辣椒（Capsicum annuum L.）果實發(fā)育及品質(zhì)相關(guān)新microRNA的鑒定與分析

LIU Zhoubin1,2,aZHANG Yuping3,aOU Lijun2,aKANG Linyu1,2LIU Yuhua1,2LV Junheng1,2WEI Ge2YANG Bozhi2YANG Sha2CHEN Wenchao2DAI Xiongze2LI Xuefeng2ZHOU Shudong2ZHANG Zhuqing2,*MA Yanqing2,*ZOU Xuexiao1,2,**
（1. 湖南大學(xué)研究生院隆平分院， 長沙 410125； 2. 湖南省蔬菜研究所， 長沙 410125；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院， 長沙 410128； a為共同第一作者）

MicroRNA（miRNA）是一種非編碼的小RNA，在各種生物過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。前人研究表明，模式植物中miRNA與果實發(fā)育相關(guān)。然而，人們對辣椒（Capsicum annuum L.）果實品質(zhì)及發(fā)育相關(guān)的miRNA了解尚不清楚。本研究利用二代測序技術(shù)（Next-generation sequencing technology）比較了不同品種辣椒果實在不同發(fā)育時期的小RNA。利用miRDeep2軟件從4個樣本中共鑒定出了59個已知miRNA和310個新miRNA。預(yù)測了新miRNA的靶基因，共656個，并對其中402個靶基因進行了注釋。GO分析和KEGG途徑表明，某些靶基因與淀粉糖、氨基糖以及核糖代謝相關(guān)。qPCR表明一些miRNA的表達模式與其靶向基因相反，該結(jié)果為今后研究miRNA調(diào)控果實發(fā)育和品質(zhì)形成提供了重要基礎(chǔ)。

辣椒（Capsicum annuum L.）；miRNA；果實發(fā)育；果實品質(zhì)；深度測序；

1 引言

辣椒（Capsicum annuum L.）屬于茄科植物，是種植范圍最廣、最重要的蔬菜作物之一。其果實具有特殊的顏色、辛味和香氣，因此常被作為調(diào)味品使用[1]。辣椒果實能夠積累辣椒素、色素（花青素和胡蘿卜素）和維生素A、B、C[2]。一個世紀(jì)以來，在辣椒的育種中，產(chǎn)量和果實品質(zhì)是重要的質(zhì)量參數(shù)[3]。果肉厚度、總可溶性固形物是許多植物果實品質(zhì)的重要特征[4]。Isabelle 等[5]研究表明，辣椒果實能積累大量的維生素C。相比成熟的果實，處于成熟期的果實維生素C含量更多，還原糖更少[6]。近年來，為研究辣椒果實發(fā)育和辣椒素合成，辣椒屬轉(zhuǎn)錄組得到了分析。Martinez-Lopez等[7]于2014年研究分析了墨西哥辣椒（“Tampique?o 74”）花后（DAA）10、20、40、60天的果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。RNA-seq結(jié)果表明，辣椒素和抗壞血酸生物合成的相關(guān)基因在果實成熟過程中大量表達[7-8]。

microRNA是一類長度約為21個核苷酸（nt）大小的非編碼小RNA，在植物發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物和非生物脅迫響應(yīng)等生物過程中起著重要作用[9]。通常情況下，單鏈小RNA在經(jīng)DICER-LIKE1酶（DCL1）的處理后，形成miRNA復(fù)合物[10]。復(fù)合物展開后，成熟的單鏈miRNA得到釋放。最后，成熟miRNA通過互補轉(zhuǎn)錄的分裂或翻譯阻遏作用進入到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA- induced silencing complex，RISC）中[11]。目前在一些模式植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多miRNA，這些miRNA及其靶基因的發(fā)現(xiàn)使人們有可能進一步了解miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和生物機制。近來辣椒基因組已經(jīng)得到測序[12-13]，這為今后辣椒miRNA的研究提供了基礎(chǔ)。已經(jīng)有研究利用高通量測序技術(shù)，從辣椒中鑒定出29個保守的miRNA家族和35個新的miRNA家族[14]。然而，miRNA在辣椒果實發(fā)育和品質(zhì)形成中的作用尚不明確。

本研究使用Illumina HiSeq 2500平臺研究了辣椒果實在成熟過程中品質(zhì)相關(guān)的miRNA的表達情況。鑒定了與果實成熟相關(guān)的差異表達miRNA，并預(yù)測了相關(guān)的靶基因。隨后對差異表達的miRNA及其靶基因的功能進行了討論。此外，還利用qPCRPCR檢測了一些miRNA及其靶基因的表達模式。這些數(shù)據(jù)為研究辣椒果實發(fā)育及品質(zhì)形成的分子機制提供了新的視角。鑒定和分析已知及未知的miRNA有助于更好地理解miRNA在辣椒果實發(fā)育中的作用。

2 材料和方法

2.1 植物材料

于湖南省蔬菜研究所，以正常條件（16h/8h，26℃/20℃）栽培兩個辣椒品種“Luosijioa”和“06J19-1-1-1-2”。 “Luosijiao”在中國境內(nèi)廣泛種植，其口味和維生素C含量優(yōu)于“06J19-1-1-1-2”。在開花時對“Luosijiao”植株進行標(biāo)記，取綠熟期果實（30DAA, A1）、轉(zhuǎn)色期果實（40DAA, A2）和紅熟期果實（50DAA, A3）。對于“06J19-1-1-1-2”品種，取花后30天綠熟期的果實（30DAA, B1）。每個時期的樣品從多株上取樣并混合，-80℃保存。

2.2 RNA提取與深度測序

根據(jù)說明書，使用Trizol（Invitrogen）提取不同時期辣椒果實的總RNA。每個樣品總RNA取5 μg建小RNA庫。使用NEB Next Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina ( NEB, 美國 )試劑盒，按照說明書構(gòu)建測序用庫。使用T4 RNA連接酶為小RNA加上3’末端和5’末端的接頭，隨后使用Super-Script II Reverse Transcriptase (RNase H-)試劑盒(Invitrogen)將RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。之后使用LongAmp Taq2X Master Mi和相應(yīng)引物對上述反應(yīng)物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物使用8%聚丙烯酰胺凝膠純化（100 V, 80 min）。使用高靈敏的DNA芯片和Aglilent 2100生物分析儀進行質(zhì)量評估后，回收140～160 bp長度的DNA片段，并溶解于8 μL的洗脫緩沖液中，用于測序。4個樣品由Biomarker Technologyies公司（北京）使用Illumina HiSeq 2500測序平臺進行單末端（SE）50 nt測序。

2.3 miRNA的生物信息學(xué)分析

對測序原始數(shù)據(jù)（raw data）進行清洗，去除低質(zhì)量的序列，如：接頭、低于18 nt的序列、多N序列等。在RepeatMasker和Rfam數(shù)據(jù)庫（http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam）中對清潔數(shù)據(jù)（clean data）進行blast操作，去除rRNA、tRNA、snRNA、snoRAN及其他非編碼RNA。剩余的序列置于miRBase 21.0數(shù)據(jù)庫（http://www.mirbase.org）中搜索，以鑒定已知的miRNA。按Friedlaender等[15]的研究方法，將沒有注釋的sRNA序列使用bymiRDeep2軟件通過檢測發(fā)卡結(jié)構(gòu)、Dicer酶切位點和最低自由能的方法預(yù)測新miRNA。新miRNA的標(biāo)準(zhǔn)采用Meyers等人[16]的研究結(jié)果。

2.4 miRNA的差異表達分析

為定義miRNA的表達水平，將miRNA的表達量進行TPM校正，公式如下：標(biāo)準(zhǔn)表達量=比對的序列數(shù)/總序列數(shù)×106。使用R語言的DEGseq包分析2個樣品間不同的表達水平，使用q值對p值進行校正[17]。q ＜ 0.01 和 │log2 (fold change)│＞ 1為差異表達顯著的指標(biāo)。

2.5 靶基因預(yù)測與富集分析

本研究基于辣椒轉(zhuǎn)錄本的序列相似性，使用psRNATarget分析軟件預(yù)測miRNA[12,18]。E值設(shè)為10-5，在KOG（Clusters of Orthologous Groups of proteins）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和GO（Gene Ontology）三個數(shù)據(jù)庫中進行BLAST搜索，對功能和途徑進行分類。使用R語言的TopGO包進行GO富集分析，F(xiàn)DR ＜0.05則認(rèn)為顯著富集[19]。富集的基因使用WEGO進行繪圖（http: //wego.genomics.org.cn/ cgi-bin/ wego/index/ pl）。

2.6 定量RT-PCR（qRT-PCR）和stem-loop qRT-PCR

使用Trizol（Takara，大連）提取樣品總RNA，并使用RNase-free Dnase I (Promega，美國)對總RNA進行處理。對于miRNA，取2 μg經(jīng)DNase I處理的總RNA，使用Prime-Script RT reagent Kit（Takara，中國大連）進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：16 ℃孵育 30 min；60 個循環(huán)：30℃ 30 s，42℃30 s，50℃ 1 s；70℃ 5 min[20]。對于靶基因，取 1 μg經(jīng)DNase I處理的總RNA，使用Prime-Script RT reagent Kit（Takara，大連）和oligo (dT) 18引物進行合成。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：37℃ 15 min，42℃ 1 h，4℃保存。所有引物于表S1中列出。

以FastStart Universal SYBR Green Master Mix（Roche）為染料，在StepOne plus PCR（Applied Biosystems）平臺上進行miRNA和靶基因的實時熒光定量PCR分析。qRT-PCR反應(yīng)條件如下：95℃ 10 min，40個循環(huán)：95℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 15 s。CpAction作為內(nèi)參基因。使用溶解曲線檢測產(chǎn)物的特異性。所有qRT-PCR反應(yīng)均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，并使用2-ΔΔCt法對相對表達水平進行校正[21]。

2.7 支撐數(shù)據(jù)獲取

本研究中使用的所有測序數(shù)據(jù)均可從SRAArchive（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）獲得，登記號為：SRP076911。

3 結(jié)果

3.1 小RNA庫測序概述

為鑒定辣椒果實發(fā)育和品質(zhì)形成相關(guān)的miRNA，利用深度測序構(gòu)建了3個“Luosijiao”小RNA庫，1個“06J19-1-1-1-2”庫。4個庫中共計83 639 907個序列。去除接頭、低質(zhì)量序列、小于18 nt序列和多A序列后，清潔數(shù)據(jù)數(shù)量在16 365 419（A3）至 22 799 181（A1）之間（表 1）。4個樣品分別有 16 075 461、11 662 314、9 236 660和12 481 144個序列特異性地比對到了基因組上。本研究幾乎檢測了每個類型的RNA，包括rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA和重復(fù)序列相關(guān)的sRNA（表1）。并且使用miRDeep 2軟件對已知miRNA和新miRNA進行了預(yù)測（表1），未注釋的序列用于之后的分析。

表1 不同種類小RNA的分布情況

總體來看，除去各庫間相同、不同的sRNA，臨近庫中約30%的sRNA相同，特異性序列僅有少部分（9.73%～11.16%）（圖1）。

圖1 不同樣品間共有或特有的小RNA序列

3.2 已知及新miRNA的特征

4個樣本中，小RNA（sRNA）序列長度在18～ 28 nt之間，大部分在20 ～ 24 nt之間。其中24 nt的sRNA數(shù)量最大，約占4個樣品的20% ～ 35%；緊隨其后的是23 nt的sRNA，從長度來看是典型的miRNA（圖1A）。

Kudla等[22]研究表明堿基組成會影響miRNA的理化性質(zhì)、生物學(xué)特性及其二級結(jié)構(gòu)。擬南芥中，不同的Argonaute蛋白（AGO）在不同的miRNA起始位置富集。AGO1偏愛以U起始的miRNA，而AGO2和AGO4偏愛5’末端以A為結(jié)尾的miRNA[23]。miRNA對核酸的偏好表明，約有50%的miRNA的第1個核苷酸是A（圖2B）。從長度來看，以U為開頭的miRNA長度分別為18 nt、21 nt、22 nt，其余miRNA以A開頭（圖2C）。

3.3 辣椒已知miRNA和新miRNA的鑒定

圖2 辣椒4個樣品中的小RNA

經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，將數(shù)據(jù)與miRBase 20.0庫（http://www.mirbase.org）中的成熟miRNA及前體miRNA對比后，鑒定出59個已知miRNA家族（表2）。此外，鑒定了12個已知miRNA的靶基因，共36個且大多數(shù)在植物中保守（表S3）。除已知miRNA外，將剩余的序列被比對到辣椒基因組，用于鑒定新miRNA。在miRBase 20.0中沒有比對到保守序列且沒有報道過的miRNA即視為新miRNA。通過miRDeep2軟件分析，共從4個樣品中得到310個新miRNA（表S4）。為驗證這些sRNA序列是否為辣椒果實的miRNA，使用byMfold或RNAfold軟件檢測其發(fā)卡結(jié)構(gòu)[24]。結(jié)果表明，這些miRNA的前體均含有特異的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（表S4和圖S1）。4個新miRNA的二級結(jié)構(gòu)如圖3所示。所有新miRNA的表達水均較低。此外，辣椒新miRNA的異構(gòu)體也被鑒定出來，共有10個異構(gòu)體（表S5）。

3.4 靶基因的GO注釋和KEGG途徑分析

Jones-Rhoades[25]、Hu等人[26]的研究結(jié)果表明，miRNA與靶標(biāo)mRNA的結(jié)合幾乎完美地基于序列互補，某種程度上類似RNA干擾。該現(xiàn)象為預(yù)測miRNA的靶基因提供了有效的方法，即比較miRNA和mRNA的序列即可。本研究共鑒定出310個新miRNA，預(yù)測了656個靶基因，其中402個得到了注釋（表S6）。此外，對靶基因進行了GO分析，用于功能分類。GO富集分析表明“代謝過程”、“生物調(diào)節(jié)”、“結(jié)合”、“催化活性”是相生相伴的關(guān)系（圖4、表S7）。KEGG途徑分析表明，許多miRNA與不同的代謝途徑相關(guān)。有趣的是，“Luosijiao”和“06J19-1- 1-1-2”的氨基糖代謝、核糖代謝以及淀粉和蔗糖代謝豐富，表明某些miRNA參與了果實品質(zhì)形成（表S8）。

圖3 新miRNA二級發(fā)卡結(jié)構(gòu)的預(yù)測

3.5 差異表達分析

為深入理解不同辣椒果實樣品中miRNA的表達模式，我們計算了每個樣品的RPKM值。結(jié)果表明miRNA在果實發(fā)育過程中表達水平下調(diào)（A1、A2、A3），不同品種同一發(fā)育階段的表達水平具有可比性（A1、B1）（圖5A）。同時我們使用本實驗室未發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRP075936）比較了miRNA及其靶基因的表達譜，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)已知miRNA及其靶基因的表達模式呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系（圖5B和表S3）。為驗證miRNA及其靶基因的表達模式，分別挑選了4個已知和4個新miRNA及其對應(yīng)的靶基因進行qRT-PCR分析（圖6）。結(jié)果表明，多數(shù)miRNA與其靶基因的表達水平呈負(fù)相關(guān)。3個 miRNA（can-miR156a、canmiR160a和 canmiR396a-5p）在果實DAA50時期（A3）高度表達，而其靶基因下調(diào)表達（圖6A）。多數(shù)新miRNA的表達水平偏低（圖6B）。然而，其表達仍會影響靶基因的表達水平（圖6B），表明這些新miRNA在辣椒果實發(fā)育中仍然發(fā)揮了作用。

圖4 靶基因的GO分類

4 討論

盡管我們在植物果實發(fā)育研究中取得了一定進展，但是對辣椒果實發(fā)育及品質(zhì)形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)理解尚淺。由于非編碼RNA、miRNA在各種發(fā)育和生物過程的轉(zhuǎn)錄后水平上具有不盡相同的重要作用[9,11]，我們使用小RNA高通量進行測序，比較了不同辣椒品種在不同果實發(fā)育階段的miRNA表達譜，鑒定出了59個已知miRNA和310個新miRNA。

miRNA參與了植物體內(nèi)多種細(xì)胞、生理及發(fā)育過程的調(diào)控。在植物中，某些miRNA具有高度保守的序列和功能。miRNA多通過靶向裂解mRNA來發(fā)揮調(diào)控作用，因此miRNA對mRNA的積累起負(fù)調(diào)控作用，兩者的表達模式在同一植物細(xì)胞中呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。miR156調(diào)控一系列Squamosapromoter binding protein-like（SPL） 基 因[27-28]。Zhang[23]、Ferreira E Silva 等人[29]在番茄中對 slymiR156a和At-miR156b進行超表達后，果實分別表現(xiàn)出多心皮和結(jié)構(gòu)異位的性狀。此外，Sun等[30]在擬南芥中進行Md-miR156h基因的異源表達后，角果出現(xiàn)長度縮短和部分不育的情況。本研究中，多數(shù)屬于can-miRNA家族的miRNA在4個樣品中的表達具有差異（圖5B、圖6A）。can-miR156基因在DAA50（A3）中上調(diào)表達，在06J19-1-1-1-2的果實中（A1）下調(diào)表達，表明can-miR156與辣椒果實發(fā)育和品質(zhì)形成有關(guān)。

生長素響應(yīng)因子（auxin response factor，ARF）是一類調(diào)節(jié)生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子。Hwang[14]等2013年研究表明ARF是can-miR160和can-miR160家族的靶基因。本研究中，3個ARF 基因中，ARF10（Capana11g000076）、ARF17（Capana04g001778）和 ARF18（Capana06g000514）同樣被預(yù)測為can-miR160的靶基因（表S3）。并且驗證了can-miR160a和靶基因ARF18的表達譜（圖5B、圖6A）。miR167和miR160調(diào)節(jié)植物細(xì)胞對生長素的響應(yīng)，在果實發(fā)育中具有重要作用[31-32]。F-box蛋白家族是miR394的靶基因，在一些植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要作用[33]。

圖5 miRNA的表達分析

Liu[34]等研究表明，miR394在水稻中與乙烯相關(guān)。Song[35]等研究表明miR394在油菜 （Brassica napus）中超表達后，延遲了油菜開花時間，且種莢和種子的體積均有增大。本研究中，深度測序和qRT-PCR的結(jié)果表顯示can-miR394a在DAA50時期（A3）下調(diào)表達。表明can-miR394a可能與果實發(fā)育相關(guān)。

辣椒果實品質(zhì)和風(fēng)味很大程度上受到糖酸成分和含量的影響，因此糖酸代謝是辣椒果實發(fā)育最為重要的特征之一[36]。KEGG通路分析展示了“Luosijiao”（A1） 和“06 J19–1–1–1–2”（B1）果實的糖酸通路，如“氨基糖與核糖代謝”、“淀粉糖與蔗糖代謝”、“嘌呤代謝”和“N-糖鏈生物合成”（表S8）等。通過對靶基因進行注釋，驗證了3個miRNA（Novel_miR65、ovel_miR75、ovel_miR92）的靶基因半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（Capana10g000025）參與了“蔗糖代謝（表S6）。以上結(jié)果表明，這些miRNA及其靶基因可能在果實發(fā)育與品質(zhì)形成過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，但是需要更多的實驗來證實其功能和調(diào)節(jié)作用。

圖6 qRT-PCR對部分miRNA及其靶基因的鑒定和表達分析

5 結(jié)論

本研究利用高通量測序技術(shù)鑒定了辣椒果實在不同發(fā)育時期的59個已知miRNA及310個新miRNA。通過差異表達分析揭示了這些miRNA在辣椒果實發(fā)育中的功能及作用。利用靶基因預(yù)測和GO富集分析，預(yù)測出310個新miRNA的靶基因，共656個。分析了一些果實發(fā)育和品質(zhì)形成相關(guān)途徑，如N-糖鏈生物合成、淀粉糖和蔗糖代謝、激素信號。通過生物信息學(xué)和實驗相結(jié)合的手段，該研究為進一步研究辣椒及其他植物中microRNA在果實發(fā)育中的作用做了重要鋪墊。

補充數(shù)據(jù)及相關(guān)文章可在線獲?。篽ttp://dx.doi.org/10.1016/j.gene.2017.01.020。

致謝

本研究由中國農(nóng)業(yè)研究系統(tǒng)專項基金（CARS-25-A-8）資助。

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文獻來源： Gene, 2017, 608: 66-72

縮略詞DAA，花后天數(shù)；RISC，RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體；KOG，同源蛋白質(zhì)簇；KEGG，京都基因及基因組百科全書；GO，基因本體論；AGO，Agronaute蛋白。

*通信作者：ZHANG Zhuqing , MA Yanqing , ZOU Xuexiao

**通信地址：ZOU Xuexiao，湖南大學(xué)研究生隆平分院，湖南省蔬菜研究所，長沙410125

電子郵件：cszzq@126.com (ZHANG Zhuqing)；yanqingmahn@163.com (MA Yanqing)；zouxuexiao428@163.com (ZOU Xuexiao)