鄭德俊 高俊鵬 方穗雄 張彥紅 張麗華

（廣州市第一人民醫(yī)院·510180）

蓯蓉總苷膠囊對(duì)AD大鼠行為學(xué)障礙的影響*

鄭德俊 高俊鵬 方穗雄 張彥紅 張麗華

（廣州市第一人民醫(yī)院·510180）

目的：探討蓯蓉總苷膠囊對(duì)阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD）大鼠行為學(xué)障礙的影響。方法：用水迷宮法分別測(cè)試AD大鼠造模前后及給予蓯蓉總苷膠囊干預(yù)后的學(xué)習(xí)記憶功能改善情況。結(jié)果：模型組AD大鼠在水迷宮找到平臺(tái)的時(shí)間明顯延長，經(jīng)過的路程明顯增加，給予蓯蓉總苷膠囊2w后行為學(xué)改善明顯。結(jié)論：蓯蓉總苷膠囊可改善AD大鼠行為學(xué)障礙。

早老性癡呆 蓯蓉總苷膠囊 行為學(xué)障礙

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)，又稱早老性癡呆，統(tǒng)計(jì)表明，80歲以上老年人中AD患病率達(dá)到30%，全球AD患者數(shù)量為2600萬左右。老年期癡呆，屬中醫(yī)學(xué)“老年呆證”、“文癡”“癲”、“言語錯(cuò)亂”、“郁證”等范圍。既往研究表明蓯蓉總苷膠囊治療老年性癡呆取得較好療效，本研究探討了蓯蓉總苷膠囊膠囊對(duì)AD老齡鼠行為學(xué)障礙的影響，了解其對(duì)AD作用及機(jī)理。蓯蓉總苷膠囊可以有效改善癡呆患者的認(rèn)知功能、行為生活能力[1]，但其機(jī)制目前未明。因此，本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，以AD大鼠模型為研究對(duì)象，通過蓯蓉總苷膠囊對(duì)AD模型鼠水迷宮試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，以期在動(dòng)物模型中探索蓯蓉總苷膠囊治療AD的效果，為該藥的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的分子生物學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

大于20個(gè)月齡雄性SD大鼠60只，清潔級(jí)，體重360±20g運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，置于安靜清潔環(huán)境下分籠喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度控制在24±2℃，定時(shí)給予清潔飲水和大鼠專用飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，無不良反應(yīng)，飲食、飲水正常，即開始進(jìn)行Y型水迷宮篩選，剔除不合格(即反應(yīng)過于遲鈍或特別敏感)的大鼠，再將合格大鼠分別稱重后隨機(jī)分為4組：正常組、假手術(shù)組、模型組、蓯蓉總苷組，每組10只。

1.2 分組及受試對(duì)象給藥方式

正常組：作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，自由攝食及飲水，不作任何處理，待其余3組造模結(jié)束后與之同時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。

模型組：不進(jìn)行任何治療，自由攝食及飲水8周，即行造模(具體方法見后AD大鼠模型制備)，造模完畢后，大鼠正常喂養(yǎng)兩周(以便藥物的吸收)即行行為學(xué)檢測(cè)。

假手術(shù)組：顱內(nèi)注射與Aβ1-42等量生理鹽水，余同模型組。

蓯蓉總苷組：造模完畢后,大鼠正常喂養(yǎng)兩周進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

1.3 模型制備

Aβ1-42孵育：試劑首先被溶解到0.4到4mol的二甲基亞砜溶液里，然后此溶液稀釋在10mmol的磷酸二氫鈉緩沖液中，37℃下孵育一周后使用。

造模方法：大鼠稱重，用10%的水合氯醛(4ml/kg)腹腔注射麻醉后，固定于顱腦立體定位儀上保持前后囟在同一水平，剪開頭皮，暴露前囟，按大鼠腦立體定位圖譜進(jìn)行定位，在前囟后方3.3mm，中線左右各旁開1.5mm，用牙科鉆各鉆一小孔穿顱(直徑約1mm),垂直插入微量注射器，使針尖自顱骨表面緩慢進(jìn)針3.3mm至海馬。用微量注射器分別注入5μlAβ1-42，5min內(nèi)注完，注射后留針5min，按1.0mm/min速度緩慢拔針。以免拔針時(shí)藥物溢出。術(shù)后牙托粉封固顱骨孔，縫合皮膚，局部外敷青霉素G粉，并于術(shù)后三日內(nèi)(包括當(dāng)日)每日肌注青霉素G80萬單位預(yù)防感染。

1.4 行為學(xué)檢測(cè)方法

參照有關(guān)文獻(xiàn)[1]操作，測(cè)試大鼠在Morris水迷宮（Morris water maze,MWM）實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的長短和跨越原平臺(tái)區(qū)位置的次數(shù)，以了解大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。而此過程又分為定位航行實(shí)驗(yàn)與空間探索實(shí)驗(yàn)。

1.4.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前1天(即在造模完成第14天)將大鼠放入水池自由游泳2min，讓其熟悉水迷宮環(huán)境。正式水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試共歷時(shí)5天，每天時(shí)間固定。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將平臺(tái)置于一個(gè)固定的象限，每個(gè)時(shí)間段分別從池壁四個(gè)起始點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水池，大鼠入水點(diǎn)順序?yàn)椋旱谝惶?，E-S-W-N；第二天，S-W-N-E；第三天，W-N-E-S;第四天，N-E-W-S；第五天，E-W-N-S。記錄每次找到平臺(tái)的時(shí)間(即逃避潛伏期，以秒為單位計(jì)時(shí))和距離（單位為cm）。如大鼠在120s內(nèi)找不到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)，潛伏期記為120s，每次間隔5min讓大鼠休息，再行下次實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn)第5天(既造模完成后第19天)的最后一次結(jié)束時(shí)撤除平臺(tái)，將大鼠從任選的非平臺(tái)象限入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記錄大鼠2min內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)中平均找到平臺(tái)時(shí)間的均數(shù)，以及探索實(shí)驗(yàn)中跨越平臺(tái)的次數(shù)。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，根據(jù)方差結(jié)果，再選擇相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析方法。

2 結(jié)果

2.1 造模后大鼠的一般情況

造模后發(fā)現(xiàn)大多數(shù)大鼠眼瞼下垂，活動(dòng)能力低下，自發(fā)運(yùn)動(dòng)減少；也有些大鼠術(shù)后自發(fā)運(yùn)動(dòng)增加。術(shù)后第2天所有存活的大鼠都恢復(fù)正常。在實(shí)驗(yàn)造模和飼養(yǎng)過程中部分大鼠死亡，最終完成實(shí)驗(yàn)各組例數(shù)見表1

2.2 造模對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

在進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)前，用攀繩實(shí)驗(yàn)測(cè)定了全部大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，結(jié)果表明全部大鼠的運(yùn)動(dòng)功能比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 定位航行試驗(yàn)

從表1可見，與正常組相比，模型組的反應(yīng)時(shí)間最長，(P＜0.01)；蓯蓉組動(dòng)物的反應(yīng)時(shí)間顯著短于模型組，有顯著性差異(P＜0.01)。

表1 各組大鼠找到平臺(tái)時(shí)間及平臺(tái)距離比較

表1 各組大鼠找到平臺(tái)時(shí)間及平臺(tái)距離比較

注：1）與正常組比較，P＜0.01；2）與模型組比較P＜0.01

組別n找到平臺(tái)時(shí)間（s）找到平臺(tái)距離（cm）第1天第5天第1天第5天正常組1064.7±0.8041.6±0.861945.3±10.731145.76±10.09假手術(shù)組1071.63±0.911,2)64.8±0.651,2)2102.7±11.551,2)1843.7±10.641,2)模型組9100.3±2.321)97.9±1.311)4645.9±11.061)4169.7±11.341)蓯蓉組1066.74±0.601,2)53.12±0.751,2)2167.58±12.241,2)1789.21±10.711,2)

2.4 空間探索實(shí)驗(yàn)

從表2中可見蓯蓉組跨越平臺(tái)次數(shù)明顯多于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)

表2 大鼠2min內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)

3 討論

阿爾茲海默病（Alzheimer’s Disease）又稱早老性癡呆，是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性的認(rèn)知功能減退，預(yù)后不良，患者一般死于肺栓塞和繼發(fā)感染。阿爾茲海默病常散發(fā)，其臨床發(fā)病率女性是男性的1.5-3倍。神經(jīng)病理學(xué)特征主要包括β樣淀粉樣蛋白（β-amyloid protein,Aβ）沉積形成的細(xì)胞外老年斑（senile plaque,SP）、tau蛋白的過度磷酸化形成的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元的丟失伴隨著膠質(zhì)細(xì)胞的增生等，其發(fā)病機(jī)制與氧自由基損傷、炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)構(gòu)象異常等有關(guān)。提示早期對(duì)高血壓、高血脂等血管危險(xiǎn)因素進(jìn)行干預(yù)有助于預(yù)防AD。

阿爾茲海默病屬中醫(yī)學(xué)“老年呆證”、“癲”等范圍。本病病位在腦與心、腎、肝、脾關(guān)系密切，其共同病因?yàn)樘叼鲎杞j(luò)、肝腎不足、脾腎不足或氣虛血弱，兼風(fēng)火、痰熱為特點(diǎn)，證候多實(shí)或虛實(shí)并見，其治療不宜一味進(jìn)補(bǔ)，補(bǔ)則壅滯更甚[2]。蓯蓉總苷膠囊具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸通便之功效，現(xiàn)代廣泛運(yùn)用于老年性癡呆、陽痿、習(xí)慣性便秘等?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，肉蓯蓉具有抗衰老、增強(qiáng)記憶、提高免疫力等多種功能。補(bǔ)腎中藥肉蓯蓉的有效成分蓯蓉總苷可有效改善癡呆患者的認(rèn)知功能、生活能力、行為及中醫(yī)癥狀[4]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿爾茲海默病模型大鼠在水迷宮找到平臺(tái)的時(shí)間明顯延長，經(jīng)過的路程明顯增加，蓯蓉總苷膠囊組大鼠在水迷宮找到平臺(tái)的時(shí)間明顯減少，經(jīng)過的路程明顯縮短，給予蓯蓉總苷膠囊2w后行為學(xué)改善明顯，表明蓯蓉總苷膠囊可顯著改善阿爾茲海默病模型大鼠的行為學(xué)障礙和學(xué)習(xí)記憶功能。

綜上所述，我們認(rèn)為，蓯蓉總苷膠囊在早老性癡呆治療中起到改善行為學(xué)障礙的作用。目前中藥治療早老性癡呆研究應(yīng)突破局限于穩(wěn)定血管，維持腦灌注方面，進(jìn)一步可以通過對(duì)細(xì)胞周期蛋白CDK2、p21/cip的角度進(jìn)一步闡明蓯蓉總苷改善AD行為學(xué)障礙的可能機(jī)制，最終有助于中藥在臨床上更積極有效的應(yīng)用于AD的早期干預(yù)。

[1] Wolozin, Benjamin. Cholesterol and the Biology of Alzheimer's Disease[J]. Neuron.2004,(41):7-10.

[2] 林志宏，朱丹妮，嚴(yán)永清，等.當(dāng)歸芍藥散防治老年期癡呆的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)理研究I—組方作用協(xié)同性與選擇性研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2002,8(1):16-18.

[3] 楊建華,胡君萍,熱娜·卡斯木，等.基于酵母雙雜交技術(shù)篩選肉蓯蓉降血脂活性成分[J].藥效與毒理學(xué)研究.2011,22(3):252-255.

[4] 張彥紅,朱磊,梁偉雄.蓯蓉總苷膠囊治療髓海不足型輕中度血管性癡呆40例[J].中醫(yī)研究,2012;6(25):41-44.

廣東省中醫(yī)藥管理局科研課題（項(xiàng)目編號(hào)：20141214）