低，脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平與HDL-C正相關(guān)，與體質(zhì)量、月齡、TC、LDL-C和VLDL-C負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步Logistic分析顯示，增齡是導(dǎo)致脂聯(lián)素水平降低的獨(dú)立因素。以上結(jié)論可以推測(cè)老年大鼠脂質(zhì)紊亂與低脂聯(lián)素水平相關(guān)。

血清LPL與TG負(fù)相關(guān)，與HDL-C正相關(guān)[11]，但血清LPL穩(wěn)定性欠佳。本研究采用Real-time PCR測(cè)定大鼠皮下脂肪組織和肝臟LPL mRNA的表達(dá)水平，顯示皮下脂肪組織LPL mRNA表達(dá)水平與TG、TC、LDL-C、VLDL-C負(fù)相關(guān)，與HDL-C正相關(guān)，說明皮下脂肪組織LPL mRNA表達(dá)水平與血脂代謝關(guān)系密切，可較好地反映體內(nèi)LPL的代謝狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，皮下脂肪組織LPL mRNA表達(dá)水平與體質(zhì)量、月齡負(fù)相關(guān)，在校正其他影響因素后仍與月齡獨(dú)立負(fù)相關(guān)，提示增齡是導(dǎo)致脂肪LPL mRNA表達(dá)下降的重要原因。

LPL主要在脂肪組織和肌肉中表達(dá)，而脂肪組織是脂聯(lián)素的唯一來源。因此，在脂聯(lián)素和LPL之間可能存在一種直接或間接的聯(lián)系。Terazawa-Watanabe等[12]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖、代謝綜合征及2型糖尿病女性LPL均與脂聯(lián)素相關(guān)，LPL的降低可能與低脂聯(lián)素血脂有關(guān)，并導(dǎo)致血脂紊亂。LPL與脂聯(lián)素水平在嚴(yán)重的代謝綜合征中均減少[2]，在急性心肌梗死患者中也降低。兩者相互影響，脂聯(lián)素水平和LPL活性獨(dú)立正相關(guān)[13]。本研究也顯示，大鼠皮下脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)與LPL mRNA表達(dá)水平正相關(guān)，且兩者均隨增齡而降低。因此，本研究提示老年大鼠脂質(zhì)代謝紊亂的可能機(jī)制是脂聯(lián)素水平下降，下降的脂聯(lián)素導(dǎo)致LPL mRNA表達(dá)下調(diào)，從而使LPL的活性下降，最終導(dǎo)致HDL-C水平下降及TG、TC水平升高。

然而，本研究僅初步探討了老年大鼠脂質(zhì)代謝紊亂的可能機(jī)制，下一步仍需在蛋白水平及細(xì)胞水平進(jìn)行更加深入的驗(yàn)證，從而為人類老年相關(guān)的脂質(zhì)代謝紊亂的發(fā)病機(jī)制提供參考。

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Correlation between adiponectin and lipoprotein lipase in aged Wistar rats

CHEN Zao-ping, LIU Jun*, ZHA Bing-bing, DING He-yuan, WU Yue-yue

Department of Endocrinology, The Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University, Shanghai 200240, China

Objective： To explore the relationship between adiponectin and dyslipidemia, lipoprotein lipase (LPL) in aged Wistar rats.MethodsWistar rats were divided into the aged group (20 months old), the middle-aged group (7 months old) and the young group (3 months old) according to the age. Serum fasting blood glucose (FBG), blood lipid, and adiponectin were measured in each group. The expression levels of adiponectin mRNA and LPL mRNA in the subcutaneous adipose tissue and LPL mRNA in the liver were detected by real-time PCR.ResultsWith the increase of age, the expression levels of serum adiponectin and fat adiponectin mRNA, LPL mRNA and liver LPL mRNA gradually decreased; the above indexes in the aged group were significantly lower than those in the young group (P<0.05). The levels of total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), very low density lipoprotein cholesterol (VLDL-C), and FBG of the aged group were higher than those of the young group (P<0.05), and the level of high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) of the aged group was lower than that of the young group (P<0.05). Pearson correlation analysis showed that serum adiponectin was positively correlated with fat LPL mRNA, liver LPL mRNA, and HDL-C (P<0.05), and negatively correlated with body weight, age, TC, LDL-C, VLDL-C, and TG (P<0.05). Fat adiponectin mRNA was positively correlated with fat LPL mRNA, liver LPL mRNA, serum adiponectin, and HDL-C (P<0.05), and negatively correlated with body weight, age, TC, LDL-C, and VLDL-C (P<0.05). Fat LPL mRNA was positively correlated with fat adiponectin mRNA, liver LPL mRNA, serum adiponectin and HDL-C (P<0.05), and negatively correlated with body weight, age, TC, LDL-C, VLDL-C, and TG (P<0.05). Multiple stepwise regression analysis showed that there was an independent negative correlation between serum adiponectin and VLDL-C (P<0.05); there was an independent negative correlation between fat adiponectin mRNA, TC and age (P<0.05); there was an independent negative correlation between fat LPL mRNA and age (P<0.05).ConclusionsThe level of adiponectin in subcutaneous fat and serum decreased in aged rats, and the decrease of adiponectin may be related to dyslipidemia in aged rats. It may affect the blood lipid metabolism by regulating the expression of LPL mRNA.

old age；adiponectin；blood lipid metabolism；lipoprotein lipase

2017-03-02接受日期2017-07-27

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)青年科研項(xiàng)目(20114Y110). Supported by Youth Research Project of Shanghai Municipal Health and Family Planning Commission (20114Y110).

陳灶萍, 碩士, 主治醫(yī)師. E-mail: czp028@163.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-24289502, E-mail: liujun89189@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170165

R -332

A

[本文編輯] 姬靜芳