蔣金舒，張 鑫，吳祖芳，翁佩芳

(寧波大學(xué)，浙江 寧波 315211)

響應(yīng)面優(yōu)化飲品中茶多酚磷脂復(fù)合物抑菌配方的研究

蔣金舒，張 鑫*，吳祖芳，翁佩芳

(寧波大學(xué)，浙江 寧波 315211)

以茶多酚磷脂復(fù)合物為研究對象，以茶多酚磷脂復(fù)合物對大腸桿菌的抑菌圈直徑作為抑菌效果指標，對茶多酚磷脂復(fù)合物的抑菌條件進行了研究?？疾觳瓒喾恿字瑥?fù)合物濃度、殼聚糖濃度、檸檬酸濃度對大腸桿菌抑菌圈值的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法對茶多酚磷脂復(fù)合物對大腸桿菌的抑制條件進行了優(yōu)化，依據(jù)回歸分析確定最優(yōu)提取條件。結(jié)果表明，最佳抑菌條件為：茶多酚磷脂復(fù)合物的濃度為3.22 g/L，殼聚糖濃度為31.06 g/L，檸檬酸濃度為2.45 g/L。在此抑菌條件下，茶多酚磷脂復(fù)合物對大腸桿菌的抑制圈值達到最大，為18.1 mm。

響應(yīng)面；抑菌；磷脂復(fù)合物

茶多酚(teapolyphenol,TP)是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，占茶葉干重的20%～30%[1]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗輻射及保護心血管等多種生物功能和生理特性[2-3]，是一種低毒、無副作用、安全性良好的天然添加劑。茶多酚在抑菌方面具有廣譜性和高效性，大量研究表明，茶多酚對食品中常見的微生物如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等具有良好抑制作用[4-5]。由于茶多酚的水溶特性影響了其在含油食品和植物油加工中的抑菌效果,從而在實際工業(yè)應(yīng)用生產(chǎn)中的利用度不容樂觀。磷脂是一類含磷酸根脂質(zhì)的總稱，是細胞膜的組成部分，具有降膽固醇、調(diào)節(jié)血脂、健腦、增強記憶力、延緩衰老等功能[6]。研究表明，通過磷脂包埋茶多酚后可增加茶多酚在油溶性環(huán)境下的利用率[7]。殼寡糖(Chitooligosaccharide，COS) 又名幾丁寡糖,是殼聚糖經(jīng)降解后聚合度為2～10的產(chǎn)物，由于其生物分子量低、溶解度高、在生物體內(nèi)的吸收能力強并且具有較好的生物相容性等[8]優(yōu)點，同時還具有多種生理活性如具有抗炎、增強免疫力[9]，抗腫瘤[10]，降血糖[11]等。殼寡糖通過抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長來降低亞硒酸鈉對人體健康的影響，并可以增強硒產(chǎn)品的抗腫瘤活性和調(diào)節(jié)人體內(nèi)腸道菌群的平衡[12]。殼寡糖來源天然，且具有抑菌作用，可以作為食品、乳品、飲料等的天然防腐劑，既可以發(fā)揮抑菌防腐的功能，還可以發(fā)揮良好的功能性作用。檸檬酸(Citric Acid,CA)是一種重要的有機酸，又名枸櫞酸。檸檬酸主要用作酸味劑、緩沖劑、抗氧化劑等。此外，檸檬酸還有抑制細菌[13]等作用。在食品添加劑方面主要用于碳酸飲料、果汁飲料、乳酸飲料等清涼飲料和腌制品。檸檬酸具有螯合作用和調(diào)節(jié)pH值的特性使其在速凍食品的加工中能增加抗氧劑的性能，抑制酶活性，延長食品保存期[14]。享有“西餐之王”美譽的檸檬具有很強的殺菌作用，對食品衛(wèi)生很有好處，再加上檸檬的清香氣味，人們歷來喜歡用其制作涼菜，不僅美味爽口，也能增進食欲。大腸桿菌(Escherichiacoli)又稱作大腸埃希氏菌，主要寄生于人及動物的腸道內(nèi)，是最常見的微生物之一，可引起腹瀉等疾病。隨著生活水平的提高，食品安全問題越來越受到人們的重視,大腸桿菌是食品安全問題主要的影響因素之一,是食品污染程度的重要參數(shù)指標[15]。

響應(yīng)面法(Response Surface Methodology)是利用合理的試驗設(shè)計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法[16]，是用于統(tǒng)計分析以找到不同復(fù)雜過程的最佳條件的有效和重要的工具，已經(jīng)應(yīng)用于以最小數(shù)量的實驗來優(yōu)化多個變量[17-18],解決受多種因素影響的最優(yōu)組合問題，該方法廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物、食品等領(lǐng)域[19]。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化了飲品中茶多酚磷脂復(fù)合物的抑菌條件，為今后對茶多酚磷脂復(fù)合物在食品工業(yè)領(lǐng)域的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(實驗室保藏)；殼聚糖、檸檬酸、茶多酚等均為食品級，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；茶多酚磷脂復(fù)合物(實驗室制備)；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基購于杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Laborota 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；雙人單面凈化工作臺，上海智成分析儀器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；牛津杯(直徑8 mm)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；移液槍，德國Eppendorf公司；DHG-9140 AS 型電熱鼓風(fēng)干燥器，寧波江南儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 茶多酚磷脂復(fù)合物的制備

茶多酚磷脂復(fù)合物的制備參照戴彥韻的方法并稍做修改[20]。在室溫下取大豆卵磷脂2 g置于燒杯中，加乙醚20 mL攪拌，直至磷脂完全溶解后，按m(茶多酚)∶m(大豆卵磷脂)=1∶1的質(zhì)量比將茶多酚添加至磷脂溶液中，逐漸升溫，并攪拌復(fù)合液直至復(fù)合液完全澄清，中途可適當(dāng)加入少許無水乙醇。停止攪拌，待冷至室溫，過濾，回收溶劑，再將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無有機揮發(fā)物質(zhì)殘留后，放置于真空干燥箱中真空干燥24 h，得到復(fù)合率大于98%的茶多酚磷脂復(fù)合物產(chǎn)品。

1.3.2 菌種活化

配制大腸桿菌適宜生長的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，將大腸桿菌從保藏狀態(tài)恢復(fù)到室溫狀態(tài)，再將液態(tài)的大腸桿菌接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。從固體培養(yǎng)基中挑選出茁壯的菌落，再接種到LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，重復(fù)此步驟2～3次。

1.3.3 菌懸液的制備

用移液槍在振蕩混勻后的液體培養(yǎng)基中取1 mL菌液，于滅菌9 mL無菌生理鹽水的試管內(nèi),振蕩混勻，重復(fù)，稀釋至10-4制成菌懸液，供實驗使用。

1.3.4 茶多酚磷脂復(fù)合物對大腸桿菌的抑制作用

從稀釋好的菌種試管中取0.1 mL涂布于固體培養(yǎng)基,放入牛津杯,每個杯中分別注入相應(yīng)濃度的抑菌劑0.2 mL，置于37 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑大小。

1.3.5 單因素實驗

以抑菌圈直徑為衡量指標，分別研究茶多酚濃度、殼聚糖濃度和檸檬酸濃度和茶多酚磷脂復(fù)合物濃度、殼聚糖濃度和檸檬酸濃度兩組3個因素對大腸桿菌的抑制效果優(yōu)化。

1.3.6 響應(yīng)面實驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計因素水平，以茶多酚和茶多酚磷脂復(fù)合物濃度、殼聚糖濃度和檸檬酸濃度3個因素為自變量，以抑菌圈直徑為響應(yīng)值，采用Design Expert軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗方案，確定最佳提取條件的因素和水平，建立數(shù)學(xué)回歸模型，對工藝參數(shù)進行最優(yōu)化分析，因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平及編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 茶多酚及茶多酚磷脂復(fù)合物的抑菌效果

設(shè)定殼聚糖濃度20 g/L，檸檬酸濃度2 g/L，研究不同濃度的茶多酚及茶多酚磷脂復(fù)合物對大腸桿菌的抑制效果，結(jié)果如圖1所示。由圖可知，隨著抑制劑濃度的提高，抑菌圈值顯著增大，濃度低于3 g/L的抑菌圈值增加的趨勢明顯大于濃度高于3 g/L，這可能是由于抑菌劑的濃度趨于飽和。說明增加茶多酚或茶多酚磷脂復(fù)合物的濃度對抑菌的作用影響不大，因此確定3 g/L為抑菌的最適濃度。

圖1 抑制劑濃度對抑菌效果的影響

2.1.2 殼聚糖的抑菌效果

設(shè)定抑制劑濃度3 g/L，檸檬酸濃度2 g/L，研究不同濃度的殼聚糖對大腸桿菌的抑制效果，結(jié)果如圖2所示。由圖可知，隨著抑制劑濃度的提高，抑菌圈值不斷增大，當(dāng)濃度大于30 g/L的抑菌圈值增加的趨勢變的平緩。說明增加殼聚糖的濃度對抑菌的作用影響不大，因此確定30 g/L為殼聚糖抑菌的最適濃度。

2.1.3 檸檬酸的抑菌效果

設(shè)定抑制劑濃度3 g/L，殼聚糖濃度20 g/L，研究不同濃度的殼聚糖對大腸桿菌的抑制效果，結(jié)果如圖3所示。由圖可知，隨著抑制劑濃度的提高，抑菌圈值不斷增大，當(dāng)濃度大于2 g/L的抑菌圈值增加的趨勢變的平緩。此條件下，體系的抑菌作用明顯強，可能是由于檸檬酸濃度增加，使pH降低，有利于促進殼寡糖的抑菌作用[21]。

圖2 殼聚糖濃度對抑菌效果的影響

圖3 檸檬酸濃度對抑菌效果的影響

由單因素實驗結(jié)果可知，茶多酚磷脂復(fù)合物對大腸桿菌的抑制作用比茶多酚強，故用響應(yīng)面繼續(xù)分析優(yōu)化茶多酚磷脂復(fù)合物對大腸桿菌的最佳抑制條件。

2.2 響應(yīng)面分析抑菌效果

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計因素水平，選取茶多酚磷脂復(fù)合物、殼聚糖、檸檬酸對大腸桿菌抑制效果顯著的3個因素，運用Design Expert 軟件的試驗設(shè)計原理，以表1的因素水平設(shè)計17組試驗，試驗分析方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面法設(shè)計與試驗結(jié)果

續(xù)表2

試驗號A茶多酚磷脂復(fù)合物濃度/(mg/mL)B殼聚糖/(g/L)C檸檬酸濃度/(g/L)Y：茶多酚磷脂復(fù)合物抑菌圈值/(mm)132．0030．001．5015．2143．0040．001．5015．6152．0030．002．5016．8163．0030．002．0017．7173．0040．002．5017．5

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析

利用Design-Expert軟件，對表4中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得抑菌圈直徑對茶多酚磷脂復(fù)合物濃度、殼聚糖濃度和檸檬酸濃度的二次多項回歸方程，分別為:Y=17.72+0.38A+0.1B+0.83C+0.25AB-0.025AC+0.075BC-0.81A2-0.81B2-0.46C2

2.2.3 茶多酚磷脂復(fù)合物的回歸模型方差分析

表3 茶多酚磷脂復(fù)合物回歸模型方差分析

注：“**”表示極顯著水平(P<0.01)；“*”表示顯著水平(P<0.05)；R2=0.9892；CV=1.91%

用F檢驗判定回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性，概率越小，表示相應(yīng)變量的顯著程度越高。從表3可知，回歸方程模型的P值小于0.0001，表示用該回歸方程描述三個因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，因變量與全體自變量之間的關(guān)系是極其顯著的，說明了該方法是可靠的。失擬項P>0.05，差異不顯著，表明無失擬因素存在，即可以用該數(shù)學(xué)模型預(yù)測試驗結(jié)果[22]。相關(guān)系數(shù)R2=0.9892,說明該模型能解釋98.92 %的響應(yīng)面變化，表明該模型對試驗的擬合優(yōu)度較好。變異系數(shù)(CV)為1.91%，說明其置信度較高，模型方程能夠較好地反映真實的試驗值，可用此模型分析響應(yīng)值的變化。綜合以上分析可以說明該模型可以用來分析和預(yù)測大腸桿菌的最佳抑制條件。由回歸方程及表可見，各試驗因素對響應(yīng)值的影響不是成簡單的線性關(guān)系，因素A2及C的影響差異極顯著，A、B2和C2的影響差異顯著，表明以上因素對抑菌條件有顯著影響。由3因素的P值可見，各因素對大腸桿菌的抑制效果大小順序為：檸檬酸> 茶多酚磷脂復(fù)合物 >殼聚糖。

2.2.4 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各因素所構(gòu)成的三維空問的曲面圖，響應(yīng)曲面的形狀分別反映了各因素的交互作用情況。兩因素交互作用的響應(yīng)曲面及其等高線見圖，表示了茶多酚磷脂復(fù)合物、殼聚糖及檸檬酸3個因素中任意一個變量為零水平時，其余兩個變量對大腸桿菌抑制效果的影響。可見，隨著3個因素的增大相應(yīng)曲面均呈先增后降的趨勢，說明3個因素在所選范圍內(nèi)能產(chǎn)生最佳的響應(yīng)值。響應(yīng)曲面的陡峭程度反映了響應(yīng)值對于因素變化的敏感程度。如果響應(yīng)曲面圖坡度平緩，表明響應(yīng)值對因素的變化不敏感；如果響應(yīng)曲面圖的坡度陡峭，表明響應(yīng)值對因素的變化較敏感[23-24]。當(dāng)檸檬酸濃度零點值時,茶多酚磷脂復(fù)合物濃度和殼聚糖濃度兩者之間相互作用的等高線接近圓形,交互作用不顯著；同時由等高線疏密程度可以判斷,茶多酚磷脂復(fù)合物濃度和殼聚糖濃度對大腸桿菌的抑制作用影響相當(dāng)。當(dāng)殼聚糖濃度零點值時,茶多酚磷脂復(fù)合物濃度和檸檬酸濃度兩者之間相互作用的等高線為橢圓形,交互作用顯著；同時由等高線疏密程度可以判斷,檸檬酸濃度對大腸桿菌的抑制作用較茶多酚磷脂復(fù)合物濃度明顯。當(dāng)茶多酚磷脂復(fù)合物濃度零點值時,殼聚糖濃度和檸檬酸濃度兩者之間相互作用的等高線為橢圓形,交互作用顯著；同時由等高線疏密程度可以判斷,檸檬酸濃度對大腸桿菌的抑制作用較殼聚糖濃度顯著。由兩因素交互作用圖可見，檸檬酸的抑菌作用顯著，茶多酚磷脂復(fù)合物次之，而殼聚糖得抑菌作用則相對不顯著。

2.2.5 茶多酚磷脂復(fù)合物抑菌條件的確定

經(jīng)Design-Expert軟件分析優(yōu)化，結(jié)合二次回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果，得出抑菌的最佳工藝參數(shù)為：茶多酚磷脂復(fù)合物濃度3.22 g/L，殼聚糖濃度31.06 g/L，檸檬酸濃度2.45 g/L。在此條件下預(yù)測的抑菌圈直徑值達最大，為18.12 mm。在此條件下進行的3次驗證試驗，結(jié)果顯示抑菌圈直徑值為18.1 mm。與響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果差異不顯著，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié) 論

使用響應(yīng)面法試驗設(shè)計克服了正交設(shè)計只能處理離散的水平值而無法找出整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷，并能減少試驗次數(shù)，分析幾種因素間的交互作用，以達到較全面地反映各因素水平的效果[25]。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上將響應(yīng)面分析應(yīng)用到茶多酚磷脂復(fù)合物對大腸桿菌的抑制條件優(yōu)化，最終獲得最佳抑制工藝參數(shù)為：茶多酚磷脂復(fù)合物濃度3.22 g/L，殼聚糖濃度31.06 g/L，檸檬酸濃度2.45 g/L。在此條件下，抑菌圈直徑值達最大，為18.1 mm，與模型理論預(yù)測值(18.12 mm)接近。表明可以將此響應(yīng)面優(yōu)化工藝較好的應(yīng)用到茶多酚磷脂復(fù)合物對大腸桿菌的抑制，為今后延長乳制品或飲料保鮮提供依據(jù)。

圖4 各兩因素交互作用對抑菌效果的影響

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ResponseSurfacetoOptimizetheAntibacterialFormulaofTeaPolyphenolPhospholipidComplexinDrink

Jiang Jinshu,Zhang Xin*,Wu Zufang,Weng Peifang

(Ningbo University,Ningbo 315211,China)

The antibacterial conditions of tea polyphenol phospholipid complex (TPC) were studied.The inhibitory effect of TPC on the inhibition zone ofEscherichiacoli(E.coli) was studied.The effects of TPC concentration,Chitooligosaccharide(COS) concentration and citric acid(CA) concentration on the inhibition zone ofE.coliwere investigated.On the basis of single factor test,the inhibition condition ofE.coliwas optimized by response surface methodology of 3 factors and 3 levels,and the optimal extraction conditions were determined by regression analysis.The results showed that the optimum antibacterial conditions were as follows: the concentration of TPC was 3.22 g/L,the concentration of COS was 31.06 g/L and the concentration of CA was 2.45 g/L.In this antibacterial conditions,inhibition circle of TPC onE.colito the maximum,is 18.1 mm.

response surface;antibacterial;phospholipid complex

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.05.003

2017-03-20

國家自然科學(xué)基金(31501473)；浙江省自然科學(xué)基金(LQ15C200003)；寧波市惠民富民項目(2015C10061)。

蔣金舒(1990—),女,碩士研究生,主要研究方向:食品生物技術(shù)。E-mail: 870586955@qq.com

*通訊作者：張鑫(1986—),男,博士,講師,主要研究方向: 食品生物技術(shù)。E-mail: zhangxin@nbu.edu.cn

TS201.2

A

1006-9690(2017)05-0012-05