楊成聰，梁容，秦冉，曾冬冬，金曉麗，石春海

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水稻花器官數(shù)目異常突變體的表型分析與基因定位

楊成聰，梁容，秦冉，曾冬冬，金曉麗，石春海

（浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院農(nóng)學系，杭州 310058）

研究水稻花器官數(shù)目異常突變體（）的分子機理，鑒定出控制水稻花器官數(shù)目變化的基因。利用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變秈稻品種浙農(nóng)34獲得一個花器官數(shù)目異常突變體作為試驗材料，命名為。開花期隨機取突變體和野生型浙農(nóng)34的稻穗各5個，利用組織學和掃描電子顯微鏡等技術研究的花器官表型、細胞學特征和花粉育性。成熟期隨機取突變體和野生型浙農(nóng)34植株各10株，測定株高、分蘗數(shù)、穗長、每穗穎花數(shù)、每穗實粒數(shù)和千粒重等農(nóng)藝性狀。隨機取突變體和野生型飽滿種子各100粒，測定發(fā)芽勢和發(fā)芽率。以突變體為母本，分別與野生型浙農(nóng)34和粳稻品種浙農(nóng)大104雜交構(gòu)建2個F2群體進行遺傳分析和基因定位，篩選候選基因進行DNA測序比對，構(gòu)建AFON1蛋白質(zhì)的空間模型并對其結(jié)構(gòu)進行分析，同時對候選基因以及與花器官數(shù)目相關的基因進行實時熒光定量PCR分析。與野生型相比，突變體中59.64%小穗的花器官數(shù)目發(fā)生異常，其中多數(shù)小穗僅在內(nèi)稃一側(cè)產(chǎn)生一個穎殼狀的器官，部分小穗表現(xiàn)2—4輪花器官數(shù)目同時增加；株高和千粒重顯著增加，而結(jié)實率顯著降低。遺傳分析表明，突變體與野生型浙農(nóng)34雜交的F1植株小穗花器官數(shù)目表現(xiàn)正常，F(xiàn)2群體中小穗花器官數(shù)目正常植株與花器官數(shù)目異常植株的分離比符合3﹕1，表明突變體性狀受一對隱性核基因控制，基因位于水稻第1染色體長臂端InDel標記1M5和1M18之間，物理距離為73 kb，該區(qū)間內(nèi)共有6個注釋基因。突變體和野生型的測序比對發(fā)現(xiàn)，突變體中的基因外顯子中第565個堿基T突變成A，導致第189個氨基酸由色氨酸突變?yōu)榫彼帷５鞍踪|(zhì)序列和空間結(jié)構(gòu)分析表明，AFON1蛋白質(zhì)序列中含有一個Lipase_3結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變導致蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，在突變體幼穗中的表達量要顯著高于野生型，而在根、莖和葉中則無顯著差異；穗發(fā)育早期和/等調(diào)控花器官數(shù)目的基因在突變體花器官中的表達量顯著增加。為突變基因，該基因通過影響花器官數(shù)目相關基因的表達而調(diào)控各輪花器官數(shù)目。

水稻；花器官數(shù)目異常突變體（）；基因定位；表達分析

0 引言

【研究意義】水稻是典型的單子葉植物，也是重要的糧食作物之一，其花器官的發(fā)育直接影響稻米的品質(zhì)和產(chǎn)量，但水稻花發(fā)育的分子機制有待于進一步深入研究。利用一些新發(fā)現(xiàn)的水稻花器官異常突變體，克隆更多花發(fā)育基因不僅有助于進一步闡明水稻花器官發(fā)育的分子機制，同時也可為分子育種提供重要的理論依據(jù)。【前人研究進展】水稻小穗具有確定性，即含有2個護穎和一朵可育的小花，1個外稃1個內(nèi)稃、2個漿片、6個雄蕊和1個雌蕊構(gòu)成水稻小花的四輪花器官[1]。雙子葉植物的花器官由外至內(nèi)包括花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊。通過對雙子葉模式植物金魚草和擬南芥的研究，前人提出了花發(fā)育的“ABCDE”模型[2-6]，該模型認為A、B、C、D和E這5類基因協(xié)同調(diào)控雙子葉植物花器官的形成和發(fā)育，其中任何一類基因發(fā)生突變都將引起對應輪次花器官的同源異型轉(zhuǎn)化[7]，進而導致花器官的形態(tài)和數(shù)目發(fā)生變化，該模型的部分內(nèi)容也適用于單子葉植物花器官的發(fā)育。除了典型的5大類功能基因外，還有一些基因也參與了水稻穎花發(fā)育的過程，如、、、、/、、、()、和等[8-20]。可以通過高溫介導線粒體脂肪酶的通路保護下游花器官特性基因、和的表達，抵御環(huán)境溫度波動而促進花器官穩(wěn)態(tài)[21]。Sun等[20]對突變體的研究表明，JMJ706蛋白通過組蛋白賴氨酸甲基化的途徑進行表觀遺傳修飾，其功能缺失將影響水稻花器官的形態(tài)和數(shù)目；Clark等[22]和Bleckrnann等[23]通過擬南芥、和突變體研究明確了（）/（）反饋調(diào)節(jié)環(huán)途 徑，認為在頂端分生組織中表達后可以誘導分生組織細胞增殖、產(chǎn)生反饋信號，通過/受體復合體激活信號途徑在轉(zhuǎn)錄水平上降低的表達，而的表達又可反饋調(diào)節(jié)的表達，從而形成一個調(diào)控花分生組織大小的反饋調(diào)節(jié)環(huán)以維持擬南芥整個花發(fā)育過程中分生組織的大小。任何一個發(fā)生突變，頂端分生組織以及花序和花分生組織都將變大，而小花和花器官數(shù)目增加正是由于花分生組織增大所致[22,24]；該反饋調(diào)節(jié)環(huán)也同樣適用于水稻花器官數(shù)目的調(diào)控，關鍵基因、和對應于水稻的、和[25]?，F(xiàn)已明確是編碼一個富含亮氨酸重復序列的受體激酶[12]，而則編碼一個含有CLE功能域的小分子分泌蛋白[15]。水稻內(nèi)輪花器官數(shù)目增加往往會導致內(nèi)外稃不能正常閉合，進而嚴重影響花粉的育性和種子發(fā)芽。【本研究切入點】盡管目前與水稻花器官數(shù)目相關的基因研究較多，但導致水稻花器官數(shù)目異常的分子機制與調(diào)控途徑尚不清楚。利用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變秈稻品種浙農(nóng)34，獲得一個花器官數(shù)目異常突變體（），該突變體中59.64%小穗的花器官數(shù)目表現(xiàn)出不同程度的增加，其中大部分小穗僅在內(nèi)稃一側(cè)產(chǎn)生一個穎殼狀器官，且具有外稃的維管束特征；極少數(shù)小穗表現(xiàn)2—4輪花器官數(shù)目同時增加?！緮M解決的關鍵問題】以花器官數(shù)目異常突變體為材料進行詳細的形態(tài)觀察和組織學分析，以明確的表型特征；利用SSR等分子標記對進行精細定位、克隆和序列分析，采用實時熒光定量PCR分析在根、莖、葉和穗各組織中的表達特性以及不同時期花器官數(shù)目相關基因在突變體花器官中的表達差異，以進一步明確花器官數(shù)目異常突變體的特征和控制花器官數(shù)目異常表現(xiàn)的分子機理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用EMS誘變秈稻品種浙農(nóng)34，獲得一個能穩(wěn)定遺傳的花器官數(shù)目異常突變體。2014年夏在浙江大學紫金港校區(qū)試驗田用突變體分別與粳稻品種浙農(nóng)大104和野生型秈稻品種浙農(nóng)34雜交獲得F1，自交后獲得F2種子；2015年夏在相同的環(huán)境條件下種植親本、F2定位群體和遺傳分析群體。

在鑒定溫度影響花器官數(shù)目變異的試驗中，取秈稻品種浙農(nóng)34和突變體各20粒種植于實驗室組培室內(nèi)進行溫度處理，2個處理條件為35℃光照12 h/20℃暗處理12 h、25℃光照12 h/20℃暗處理12 h，3次重復。

1.2 表型分析與花粉育性鑒定

開花期隨機取大田和組培室內(nèi)突變體和野生型的稻穗各5個，在體式顯微鏡下解剖觀察突變體和野生型的花器官形態(tài)和數(shù)目并統(tǒng)計數(shù)目。參照Zeng等[26]的方法在顯微鏡下觀察花粉育性。成熟期隨機取突變體和野生型植株各10株，測定其株高（plant height，cm）、分蘗數(shù)（number of tillering，個）、穗長（panicle length，cm）、每穗穎花數(shù)（number of floret per panicle，粒）、每穗實粒數(shù)（number of filled grain per panicle，粒）、千粒重（1 000-grain weight，g）。

1.3 發(fā)芽勢、發(fā)芽率測定與石蠟切片觀察

隨機取突變體和野生型飽滿種子各100粒，參照錢春榮等[27]方法測定發(fā)芽勢和發(fā)芽率，3次重復。

孕穗期分別取突變體和野生型幼穗，于4℃FAA固定液中固定24 h，經(jīng)脫水（乙醇梯度）、透明（二甲苯）、包埋（石蠟）、脫蠟、切片（厚度為10 μm）、染色（1%番紅和1%固綠）后，在Nikon ECLIPSETI-SR熒光顯微鏡下觀察。

1.4 掃描電鏡觀察

取孕穗期花序在4℃2.5%戊二醛溶液中固定24 h；0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗3次，每次15 min；1%鋨酸溶液固定1—2 h后取出，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗3次，每次15 min。經(jīng)乙醇濃度梯度脫水、醋酸異戊酯處理30 min后干燥、鍍膜。處理后的樣品在Hitachi TM-1000型掃描電鏡下觀察。

1.5 基因定位與測序比對

應用分離群體分組分析法（bulked segregation analysis，BSA）尋找與目的基因連鎖的分子標記。分別選取F2定位群體中突變體和野生型植株各10株，剪取等量葉片混合構(gòu)成突變池和野生型池，參照簡易CTAB法[28]提取親本、基因池和F2定位群體DNA，利用位于水稻12條染色體上并在粳稻浙農(nóng)大104和秈稻浙農(nóng)34間具有多態(tài)性的280對SSR和InDel分子標記，篩選連鎖標記，初步確定目的基因的位置。

SSR引物序列參照（http://www.gramene.org/ microsat/），由上海生工生物技術公司合成；InDel分子標記由杭州擎科梓熙生物技術公司合成。PCR反應體系為20μL，包括10×PCR buffer 2.0 μL、50 ng·μL-1DNA模板1 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 0.3 μL、ddH2O 15.7 μL、10 μmol·L-1正反向引物各0.3 μL和5 U·μL-1DNA聚合酶0.4 μL。PCR程序為94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、快速銀染后于觀燈片上觀察并統(tǒng)計結(jié)果[29]。

利用Gramene網(wǎng)站（http://www.gramene.org/）獲取粳稻品種日本晴和秈稻品種9311的目的區(qū)間基因組序列，于NCBI網(wǎng)站（https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）進行序列比對，結(jié)合使用DNASTAR和Primer 5.0設計開發(fā)新的分子標記進行精細定位。根據(jù)水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫（http://rice.plantbiology. msu.edu/index.shtml）注釋候選基因的功能，并對其測序以獲得突變基因、突變位點和突變方式。利用生物信息學分析網(wǎng)站（http://smart.embl-heidelberg.de/）和（https://swissmodel.expasy.org/）分析蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)。

1.6 基因的表達分析

采用Trizol法分別提取突變體和野生型孕穗期時根、莖、葉和穗的總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒DRR047A（Takara）的操作說明經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈。隨后以逆轉(zhuǎn)錄合成的第一條cDNA鏈為模板，參照SYBRⅡ（Tli RNaseH Plus）（RR820A，Takara）的操作方法用熒光定量引物進行實時熒光定量PCR，3次重復。分析不同時期突變體在不同組織中的表達情況，以及參與調(diào)控水稻花器官數(shù)目的和/在穗中的表達量，用（上游：5′-GTGGTCGCCCCTCCTGAAAG-3′，下游：5′-GGCTTAGCATTCTTGGGTCCG-3′）作為內(nèi)參基因進行歸一化處理。熒光定量PCR反應在Roche LightCycler96實時熒光定量PCR儀上進行，用2-△△Ct計算方法分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 突變體afon1表型分析與農(nóng)藝性狀測定

突變體部分主要農(nóng)藝性狀發(fā)生了顯著的變化，如株高和千粒重分別比野生型植株增加6.70%和7.27%，每穗實粒數(shù)和結(jié)實率則分別降低了19.01%和18.84%，其差異均達到顯著或極顯著水平（圖1-A，表1）。內(nèi)外稃開裂會嚴重影響花粉的育性。本研究發(fā)現(xiàn)，突變體中內(nèi)外稃開裂小花的花粉育性顯著低于野生型植株，僅有18.75%的花粉表現(xiàn)為可育，內(nèi)外稃閉合狀的小花花粉育性則與野生型無顯著差異（圖1-B—圖1-D）。推測內(nèi)外稃開裂小花的花粉育性顯著降低是導致突變體結(jié)實率降低的主要原因。

發(fā)芽試驗結(jié)果表明，突變體種子的發(fā)芽勢與發(fā)芽率均顯著降低，分別比野生型下降25.87%和13.43%（圖1-E）。

表1 突變體afon1和野生型主要農(nóng)藝性狀

*：在0.05水平上差異顯著；**：在0.01水平上差異極顯著。圖6同

*: significant difference at＜0.05 level by-test; **: significant difference at＜0.01 level by-test. The same as Fig. 6

A：抽穗期野生型與突變體afon1植株形態(tài)，Bar=10 cm；B：野生型花粉育性；C：突變體afon1內(nèi)外稃閉合狀花粉育性；D：突變體afon1內(nèi)外稃開裂狀花粉育性；E：野生型與突變體afon1發(fā)芽試驗，Bar=2 cm

2.2 突變體afon1形態(tài)與組織學觀察

營養(yǎng)生長階段的突變體與野生型植株無明顯差異。抽穗后與野生型（圖2-A）相比，突變體中59.64%小穗的花器官數(shù)目表現(xiàn)不同程度的增加，其中多數(shù)小穗僅在內(nèi)稃一側(cè)產(chǎn)生一個穎殼狀的器官，其他輪次花器官數(shù)目表現(xiàn)正常（圖2-H和圖2-K—圖2-L）。觀察野生型小穗橫切面發(fā)現(xiàn)，小穗的外稃具有5個維管束（圖2-K），而在突變體小穗的橫切面中，內(nèi)稃一側(cè)產(chǎn)生的穎殼狀器官也有5個維管束，表明新增的穎殼狀器官與外稃具有較高的相似性（圖2-L）。小部分小穗表現(xiàn)2—4輪花器官數(shù)目同時增加，主要表現(xiàn)為2個外稃、2個退化的片狀內(nèi)稃、3個漿片、7—11個雄蕊、2—3個子房、3個柱頭（圖2-B—圖2-G、圖2-I和圖2-M—圖2-P）。退化的片狀內(nèi)稃出現(xiàn)在兩外稃嵌合的位置導致稃片不能正常閉合，四輪花器官同時增加的小穗其花器官數(shù)目并非成倍增加（圖2-I、圖2-M—圖2-P），而子房數(shù)目增加的小花往往與成熟時形成雙米粒有關（圖2-J）。突變體在35℃和25℃不同溫度培養(yǎng)條件下，分別有61.23%和60.89%的小穗花器官數(shù)目出現(xiàn)異常，兩者差異不顯著，說明溫度的變化對突變體花器官數(shù)目異常的表型影響不大。

A：野生型的小花；B、C：突變體afon1雄蕊數(shù)目異常；D：突變體afon1的漿片數(shù)目異常；E、F：突變體afon1的子房數(shù)目異常；G：突變體afon1的柱頭數(shù)目異常；H、I：野生型和突變體afon1小穗；J：野生型和突變體afon1成熟小穗；K：野生型小穗橫切面；L、M、N、O和P：突變體afon1小穗橫切面。白色五角星代表雄蕊；黑色五角星代表子房；白色三角形代表漿片；黑色三角形代表柱頭；白色四角星代表外稃維管束。A、B、C、K、L、M、N、O和P中，Bar=200 μm；D、E和F中，Bar=100 μm；G中，Bar=50 μm；H、I和J中，Bar=1 mm；sl：不育外稃；gl：穎殼狀器官；le：外稃；pa：內(nèi)稃；st：雄蕊；lo：漿片；ov：子房；sti：柱頭

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)花器官在花原基發(fā)育的早期就發(fā)生了變化，形成內(nèi)外稃原基時在內(nèi)稃一側(cè)能觀察到穎殼狀原基（圖3-A），內(nèi)輪花器官原基分化完全后，可清晰觀察到內(nèi)稃一側(cè)有一個穎殼狀器官原基（圖3-B）、退化成片狀的內(nèi)稃原基出現(xiàn)在兩個外稃嵌合的位置（圖3-C）。說明從突變體的花分生組織形成稃片原基開始，各輪花器官原基的數(shù)目依次開始發(fā)生變化。

A、B和C：突變體afon1小花掃描電鏡圖。A中，Bar=200 μm；B和C中，Bar=100 μm；gl：穎殼狀器官；sl：退化穎殼；le：外稃；pa：內(nèi)稃；st：雄蕊；fm：花分生組織

2.3 突變體afon1遺傳分析、afon1定位與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

突變體與秈稻品種浙農(nóng)34雜交獲得的F1植株表型和花器官數(shù)目均與野生型相同。在F2群體中，花器官數(shù)目正常的植株有466株，花器官數(shù)目異常的植株有156株，分離比符合3﹕1（2=1.03＜20.05=3.84），說明該突變體性狀受一對隱性核基因控制。選用280對分布于水稻12條染色體上、在秈稻浙農(nóng)34與粳稻浙農(nóng)大104之間具有多態(tài)性的SSR和InDel分子標記，用BSA分池法篩選多態(tài)性分子標記。從突變體和浙農(nóng)大104雜交構(gòu)建的F2定位群體中隨機取46株進行單株驗證，將目的基因初步鎖定在第1染色體長臂端InDel分子標記1M2（1/46）和1M11（1/46）之間（圖4-A）。隨后用DNASTAR和Primer 5.0軟件在該區(qū)間內(nèi)開發(fā)更多具有多態(tài)性的分子標記（表2），用上述F2定位群體中的763個植株將基因定位在InDel分子標記1M5（2/763）和1M18（1/763）之間73 kb的范圍內(nèi)（圖4-B），該區(qū)間內(nèi)共有6個注釋基因（圖4-C）。對6個基因進行測序比對后發(fā)現(xiàn)，與野生型相比在突變體中僅發(fā)生了單堿基替換。進一步對該基因的cDNA編碼框進行擴增和測序比對，發(fā)現(xiàn)突變體中的外顯子第565個堿基T突變成A，導致第189個氨基酸由色氨酸突變?yōu)榫彼幔▓D4-D）。對這6個注釋基因的功能進行預測分析，發(fā)現(xiàn)是一個脂肪酶基因，總長1 308 bp，僅含一個外顯子；其編碼產(chǎn)物脂肪酶主要存在于線粒體上，該脂肪酶在茉莉酸合成的初始過程中發(fā)揮其催化作用，而植物激素茉莉酸信號途徑在小穗分化、花器官形態(tài)和數(shù)目的確定性過程中扮演著重要的角色[30]，說明該基因是突變體的候選基因。因此，推測的突變導致了突變表型的出現(xiàn)。

表2 部分基因定位多態(tài)性引物

A、B：afon1在水稻第1染色體上的連鎖圖譜；C：該區(qū)間內(nèi)的候選基因；D：突變體afon1和野生型的cDNA測序比對結(jié)果

蛋白質(zhì)序列比對和結(jié)構(gòu)分析還發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)序列中含有一個Lipase_3結(jié)構(gòu)域（圖5-A），由于結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變以致蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化（圖5-B和圖5-C）。

2.4 水稻花器官發(fā)育相關基因的表達分析

為明確在水稻花器官發(fā)育過程中的時空表達模式，利用實時熒光定量PCR檢測在根、莖、葉及不同穗發(fā)育時期的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在根、莖、葉和穗中都有表達。其中，在穗長度＜4.0 cm（早中期）時的表達量顯著高于其他組織（圖6-A和圖6-B），當穗長＞4.1 cm（后期）后在各組織中的表達量則無顯著差異（圖6-C），說明主要在花器官發(fā)育早期發(fā)揮調(diào)控作用。由于Suzaki等[12]在研究突變體時發(fā)現(xiàn)在水稻整個花分生組織中表達，而/僅在花分生組織頂端的幾層細胞中表達[13,15]，2個基因均是作為頂端分生組織反饋調(diào)節(jié)環(huán)途徑中的主要基因共同參與調(diào)控花器官的數(shù)目。猜測在穗發(fā)育早期，發(fā)生單堿基突變后使和/在花分生組織中的表達量增加，引起花分生組織變大，從而導致突變體的花器官數(shù)目增加。因此，利用實時熒光定量PCR分析了不同時期、/和的表達差異（表3）。與野生型植株相比，、/和在穗長度＜1.0 cm（早期）時的表達量均顯著增加，分別提高了2.6、1.7和3.9倍（圖6-D）；當穗長為1.1—4.0 cm（中期）時，和在花器官中的表達量仍顯著增加，而/無顯著變化（圖6-E）；當穗長＞4.1 cm（后期）時，、/和表達量均無顯著變化（圖6-F）。

A：AFON1蛋白序列；B、C：AFON1蛋白結(jié)構(gòu)A: Sequence of AFON1; B, C: Structure of AFON1

A、B和C：afon1在不同時期不同組織中的相對表達量；D、E和F：不同時期花器官數(shù)目相關基因在穗中的相對表達量

表3 qRT-PCR引物

3 討論

水稻花器官的發(fā)育是一個復雜的生物學過程，參與該過程的基因很多，其中任何一個基因發(fā)生功能性突變都有可能導致花器官表現(xiàn)異常[30]。水稻正常小穗的小花數(shù)目、各輪花器官數(shù)目具有恒定性[11,30]，但本研究報道的突變體有59.64%小花花器官數(shù)目失去恒定性而表現(xiàn)不同程度的增加，以內(nèi)稃一側(cè)多一個穎殼狀器官為主，極少數(shù)小穗因多子房多小花而出現(xiàn)雙米粒表型進而導致該粒粒重顯著增加。通過基因定位將定位在水稻第1染色體長臂端InDel標記1M5和1M18之間，物理距離為73 kb。

目前，國內(nèi)外已報道了很多水稻花器官數(shù)目異常突變體，如(-)[12-17]、()[18][11]、[10]和[31]。分別位于水稻第6、11、11、11、6、未知、6、5、1和7染色體上。未被定位的其突變體表型以雙子房為主，雄蕊數(shù)目變化較大，最少僅有1個而最多可達14個[17]。-和-屬于等位突變體，其中突變體-僅雌蕊數(shù)目發(fā)生變化，而突變體-的70%小花有雌蕊4—5個、雄蕊7—12個，其余小花均有額外的漿片和稃片狀的器官[12]。和也是一對等位基因，其中，的3個等位突變體、和的雄蕊數(shù)目分別增加2.9、2.2和2.0倍[13]；而表現(xiàn)為一次枝梗數(shù)目和花器官數(shù)目均增加，具有2—10個心皮、6—10個雄蕊，部分小穗的漿片轉(zhuǎn)化成內(nèi)外稃狀器官[15]。以心皮數(shù)目增多為主[14]。內(nèi)外稃正常，僅雄蕊和雌蕊數(shù)目發(fā)生變化[16]。()以漿片同源轉(zhuǎn)化成內(nèi)外稃、雄蕊和柱頭外露為主[18]。主要表現(xiàn)出在同一個小穗軸上出現(xiàn)多個小花[11]。以多個苞片為主[31]。的2個突變體小穗所有輪次花器官的形態(tài)和數(shù)目均發(fā)生異常變化，主要缺陷為增加一個額外的穎殼，較為嚴重的突變體會失去小花的確定性；其中突變體的護穎、漿片和雄蕊表現(xiàn)異常，部分小花護穎數(shù)目增加了3—4個而其他花器官數(shù)目均表現(xiàn)正常。表型缺陷更為嚴重，在護穎與外稃之間或內(nèi)外稃之間異位形成多個穎殼狀器官，有漿片0—4個（部分增加的漿片出現(xiàn)在稃片外側(cè)、部分漿片還會同源異型轉(zhuǎn)化為稃片狀器官），雄蕊數(shù)目有1—12個；心皮數(shù)目增減不定，其中部分小穗的心皮可以全部轉(zhuǎn)化成穎殼狀器官、極少數(shù)小穗的幾個心皮甚至會融合而生并伴有11個柱頭，個別小穗內(nèi)部出現(xiàn)兩朵小花且各小花第3和4輪花器官數(shù)目均表現(xiàn)正常[10]。與上述突變體相比，表型與具有較高的相似性且定位區(qū)間相同，與其他突變體不僅定位區(qū)間不同，而且表型也具有較大差異，因此筆者猜測可能是的等位突變體。也來源于，但由于測序的候選基因的外顯子第565個堿基T突變成A，導致第189個氨基酸由色氨酸突變?yōu)榫彼?，因此這兩個等位突變體基因的突變位置和植株表型有著明顯差異。的和2個等位突變體，一個（發(fā)生單堿基突變，由C突變?yōu)锳導致第309位半胱氨酸變成終止密碼子；另一個（由T突變?yōu)锳而導致第178位纈氨酸變成天冬氨酸[10]。在植株性狀的表型上，突變體各輪花器官數(shù)目僅表現(xiàn)增加，并未出現(xiàn)花器官缺失或數(shù)目減少的表型，部分小穗出現(xiàn)四輪花器官同時增加；成熟期部分突變體出現(xiàn)雙米粒的特性，而這些表型在是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的第一個調(diào)節(jié)水稻花器官穩(wěn)定性的可塑基因[21]，由于與環(huán)境之間的互作，突變體花器官形態(tài)和數(shù)目表現(xiàn)較高的可塑性，的活性隨環(huán)境溫度的升高而增強，極高溫條件下花器官缺陷更為明顯，而低溫環(huán)境下花器官無任何異常；該基因通過高溫介導線粒體脂肪酶通路保護下游的花器官特性基因、和的表達，抵御環(huán)境溫度波動進而促進花器官穩(wěn)態(tài)。而本試驗的突變體表型幾乎不受環(huán)境溫度的影響。

本研究通過實時熒光定量PCR分析僅在花器官發(fā)育早中期參與水稻花器官發(fā)育的調(diào)控過程，且通過增加花器官數(shù)目相關基因的表達而發(fā)揮其調(diào)控作用。穗發(fā)育早期2個基因的表達量顯著增加而后期無顯著變化，掃描電鏡試驗表明花器官原基形成早期就能清晰地觀察到數(shù)目異常的花器官。由此推測基因可能主要在花器官原基形成早期，通過正調(diào)控的形式增加水稻花器官數(shù)目相關基因在花分生組織中的表達，以改變花分生組織大小，從而影響花器官的數(shù)目；但可能由于在各小穗之間的表達有差異，使花器官呈現(xiàn)不同的表型，甚至部分小穗花器官未出現(xiàn)異常。

蛋白質(zhì)序列比對和結(jié)構(gòu)分析表明，AFON1蛋白序列中含有一個Lipase_3結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域內(nèi)單個氨基酸突變導致AFON1蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。因此推測發(fā)生在Lipase_3結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變使AFON1的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而引起功能變化，進而導致花器官數(shù)目增加。由于蛋白空間結(jié)構(gòu)僅發(fā)生了局部變化，推測由此引起的蛋白質(zhì)功能的微弱改變，僅能使59.64%的小穗花器官數(shù)目發(fā)生變化，以致部分小穗的花器官數(shù)目仍能表現(xiàn)正常。此外筆者猜測還可能是因為具有較弱的可塑性且與環(huán)境的互作效應較小，部分小穗能維持花器官數(shù)目的恒定性。但具體的分子機理與調(diào)控途徑還需更深入的研究才能加以證實。

4 結(jié)論

通過甲基磺酸乙酯誘變獲得一個花器官數(shù)目異常突變體，其59.64%小穗的花器官數(shù)目表現(xiàn)不同程度的增加，株高和千粒重顯著增加，而結(jié)實率則顯著降低。該突變體性狀受一對隱性核基因控制，位于水稻第1染色體長臂端InDel標記1M5和1M18之間，物理距離為73 kb；該區(qū)間內(nèi)的為突變基因，是的等位基因。外顯子中第565個堿基發(fā)生替換使對應氨基酸發(fā)生變化，進而導致AFON1蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而引起功能變異?；蛑饕诨ㄆ鞴僭l(fā)育過程中通過正調(diào)控的形式增加花器官數(shù)目相關基因的表達，從而影響花器官的數(shù)目。

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（責任編輯 李莉，岳梅）

Phenotypical Analysis and Gene Mapping ofabnormal floral organ number MutantL.)

YANG ChengCong, LIANG Rong, QIN Ran, ZENG DongDong, JIN XiaoLi, SHI ChunHai

(Department of Agronomy, College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058)

The abnormal floral organ number mutant of rice was used to study the molecular mechanisms of floral organ development, and to identify the related genes of floral organ in rice.In present study, a rice mutant,() was isolated from ancultivar Zhenong 34 M2population by mutagenesis with ethyl methane sulfonate (EMS). At flowering stage, five panicles fromand Zhenong 34 were randomly selected to observe the morphological phenotype, cytological features and pollen fertility by histology analysis and scanning electron microscopy, respectively. At mature stage, ten plants fromand Zhenong 34 were randomly chosen for measuring the main agronomic traits, such as plant height, number of tillering, panicle length, number of floret per panicle, number of filled grain per panicle and 1 000-grain weight.One hundred plump seeds were selected for calculating the germination potential and germination rate of the mutantand wild type. The F2population from crossing ofwith WT Zhenong 34 and Zhenongda 104 were used for genetic analysis and gene mapping, respectively. Then, the DNA sequencing was conducted, the model of AFON1 protein was built and the space structure for AFON1 protein was analyzed. Moreover, the expression of candidate gene and floral organ number associated genes were detected by real-time PCR.Compared with the wild type, the floral organ number of 59.64% spikelet was abnormal in mutant, which most of them had a glume-like organ on the side of the leman and there were 2-4 rounds of floral organ number increased at the same time in others. Furthermore, the plant height and 1 000-grain weight ofwere visibly higher, while the seed setting rate was significantly reduced. The results of the genetic analysis showed that the phenotype of F1population from the crossing ofwith Zhenong 34 was normal and the segregation ratio of wild-type and mutant phenotype plants from F2population fitted a ratio of 3﹕1, which revealed that the mutant trait ofwas controlled by a single recessive nuclear gene. Thewas further mapped on the arm of chromosome 1 between InDel markers 1M5 and 1M18 with a physical distance of 73 kb, where there were 6 annotated genes. The sequencing results between the mutantand the wild type illustrated that there was a single base-pair substitution of T (565th) to A on the exon ofresulting in the mutation of Trp (189th) to Arg. Protein sequencing and structure analysis revealed that there was a Lipase_3 domain and the mutation in the region changed the space structure of AFON1 obviously. The real-time PCR result showed that the expression ofnumber related genesand/was obviously increased in floral organ at young panicle developmental stage.Thewas speculated as the generegulating the number of floral organ by influencing the expression of corresponding genes which determined the number of floral organ.

rice;(); gene mapping; expression analysis

2017-03-21；接受日期：2017-05-18

浙江省重大科技攻關專項（2012C12901-2）、浙江省科技廳公益技術應用研究計劃（2016C32085）、高等學校學科創(chuàng)新引智計劃（Grant B14027）、教育部創(chuàng)新團隊資助項目（IRT1185）

楊成聰，Tel：18758122705；E-mail：chengcongyang@zju.edu.cn。通信作者石春海，Tel/ Fax：0571-88982691；E-mail：chhshi@zju.edu.cn