趙 爽 ，劉昆侖 *，陳復(fù)生

（河南工業(yè)大學(xué) 1.谷物資源轉(zhuǎn)化與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

酶法制備富硒糙米抗氧化肽的研究

趙 爽1，2，劉昆侖1，2*，陳復(fù)生2

（河南工業(yè)大學(xué) 1.谷物資源轉(zhuǎn)化與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

采用酶法制備富硒糙米抗氧化肽，研究了酶種類、酶解時(shí)間、酶解溫度、底物濃度、pH和加酶量對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，堿性蛋白酶較適宜制備富硒糙米抗氧化肽。在單因素的基礎(chǔ)上，以總抗氧化能力為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了富硒糙米抗氧化肽的最佳制備工藝，其條件為：底物濃度3%，pH 8.0，酶解時(shí)間2.0 h，溫度50℃，加酶量7 550 U/g。該條件下制備的抗氧化肽的總抗氧化能力為（16.16±0.22）μmol/g?？寡趸脑谑称诽貏e是功能性食品中的應(yīng)用，對(duì)于保持食品品質(zhì)、提高機(jī)體抗氧化機(jī)能具有積極作用。

富硒糙米；抗氧化肽；響應(yīng)面法；酶解

0 引言

食品中的氧化反應(yīng)會(huì)使食品變色、營(yíng)養(yǎng)成分損失，甚至?xí)a(chǎn)生不良風(fēng)味和有害物質(zhì)[1]。此外，過(guò)量的自由基會(huì)破壞機(jī)體內(nèi)的生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能的氧化損傷，并引發(fā)癌癥、心血管疾病等[2-3]。為了預(yù)防食品變質(zhì)和疾病發(fā)生，抑制食品中自由基的產(chǎn)生顯得尤為重要。人工合成的抗氧化劑如丁基羥基茴香醚（BHA）、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）等雖能有效抑制食品中的氧化反應(yīng)，但具有潛在風(fēng)險(xiǎn)，在食品中的應(yīng)用受到嚴(yán)格限制[4]。因此，天然來(lái)源的抗氧化劑引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注。食源性抗氧化肽具有安全有效、分子質(zhì)量低、易吸收等優(yōu)點(diǎn)，還具有特殊的營(yíng)養(yǎng)和功能特性。近年來(lái)，以動(dòng)植物蛋白為原料制備高活性的抗氧化肽成為研究熱點(diǎn)[5-8]。

硒是人體所必需的微量元素，具有抗氧化、抗癌、抗病毒等多種特性[9]。硒以硒代半胱氨酸（SeCys）及硒代甲硫氨酸（SeMet）的形式位于多種硒酶的活性中心，調(diào)節(jié)硒酶清除機(jī)體內(nèi)的過(guò)氧化物，抵抗機(jī)體內(nèi)的氧化損傷。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)硒的抗氧化作用研究多集中于硒酶和硒蛋白。但是硒酶和硒蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，易受加工貯藏環(huán)境影響而變性失活。已有研究證實(shí)，硒蛋白的水解產(chǎn)物，小分子的富硒肽具有一定的抗氧化活性[10-11]。

作者從富硒糙米中提取硒蛋白，通過(guò)酶解制備富硒抗氧化肽，以總抗氧化能力為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法分析各因素對(duì)富硒抗氧化肽活性的影響，建立最佳制備工藝，為富硒抗氧化肽在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水稻（隆粳968）：安徽隆平高科種業(yè)有限公司；堿性蛋白酶（189.57 U/mg）、中性蛋白酶（107.39 U/mg）、胃蛋白酶（28.63 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（21.55 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；總抗氧化能力測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 富硒糙米的制備

參照Liu等[12]的方法制得，富硒糙米硒含量為6.26 μg/g 。

1.2.2 硒蛋白的提取

根據(jù)Yue等[13]報(bào)道的方法提取富硒糙米硒蛋白。富硒糙米粉碎后過(guò) 100目篩，正己烷（W/V=1∶3）振蕩脫脂7 h，通風(fēng)櫥過(guò)夜使溶劑揮發(fā)。稱取脫脂富硒糙米粉45 g， 用蒸餾水 （W/V=1∶3） 浸泡12 h，攪拌成懸浮液后加入0.1 mol/L NaOH溶液（W懸浮液:VNaOH溶液=1∶3）。 將懸浮液在 45 ℃下攪拌2 h，4 000 r/min離心30 min，取上清液，用 0.1 mol/L HCl調(diào)pH值至5.5，4 000 r/min離心20 min，沉淀洗滌兩次后將pH調(diào)至7.0，冷凍干燥備用。

1.2.3 富硒糙米蛋白的酶解工藝

富硒糙米蛋白（控制一定的底物濃度）→調(diào)節(jié)pH→攪拌（37℃，15 min）→加酶（控制一定的時(shí)間和溫度）→滅酶（90℃，10 min）→離心（8 000 r/min，15 min）→收集上清液（測(cè)定抗氧化活性及水解度）→冷凍干燥。

1.2.4 水解度（DH）測(cè)定

茚三酮比色法[14]。將酶解液稀釋一定倍數(shù)后，8 000 r/min離心 15 min，取上清液2 mL，加入 pH 8.04的磷酸鹽緩沖液0.5 mL和2%（W/V）的茚三酮溶液0.5 mL，搖勻，沸水浴15 min后，立即冷卻至室溫，定容至25 mL，搖勻，靜置15 min后在波長(zhǎng)570 nm處進(jìn)行比色，以試劑空白為參比溶液。

1.2.5 總抗氧化能力（Trolox value）測(cè)定

根據(jù)總抗氧化能力（Trolox value）試劑盒（ABTS快速法）的方法測(cè)定。將酶解液稀釋一定倍數(shù)后，8 000 r/min 離心 15 min，依次加入 10 μL 待測(cè)樣品，20 μL過(guò)氧化物酶應(yīng)用液和170 μL ABTS工作液于96孔板中，室溫下反應(yīng)6 min，在波長(zhǎng)405 nm處用酶標(biāo)儀讀取各孔OD值，以蒸餾水為空白對(duì)照，Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品。

式中：Trolox value為樣品的總抗氧化能力（μmol/g）；cTrolox為樣品相當(dāng)于Trolox的濃度（mmol/mL），將OD值代入Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線得出；m為糙米蛋白的質(zhì)量（g）；V為反應(yīng)液的總體積；n為稀釋倍數(shù)。

1.2.6 單因素試驗(yàn)

胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味酶4種酶對(duì)富硒糙米蛋白的酶解條件如表1所示，以水解度和總抗氧化能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出最佳蛋白酶。

利用篩選出的蛋白酶水解富硒糙米蛋白，考察底物質(zhì)量濃度 （1、3、5、7、9 g/100 mL）、pH（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、溫度（30、40、45、50、60 ℃）和加酶量（4 000、8 000、12 000、16 000、20 000 U/g）對(duì)水解度及抗氧化活性的影響。

表1 不同蛋白酶的水解條件Table 1 Hydrolysis conditions of different proteases

1.2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以時(shí)間（A）、溫度（B）和加酶量（C）為自變量，總抗氧化能力（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平編碼見表2。

表2 因素水平編碼Table 2 Code and level of factors chosen

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics（V.21）進(jìn)行單因素方差分析，Design Expert（V.8.0.6）軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 蛋白酶種類對(duì)富硒糙米抗氧化肽活性的影響

多肽的氨基酸種類與其活性密切相關(guān)，不同種類蛋白酶的作用位點(diǎn)具有差異性，因此需要篩選合適的蛋白酶進(jìn)行酶解。選擇堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和風(fēng)味酶對(duì)糙米硒蛋白進(jìn)行酶解，4種蛋白酶的水解度和抗氧化活性與時(shí)間的變化關(guān)系如圖1所示。風(fēng)味酶的水解能力強(qiáng)于堿性蛋白酶和中性蛋白酶，胃蛋白酶水解能力較弱（圖1A）。這主要是由于風(fēng)味酶既是內(nèi)切酶又是外切酶，水解產(chǎn)物中含有較多游離氨基酸，因此其水解度最高[15]。堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性略高于中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，胃蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性遠(yuǎn)低于其他3種酶。綜合考慮糙米硒蛋白酶解產(chǎn)物的水解度和抗氧化活性，堿性蛋白酶最適宜制備抗氧化活性肽，胃蛋白酶不適宜用于水解糙米硒蛋白。由圖1B可知，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨水解時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其抗氧化活性在1.5 h時(shí)最高。

圖1 蛋白酶種類對(duì)富硒糙米蛋白水解度及產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of enzyme species on DH and antioxidant activity of hydrolysates of Se-enriched brown rice protein

2.1.2 底物濃度對(duì)富硒糙米抗氧化肽活性的影響

在pH為8.0、溫度為45℃、加酶量為12 000 U/g、酶解時(shí)間2.0 h的條件下，考察底物濃度對(duì)糙米硒蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性和水解度的影響，結(jié)果見圖2。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，糙米硒蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性和水解度均達(dá)到最大值，分別為14.42 μmol/g和11.55%。當(dāng)?shù)鞍诐舛容^低時(shí)，底物能與蛋白酶充分接觸，增加底物濃度能促進(jìn)多肽的生成，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到飽和點(diǎn)后，繼續(xù)增加底物濃度會(huì)抑制蛋白酶的酶解效率，因此最適底物濃度為3%。張楊等[16]對(duì)蒲公英籽蛋白進(jìn)行酶解時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨底物濃度的增加，酶解物的抗氧化能力和水解度呈現(xiàn)先增大后基本不變甚至下降的趨勢(shì)。

2.1.3 pH值對(duì)富硒糙米抗氧化肽活性的影響

在底物濃度為5%、溫度為45℃、加酶量為12 000 U/g、酶解時(shí)間2.0 h的條件下，考察pH值對(duì)糙米硒蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性和水解度的影響，結(jié)果見圖3。pH值會(huì)影響蛋白酶和底物蛋白的解離狀態(tài)，從而影響蛋白酶與底物的結(jié)合[16]。當(dāng)pH值為8.0時(shí)，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性最強(qiáng)，水解度也最高。

圖2 底物濃度對(duì)富硒糙米蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on antioxidant activity of hydrolysates of Se-enriched brown rice protein

圖3 pH值對(duì)富硒糙米蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of pH on antioxidant activity of hydrolysates of Se-enriched brown rice protein

2.1.4 加酶量對(duì)富硒糙米抗氧化肽活性的影響

在底物濃度為5%、pH值為8.0、酶解溫度為45℃、酶解時(shí)間為2.0 h的條件下，考察加酶量對(duì)糙米硒蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性和水解度的影響。由圖4可知，當(dāng)加酶量小于8 000 U/g時(shí)，糙米硒蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性和水解度均隨加酶量的增加呈顯著增加的趨勢(shì)。當(dāng)加酶量大于8 000 U/g時(shí)，雖然水解度仍顯著增加，但是抗氧化活性趨于穩(wěn)定。且當(dāng)加酶量大于16 000 U/g時(shí)，抗氧化活性略有下降。這是由于加酶量過(guò)高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致糙米硒蛋白過(guò)度水解，抗氧化肽結(jié)構(gòu)被破壞，抗氧化活性降低。因此，確定最適加酶量為4 000～8 000 U/g。

圖4 加酶量對(duì)富硒糙米蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on antioxidant activity of hydrolysates of Se-enriched brown rice protein

2.1.5 溫度對(duì)富硒糙米抗氧化肽活性的影響

在底物濃度為 5%、pH值為 8.0、加酶量為12 000 U/g、，酶解時(shí)間為2 h的條件下，考察酶解溫度對(duì)糙米硒蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性和水解度的影響。由圖5可知，酶解產(chǎn)物的抗氧化活性和水解度隨溫度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。在一定的溫度范圍內(nèi)，蛋白酶的活性會(huì)隨溫度的升高而增加，因此水解度會(huì)呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)。但是當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，蛋白酶會(huì)變性失活，使酶解能力降低。當(dāng)酶解溫度為45℃時(shí)，糙米硒蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最強(qiáng)，且水解度也達(dá)到最大值。張輝等[17]認(rèn)為蛋白酶有一定的酶解溫度范圍，當(dāng)溫度超過(guò)蛋白酶的最適范圍時(shí)，會(huì)影響酶解反應(yīng)，不利于多肽生成，從而降低酶解物的抗氧化能力。

圖5 溫度對(duì)富硒糙米蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on antioxidant activity of hydrolysates of Se-enriched brown rice protein

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

綜合單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選擇堿性蛋白酶水解糙米硒蛋白，固定底物濃度為3%、pH值為8.0，選擇酶解時(shí)間、酶解溫度和加酶量為考察因素，根據(jù)Box-Behnken原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。采用 Design-Expert（V.8.0.6）軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程為：

由表4可知，回歸模型極顯著（P=0.003 3），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.720 3），說(shuō)明該模型的擬合度好，可靠性高；模型的決定系數(shù)R2=0.967 5，調(diào)整性決定系數(shù)R2Adj=0.909 1，表明抗氧化能力由該模型解釋的可能性為90.91%，該方程能夠較好地預(yù)測(cè)酶解條件對(duì)多肽抗氧化能力的影響。此外，F(xiàn)檢驗(yàn)可反映各因子的貢獻(xiàn)率，F(xiàn)值越大，表明對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越顯著，由此可知，各因素對(duì)多肽抗氧化活性的影響順序?yàn)椋簳r(shí)間＞加酶量＞溫度。

圖6能夠直觀地反映各因素對(duì)抗氧化能力的影響。圖6A為加酶量為零水平時(shí)，酶解時(shí)間（X1）和酶解溫度（X2）的交互作用，響應(yīng)曲面沿X1軸的坡度明顯高于X2，說(shuō)明時(shí)間的變化對(duì)抗氧化活性的影響強(qiáng)于溫度的變化。等高線呈橢圓形說(shuō)明時(shí)間與溫度的交互作用非常顯著。圖6B是酶解溫度為零水平時(shí)，酶解時(shí)間（X1）和加酶量（X3）的交互作用，隨著加酶量的增加抗氧化活性先增加后趨于平緩。圖 6C是酶解溫度（X2）和加酶量（X3）的交互作用，響應(yīng)曲面沿X3軸的坡度明顯高于X1，說(shuō)明時(shí)間的變化對(duì)抗氧化活性的影響更顯著。

經(jīng)計(jì)算得出最佳試驗(yàn)條件為：酶解時(shí)間2.0 h，酶解溫度50℃，加酶量7 547.17 U/g。根據(jù)實(shí)際操作條件，將最佳試驗(yàn)條件設(shè)定為底物濃度3%、pH值 8.0、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度50℃、加酶量 7 550 U/g。在此條件下，糙米硒蛋白酶解液的抗氧化能力為 （16.16±0.22） μmol/g， 與預(yù)測(cè)值 16.27 μmol/g的相對(duì)誤差為0.69%，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳酶解條件可靠。

2.3 富硒糙米抗氧化肽與非富硒糙米抗氧化肽的活性比較

在最佳酶解條件：底物濃度3%、pH值8.0、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度50℃、加酶量7 550 U/g下對(duì)同品種的非富硒糙米蛋白進(jìn)行酶解，并測(cè)定其抗氧化活性為（12.63±0.39） μmol/g，低于該條件下富硒糙米蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，說(shuō)明硒可以提高糙米蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化能力。Liu等[10]從富硒糙米中分離純化出一種富硒肽（SeMet-Pro-Ser），具有較強(qiáng)的清除能力。但是糙米蛋白酶解產(chǎn)物中硒的抗氧化作用途徑還有待進(jìn)一步研究。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Respond surface experimental design and results

表4 回歸方程各項(xiàng)方差分析Table 4 ANOVA analysis of regression equation

圖6 因素交互作用對(duì)富硒糙米蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of factors interaction on antioxidant activity of hydrolysates of Se-enriched brown rice protein

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味酶水解糙米硒蛋白，并測(cè)定酶解液的抗氧化活性，研究發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性略高于中性蛋白酶和風(fēng)味酶，胃蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性最差。在單因素的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)酶解時(shí)間、酶解溫度和加酶量3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，得到的模型可靠，擬合度良好。各因素對(duì)糙米硒蛋白酶解液抗氧化活性影響的主次順序?yàn)椋簳r(shí)間>加酶量>溫度。最適酶解條件為底物濃度3%、pH 8.0、時(shí)間2.0 h、溫度50℃、加酶量7 550 U/g。該條件下所得酶解液的抗氧化能力為（16.16±0.22） μmol/g，與預(yù)測(cè)值相近，該模型能夠用于預(yù)測(cè)糙米硒蛋白酶解液的抗氧化活性。富硒糙米蛋白酶解產(chǎn)物具有顯著的抗氧化活性，可用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，為消費(fèi)者提供新型食療保健產(chǎn)品。

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PREPARATION OF ANTIOXIDANT PEPTIDES FROM SE-ENRICHED BROW RICE BY ENZYMATIC HYDROLYSIS

ZHAO Shuang1，2，LIU Kunlun1，2，CHEN Fusheng2
（1.The Key Lab of Conversion and Utilization of Grain Resource of Henan Province；2.College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

Antioxidant peptides from Se-enriched brown rice were prepared by enzymatic hydrolysis method.Effects of six factors including enzyme species，hydrolysis time，hydrolysis temperature，substrate concentration，pH and enzyme dosage on the antioxidant activities of hydrolysates of Se-enriched brown rice protein were studied in this work. Response surface methodology was used to optimize the enzymolysis conditions with the total antioxidant capacity （Trolox valve）as evaluation index，based on the results of the single factor experiments.The results showed that alkaline protease was suitable for producing antioxidant peptides from Se-enriched brown rice. The optimal enzymolysis conditions were as follows: substrate concentration of 3% ，pH value of 8.0，enzymolysis temperature of 50 ℃，enzymolysis time of 2.0 h and enzyme dosage of 7 550 U/g protein，under which the Trolox valve was up to （16.16±0.22） μmol/g. The application of antioxidant peptides in the food industry especially in functional food plays a positive role to keep the food quality and improve the antioxidation function of the organism.

Se-enriched brown rice; antioxidant peptides; response surface methodology; enzymolysis

TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

1673-2383(2017)05-0005-06

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-10-30 9:36:32

2017-02-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31601417；U1404333）；河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（162102110059）；河南省省屬高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2014YWQQ03）

趙爽（1991—），女，河南確山人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锏鞍踪Y源開發(fā)與利用。

*通信作者