申超群，陳 健*

（1.廣東省食品檢驗所（廣東省酒類檢測中心），廣東 廣州 510165；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

樹蝴蝶多糖LKY-I的結構和抗氧化、抗腫瘤活性評價

申超群1，陳 健2,*

（1.廣東省食品檢驗所（廣東省酒類檢測中心），廣東 廣州 510165；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

采用超聲波輔助水提、乙醇沉淀、DEAE-52陰離子交換層析法從樹蝴蝶（Lobaria koorkauae Yoshim）中分離純化得到多糖LKY-I。采用凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）結合葡聚糖凝膠Sephadex G-100分離，測定其分子質(zhì)量分布及純度；利用傅里葉變換紅外光譜、氣相色譜和核磁共振對其結構進行解析；通過體外清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) free radical，ABTS+·）以及對鐵離子還原力（ferric-reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定結果，評價LKY-I的抗氧化能力；采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）測定LKY-I對腫瘤細胞HepG-2、HCC827、MCF-7增殖的抑制作用。結果顯示：LKY-I的總糖含量為88.91%，重均分子質(zhì)量為61 598 D，是組分均一的多糖，由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，其物質(zhì)的量比為1.1∶2.0∶46.5∶28.5∶20.5。傅里葉變換紅外光譜分析結果顯示，LKY-I具有一般多糖類物質(zhì)的特征吸收峰，單糖殘基以吡喃環(huán)的形式存在。高碘酸氧化、Smith降解以及核磁共振分析表明，LKY-I是含有甘露糖的D-吡喃糖環(huán)，包括α和β兩種構型，由24.68%的（1→6）或（1→）連接的糖苷鍵組成。在250～10 000 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的升高，LKY-I對DPPH自由基、ABTS+·的清除率逐漸增大，當質(zhì)量濃度為10 000 μg/mL時，清除率分別達44.12%、24.74%，F(xiàn)RAP值可達0.071 17 mmol/L，與100 μg/mL VC（0.072 31 mmol/L）相當。在125～2 000 μg/mL范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，LKY-I對癌細胞的增殖抑制率逐漸增大。當質(zhì)量濃度為2 000 μg/mL時，LKY-I對腫瘤細胞HepG-2、HCC827、MCF-7增殖的抑制率達到半抑制濃度，說明樹蝴蝶水洗多糖LKY-I具有一定的抗腫瘤活性。

樹蝴蝶；多糖；結構；抗氧化；抗腫瘤

多糖類化合物是一種天然生物大分子，廣泛存在于動物、植物、微生物和真菌中，具有提高機體免疫力、抗氧化、抗病毒、抗衰老等生物活性[1-4]。樹蝴蝶（Lobaria koorkauae Yoshim）為子囊地衣類（Ascolichenes）茶漬目（Lecanorales）牛皮葉科（Stictaceae）肺衣屬（Lobaria）植物光肺衣、裂芽肺衣和網(wǎng)肺衣的干燥葉狀地衣體，味淡、微苦，性平，歸胃、肝、脾、腎經(jīng)，又名石龍皮、石龍衣、老龍七、兜衣、肺衣、癩肚皮、蛇皮苔、石花（陜西）、樹蝴蝶（云南）等[5]。樹蝴蝶以葉狀體入藥，常生長在樹干或林下巖石上，具有健脾利水、祛風止癢等功效[6]。研究表明，地衣多糖具有較強的抗癌活性，能增強機體的免疫能力[7]。靳菊情等[8]研究了樹蝴蝶多糖的初級結構，結果表明多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖及少量鼠李糖、阿拉伯糖、木糖組成的雜多糖，通過α（1→4）、α（1→6）糖苷鍵連接。王曉梅等[9]研究了樹蝴蝶粗多糖的抗氧化活性，結果表明樹蝴蝶粗多糖對O2-·和·OH的最大清除率分別為56%、55%，說明樹蝴蝶多糖具有一定的抗氧化作用。目前有關于樹蝴蝶多糖的研究較少，且多集中在粗多糖的體外抗氧化實驗，關于樹蝴蝶多糖的分離純化、結構鑒定及純化多糖的抗氧化和抗腫瘤活性等還鮮見報道。為開發(fā)利用樹蝴蝶藥用資源，本課題對樹蝴蝶粗多糖進行純化，得到樹蝴蝶純化多糖LKY-I。

本實驗采用傅里葉變換紅外光譜法、氣相色譜分析法、高碘酸氧化法、Smith降解法、13C核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和1H NMR分析研究LKY-I的結構，通過體外抗氧化實驗研究LKY-I對自由基的清除作用及鐵離子還原力。3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法研究了LKY-I對癌細胞的增殖抑制作用。以期為樹蝴蝶多糖生物活性作用機制與分子結構間的關系和樹蝴蝶多糖的應用提供有用信息和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樹蝴蝶購買于廣州市清平藥材市場，由廣東藥科大學藥科學院王定勇教授鑒定。

葡萄糖、甘露糖、半乳糖等單糖標品、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、半乳糖醛酸、葡聚糖標準品 美國Sigma公司；DEAE-52 北京慧德易科技有限公司；Sephadex G-100 瑞典Pharmacia公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、MTT、雙抗、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、5-氟尿嘧啶 美國Gibco公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

可見光分光光度計 上海元析儀器有限公司；超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruck公司；氣相色譜儀 美國Agilent公司；酶標儀 瑞士Tecan公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 樹蝴蝶多糖的制備與純化流程

樹蝴蝶原料→粉碎過60 目篩→超聲輔助熱水浸提→抽濾→減壓濃縮→D354FD樹脂脫色→醇沉→離心（4 000 r/min，10 min）→Sevag法脫蛋白→醇沉→離心→50 ℃烘干→樣品溶解→DEAE-52陰離子交換柱層析→蒸餾水洗脫→收集組分→減壓濃縮→透析→冷凍干燥→得到LKY-I樣品。

1.3.2 LKY-I分子質(zhì)量的測定和純度鑒定

凝膠滲透色譜法（gel permeation ghromatography，GPC）測定LKY-I的分子質(zhì)量[10]，以葡聚糖（5 200、11 600、23 800、48 600、148 000、273 000、410 000、668 000 D）為標準品。色譜條件為：TSK G-5000 PWXL柱（7.8 mm×300 mm，7 μm）、TSK G-3000 PWXL柱（7.8 mm×300 mm，7 μm）串聯(lián)，流動相為0.02 mol/L的KH2PO4緩沖溶液，流速為0.6 mL/min，2414示差檢測器，柱溫35 ℃。

1.3.3 LKY-I理化性質(zhì)的測定

用苯酚-硫酸法測定LKY-I中的總糖含量；采用3,5-二硝基水楊酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）測定LKY-I中的還原糖含量；采用考馬斯亮藍G-250法測定LKY-I中的蛋白質(zhì)含量[11]。

1.3.4 LKY-I單糖組成分析

LKY-I的水解及標準品的衍生化方法參照文獻[12]，最后生成具有揮發(fā)性的糖腈乙酸酯衍生物，氣相色譜（gas chromatograph，GC）法測樣品中單糖組成。GC條件：采用6890N GC儀、DB-1701毛細管柱（30 m×0.25 m ，0.25 μm）及氫火焰離子化檢測器；高純氮作載氣，流速為1mL/min。程序升溫：柱初始溫度為180 ℃，以2 ℃/min升至220 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持2 min；進樣口溫度為250 ℃，汽化室溫度為250 ℃，檢測器溫度為300 ℃，吹掃流速為4.0 mL/min。

1.3.5 LKY-I傅里葉變換紅外光譜分析

LKY-I 2mg與KBr混合研細后，在4 000～500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進行傅里葉變換紅外光譜掃描[13]。

1.3.6 高碘酸氧化和Smith降解

高碘酸氧化和Smith降解方法參考文獻[14]，將降解后溶液水解、衍生化后進行GC分析。

1.3.7 NMR分析

取約60 mg的LKY-I，用1.0 mL重水溶解后置于核磁管中，測定多糖LKY-I的氫譜和碳譜。

1.3.8 多糖LKY-I抗氧化活性的測定

1.3.8.1 對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除作用

[15]的方法，于96 孔板依次加20 μL不同質(zhì)量濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/mL）的LKY-I溶液及180 μL的150 μmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）工作液，空白對照用蒸餾水代替LKY-I樣品，陽性對照用VC代替LKY-I樣品，振蕩，517 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除率按式（1）計算。

式中：A0為空白對照孔的吸光度；A1為樣品孔的吸光度。

1.3.8.2 對2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基的清除作用

先配制7 mmol/L的2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）水溶液及4.9 mmol/L的過硫酸鉀水溶液，將二者等體積混合，得ABTS母液，將ABTS母液用無水乙醇稀釋至0.262 6 mmol/L備用。于96 孔板中依次加入不同質(zhì)量濃度的LKY-I樣品（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/mL）20 μL，再加入180 μL的0.262 6 mmol/L ABTS工作液，37 ℃避光振蕩反應6 min后在734 nm波長處測定吸光度。空白對照組及陽性對照組分別用蒸餾水及VC代替多糖樣品。ABTS+·清除率按式（1）計算。

1.3.8.3 鐵離子還原法

2,4,6-三吡啶基-1,3,5-三嗪（2,4,6-tri(2-pyridy)-1,3,5-triazine，TPTZ）工作液配制：首先分別配制10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液、0.3 mol/L醋酸鈉緩沖液，再將三者按體積比1∶1∶10混合，配制成TPTZ終濃度為0.83 mmol/L的工作液。

FeSO4標準曲線繪制：于96 孔板中加依次加入不同濃度的FeSO4標準溶液（0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）20 μL，再分別加入180 μL TPTZ工作液，37 ℃避光振蕩反應10 min后在595 nm波長處測定吸光度，以FeSO4的物質(zhì)的量為橫坐標，吸光度為縱坐標，建立標準曲線。于96 孔板中加不同質(zhì)量濃度的多糖溶液（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/mL）20 μL，再依次加入180 μL TPTZ工作液，37 ℃避光振蕩反應10 min后在595 nm波長處測定吸光度?？瞻讓φ战M及陽性對照組分別用蒸餾水及VC代替多糖樣品。

1.3.9 對腫瘤細胞HepG-2、MCF-7、HCC827增殖的抑制作用

腫瘤細胞以5×104個/mL的濃度接種到96 孔板，37 ℃、5% CO2、高糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，分別加入質(zhì)量濃度為125、250、500、1 000、2 000 μg/mL的LKY-I溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），培養(yǎng)箱反應4 h。培養(yǎng)結束后，除去上清液，加入150 μL DMSO溶液，避光振蕩反應10 min。采用酶標儀于490 nm波長處檢測吸光度，按公式（2）計算細胞抑制率。

式中：A0為空白對照孔的吸光度；A1為樣品孔的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理分析，數(shù)據(jù)表示為 ±s。

2 結果與分析

2.1 LKY-I的分子質(zhì)量測定和純度鑒定

樹蝴蝶粗多糖經(jīng)DEAE-52分離，蒸餾水洗脫得到純化多糖LKY-I。LKY-I經(jīng)Sephadex G-100檢驗得到對稱的洗脫曲線（圖1），與GPC（圖2）相互驗證，表明LKY-I為純度較好的單一組分的多糖。LKY-I重均分子質(zhì)量（Mw）為61 598 D，黏均分子質(zhì)量為29 125 D，峰位分子質(zhì)量為26 397 D。

圖1 LKY-I的 Sephadex G-100洗脫曲線Fig. 1 Elution curve of LKY-I by Sephadex G-100 column chromatography

圖2 LKY-I的 GPC 圖譜Fig. 2 GPC chromatogram of LKY-I

2.2 LKY-I理化性質(zhì)分析

苯酚-硫酸法葡萄糖標準曲線為y＝8.207 3x-0.016 1，R2＝0.999 3，測得LKY-I的總糖含量為88.91%。DNS法測得葡萄糖標準曲線為y ＝9.154 2x-0.003 4，R2＝0.998 4，測得結果顯示LKY-I中不含還原糖。考馬斯亮藍G-250標準曲線方程為y＝8.837 1+0.009 6，R2＝0.996 3，測得LKY-I中蛋白質(zhì)含量為0.13%。

2.3 LKY-I的單糖組成

通過對多糖水解及衍生化產(chǎn)物的測定，可以得出單糖組成和物質(zhì)的量比。多糖經(jīng)水解、衍生化，GC測定，與標準品的出峰時間相互對照，即可得到樣品中的單糖成分和物質(zhì)的量比。圖3單糖標準品經(jīng)衍生化后生成糖腈乙酸酯衍生物，用GC分析得到的圖譜。圖4為LKY-I樣品經(jīng)水解和衍生化后得到的GC圖，與標準品色譜圖對比可知，LKY-I主要由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，5 種單糖的物質(zhì)的量比為1.1∶2.0∶46.5∶28.5∶20.5，甘露糖、葡萄糖和半乳糖的含量之和在90%以上，其中甘露糖的含量最高。

圖3 單糖標準品糖腈乙酸酯衍生物的GC圖Fig. 3 GC chromatogram of aldononitrile acetate derivatized monosaccharide standards

圖4 LKY-I的GC圖Fig. 4 GC chromatogram of LKY-I

2.4 LKY-I的傅里葉變換紅外光譜分析

圖5 LKY-I的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 5 FT-IR spectrum of LKY-I

傅里葉變換紅外光譜是研究糖類化合物結構不可或缺的技術，可用于檢測醛糖和酮糖的糖環(huán)構象、糖苷鍵的構型等[16]。LKY-I的傅里葉變換紅外光譜分析結果如圖5所示，3 382 cm-1處是多糖中O—H伸縮振動的吸收峰，形寬而鈍，可知不是游離的羥基，而是在分子間發(fā)生了締合作用；2929 cm-1處的吸收峰是C—H伸縮振動的吸收峰；1 400～1 200 cm-1處的吸收峰是C—H的變角振動吸收峰；由以上3 組吸收峰可初步判斷該物質(zhì)為糖類化合物[17]。1 643 cm-1處的吸收峰是多糖中乙酰氨基（—NHCOCH3）的C＝O伸縮振動產(chǎn)生的，說明LKY-I是一種含氨基的糖綴合物[18]；1 200～1 000 cm-1這個區(qū)域比較大的吸收峰是由2 種C—O伸縮振動引起的，其中1 種屬于C—O—H，另一種則屬于糖環(huán)的C—O—C；LKY-I在811 cm-1處的吸收峰表明LKY-I中含有α-D-甘露糖，這與GC結果一致[19]。

2.5 LKY-I的高碘酸氧化和Smith降解

LKY-I經(jīng)高碘酸氧化108 h后達到穩(wěn)定，吸光度為0.374，通過標準曲線Y＝8.165X+0.049 24（R2＝0.992 6）計算，可知消耗高碘酸的量為0.126 mmol；用0.009 45 mol/L NaOH溶液滴定，得到甲酸的生成量為0.038 mmol。LKY-I經(jīng)高碘酸氧化后生成甲酸，說明有（1→）或（1→6）糖苷鍵，高碘酸的消耗量大于甲酸生成量的2 倍，表明可能含有只消耗高碘酸而不產(chǎn)生甲酸的糖苷鍵，如（1→2）、（1→4）、（1→2,4）、（1→4,6）糖苷鍵及不消耗高碘酸也不產(chǎn)生甲酸的（1→3）糖苷鍵。根據(jù)甲酸消耗量推測（1→6）或（1→）連接的糖苷鍵約占多糖連接鍵的24.68%，約占可氧化糖苷鍵的43.18%[20-22]。

圖6 混合標準品的糖腈乙酸酯衍生物GC圖Fig. 6 GC chromatogram of acetyl derivatives of monosaccharide standard mixture

圖7 LKY-I Smith降解產(chǎn)物GC圖Fig. 7 GC chromatogram of Smith degradation products of LKY-I

圖7為LKY-I經(jīng)Smith后的降解產(chǎn)物經(jīng)過衍生化后的GC圖。將其與混合標準品的糖腈乙酸酯衍生物的GC圖（圖6）對比可知，LKY-I經(jīng)Smith降解后的產(chǎn)物中有乙二醇、丙三醇、赤蘚醇、甘露糖及葡萄糖5 種產(chǎn)物。表明糖鏈中含有（1→4）、（1→4,6）、（1→）、（1→6）、（1→2）、（1→2,6）糖苷鍵，降解產(chǎn)物中不含有鼠李糖、半乳糖，表明鼠李糖和半乳糖中不含（1→3）糖苷鍵；甘露糖和葡萄糖的存在，說明甘露糖和葡萄糖都含有（1→3）糖苷鍵。降解產(chǎn)物中乙二醇、丙三醇、赤蘚醇、甘露糖、葡萄糖的物質(zhì)的量比為7.74∶6.50∶1.05∶1.00∶1.11。

2.6 LKY-I的核磁共振結果分析

NMR是分析有機物結構的有力手段，但由于糖類的結構單體（糖殘基）相似，且分子質(zhì)量大，因此對其進行NMR分析有一定的難度。通常，測定糖類樣品的一維1H NMR和13C NMR譜可得到其整體結構信息，如糖的化學組成、糖苷鍵構型及鍵合位置、糖環(huán)構象、糖殘基排列順序等。NMR是進行復雜的多糖結構解析的有效技術，對多糖的結構鑒定起到?jīng)Q定性作用[23-24]。

樹蝴蝶純化多糖LKY-I的1H NMR圖（圖8）顯示，在δ 4.3～5.9區(qū)域內(nèi)有5 個質(zhì)子信號峰，表示LKY-I主要有有5 種單糖種類[25]，這與單糖組成鑒定結果一致；在δ 4.8～5.3范圍內(nèi)有共振峰，表明LKY-I中含有β型吡喃糖；化學位移小于δ 3.5有系列小峰，說明該糖中可能有烷基或蛋白質(zhì)中支鏈氨基酸殘基的存在，說明LKY-I是一種糖蛋白綴合物[26-27]。高場區(qū)δ 1.27處的共振信號為C6脫氧糖的甲基質(zhì)子信號峰[28]。δ 2.14為O-乙酰基（—COOCH3）的甲基質(zhì)子信號[29]。綜上所述，根據(jù)NMR圖的結果，進一步確定了樹蝴蝶純化多糖LKY-I是含有蛋白質(zhì)的糖綴合物。

圖8 LKY-I的1H NMR圖Fig. 8 1H-NMR spectrum of LKY-I

13C NMR是研究糖類化合物結構的重要方法之一。多糖的13C NMR的化學位移范圍較1H NMR廣，達δ 300，具有較好的分辨率。樹蝴蝶純化多糖LKY-I的13C NMR圖顯示（圖9），異頭碳的共振峰集中在δ 97.92～103.00范圍內(nèi)，清楚呈現(xiàn)4 個共振信號（甘露糖不以此判斷），說明該多糖主要有4 種不同的單糖殘基組成，為雜多糖；化學位移在δ 103.00處的共振峰，表明多糖的單糖以吡喃環(huán)存在[28,30]；其中δ 106.14、104.88、103.40處對應的是β構型的吡喃糖殘基的信號峰[31]；在δ 70～75間的化學位移說明該多糖存在吡喃型糖殘基末端被取代的C2、C3、C4化學位移；小于δ 80有信號吸收峰，表明有吡喃糖環(huán)結構存在；δ 69.41、65.48處化學位移存在較強的信號，表明該多糖中C6鍵上的—OH中H被取代，多糖鏈中有（1→6）糖苷鍵[32]。

圖9 LKY-I的13C NMR圖Fig. 9 13C-NMR spectrum of LKY-I

2.7 LKY-I的抗氧化活性

圖10 LKY-I的抗氧化能力Fig. 10 Antioxidant activity of LKY-I

DPPH自由基是穩(wěn)定的自由基化合物，其溶液在517 nm波長處有強吸收峰，它被廣泛地應用于評估抗氧化劑清除自由基的能力，DPPH自由基清除率高說明抗氧化活性好。在此基礎上，LKY-I對DPPH自由基的清除能力進行測定，結果如圖10A所示。在0.25～10.00 mg/mL范圍內(nèi)LKY-I對DPPH自由基清除能力隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，呈線性關系。表明LKY-I可以提供清除DPPH自由基的氫供體。與低質(zhì)量濃度的VC比較，10 mg/mL LKY-I的清除能力與100 μg/mL的VC相當。當樣品質(zhì)量濃度達10 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到最大值44.12%，說明LKY-I樣品均可提供清除DPPH自由基的氫供體，具有一定的抗氧化能力。

如圖10B所示，在0.25～10.00 mg/mL范圍內(nèi)，LKY-I對ABTS+·的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，當樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，ABTS+·清除率達到最大值24.74%，稍高于100 μg/mL的VC（24.56%），說明LKY-I有一定清除ABTS+·的能力。

鐵離子還原力（ferric-reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測定多糖的抗氧化能力的原理是當具有還原性的物質(zhì)存在時，TPTZ溶劑中的Fe3+被還原為Fe2+，顯示藍色，通過測定其吸光度即可判定還原性物質(zhì)抗氧化能力大小。FeSO4標準曲線為Y＝0.966X+0.023（R2＝0.996 0），其中X為FeSO4的濃度/（mmol/L），Y為對應的吸光度。

如圖10C所示，在0.25～10.00 mg/mL范圍內(nèi)，LKY-I的FRAP隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，當樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，LKY-I的FRAP值達到0.071 17 mmol/L與100 μg/mL VC（0.072 31 mmol/L）相當，說明LKY-I具有還原Fe3+的能力。

2.8 LKY-I對癌細胞HepG-2、HCC827、MCF-7增殖的抑制作用

圖11 LKY-I質(zhì)量濃度對癌細胞的影響Fig. 11 Inhibitory effect of LKY-I on tumor cells

MTT法檢測不同質(zhì)量濃度LKY-I對不同癌細胞增殖的影響，結果表明，樹蝴蝶純化多糖LKY-I具有抗腫瘤活性。如圖11所示，在125～2 000 μg/mL范圍內(nèi)LKY-I對癌細胞HepG-2、MCF-7、HCC827的抑制率隨質(zhì)量濃度的增大而增大，呈正相關性，且有一定的劑量依賴性。當多糖質(zhì)量濃度為2 000 μg/mL時，LKY-I對HepG-2細胞增殖的抑制率達47.65%，稍低于500 μg/mL的5-氟尿嘧啶（49.21%）；對HCC827細胞增殖的抑制率達49.41%，稍高于500 μg/mL的5-氟尿嘧啶（47.42%）；對MCF-7的抑制率達53.44%，稍高于500 μg/mL的5-氟尿嘧啶（52.12%）。綜上可知，樹蝴蝶純化多糖LKY-I具有抗腫瘤活性，推測可能是因為LKY-I中含有α（1→6）糖苷鍵，且對不同癌細胞呈現(xiàn)出不同的抑制能力。

3 結 論

本實驗通過超聲波輔助熱水浸提法制備樹蝴蝶粗多糖，通過DEAE-52陰離子交換柱對粗多糖進行分離純化得到組分均一的樹蝴蝶純化多糖——LKY-I。LKY-I的重均分子質(zhì)量為61 598 D，主要由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，5 種單糖的物質(zhì)的量比為1.1∶2.0∶46.5∶28.5∶20.5，并且甘露糖、葡萄糖和半乳糖三者之和的含量在90%以上。結構表征LKY-I是含有甘露糖苷的D-吡喃糖環(huán)，包括α構型和β構型，由24.68%的（1→6）或（1→）連接的糖苷鍵組成。LKY-I具有一定的清除DPPH自由基、ABTS+·和還原Fe3+能力，其活性都隨質(zhì)量濃度的增加而增加，即都呈一定的劑量-效應關系。當LKY-I的質(zhì)量濃度達到10 mg/mL時，清除DPPH自由基的能力與微克級別的VC相當，因為多糖化合物中含有多羥基基團，使DPPH自由基還原為DPPH-H，從而表現(xiàn)出較強的抗氧化能力。在清除ABTS+·的反應中，LKY-I能夠抑制ABTS+·的產(chǎn)生，LKY-I的質(zhì)量濃度達到10 mg/mL時，ABTS+·的清除率達24.74%。隨著LKY-I質(zhì)量濃度的增加，F(xiàn)RAP值也隨之增加。FRAP是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標，提供可阻斷Fe2+向Fe3+的轉變的電子；多糖的分子鏈中活性羥基提供電子或氫原子，與自由基充分作用，表現(xiàn)出抗氧化活性。2 000 μg/mL的LKY-I對癌細胞HepG-2、HCC827、MCF-7增殖的抑制率可達到半抑制濃度，說明LKY-I具有一定的抗腫瘤活性，可能與LKY-I中含有β（1→3）糖苷鍵，以及中等分子質(zhì)量和其良好的水溶性密切相關，可用于臨床抗腫瘤活性藥物進行深入研究。本實驗對組分均一LKY-I的研究，為樹蝴蝶多糖生物活性作用機制與分子結構間的關系和樹蝴蝶多糖的活性研究奠定了基礎。而要完整闡述樹蝴蝶多糖分子結構與功能的關系，則需要進一步研究多糖的結構。多糖的結構，特別是高級結構的研究對揭示多糖的生理功能及構效關系十分重要。

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Structural Analysis and Antioxidant and Antitumor Activity of Polysaccharide LKY-I from Lobaria koorkauae Yoshim

SHEN Chaoqun1, CHEN Jian2,*

(1. Guangdong Provincial Institute of Food Inspection (Guangdong Provincial Liquor Testing Center), Guangzhou 510165, China;2. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China)

A novel water-soluble polysaccharide (LKY-I) was isolated from Lobaria koorkauae Yoshim sequentially through ultrasonic-assisted water extraction, ethanol precipitation, DEAE-52 ion-exchange chromatography and gel permeation chromatography. Its molecular weight distribution and purity were determined by gel permeation chromatographic (GPC) separation with dextran-based Sephadex G-100. The chemical structure of LKY-I was studied by Fourier transform-infrared (FT-IR) spectroscopy, gas chromatography (GC), periodate oxidation, Smith degradation, and nuclear magnetic resonance (NMR). The antioxidant activity was evaluated by measuring reducing power and radical scavenging capacities against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical and 2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) free radicals (ABTS+·) in vitro. The growth inhibitory effect of LKY-I on tumor cell HepG-2, HCC827 and MCF-7 was evaluated using 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) assay. The results revealed that the weight-average molecular mass (Mw) of LKY-I was 61 598 D, and its polysaccharide content was 88.91%. GC results showed that LKY-I contained five monosaccharides, including rhamnose(Rha), xylose (Xyl), mannose (Man), glucose (Glu), and galactose (Gal), with a molar ratio of 1.1:2.0:46.5:28.5:20.5. FT-IR analysis showed that LKY-I had characteristic absorption peaks and its monosaccharide residues existed in the form of pyranring. Periodate oxidation, Smith degradation and NMR revealed that there were 24.68% (1→6) and (1→) glycosides bonds in LKY-I; meanwhile, LKY-I had a D-glucopyranose ring containing mannose residue, including α and β configurations.The scavenging activity of LKY-I against DPPH free radicals and ABTS+· increased with increasing its concentration from 250 to 10 000 μg/mL, with the highest inhibition percentages of 44.12% and 24.74%, respectively at a concentration of 10 000 μg/mL. At 10 000 μg/mL, the FRAP value was 0.071 17 mmol/L, which was equivalent to 100 μg/mL of VC(0.072 31 mmol/L). The inhibitory effect of LKY-I on the proliferation of cancer cells was gradually increased with increasing its concentration from 125 to 2 000 μg/mL. When the concentration was 2 000 μg/mL, the percentage inhibition of tumor cell HepG-2, HCC827 and MCF-7 proliferation was nearly 50%, indicating that LKY-I has potent antitumor activity.

Lobaria koorkauae Yoshim; polysaccharides; structure; antioxidant; antitumor

2016-07-12

廣東省自然科學基金項目（2014A030313242）

申超群（1992—），女，碩士研究生，研究方向為多糖的結構表征及生物活性。E-mail：1481630722@qq.com

*通信作者：陳?。?967—），男，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學。E-mail：fejchen@scut.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201721019

TS241

A

1002-6630（2017）21-0119-07

申超群, 陳健. 樹蝴蝶多糖LKY-I的結構和抗氧化、抗腫瘤活性評價[J]. 食品科學, 2017, 38(21): 119-125.

10.7506/spkx1002-6630-201721019. http://www.spkx.net.cn

SHEN Chaoqun, CHEN Jian. Structural analysis and antioxidant and antitumor activity of polysaccharide LKY-I from Lobaria koorkauae Yoshim[J]. Food Science, 2017, 38(21): 119-125. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721019. http://www.spkx.net.cn