何健宜，姜夢琪，劉旭丹，于曉璐，徐小磊，劉莉

（中國醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，沈陽 110122）

高脂飲食誘導C57BL/6J肥胖小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的建立

何健宜，姜夢琪，劉旭丹，于曉璐，徐小磊，劉莉*

（中國醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，沈陽 110122）

目的通過高脂飲食誘導C57BL/6J小鼠肥胖來建立骨關(guān)節(jié)炎模型并觀察其病理特征，為肥胖相關(guān)骨關(guān)節(jié)炎研究中動物模型的建立提供實驗依據(jù)。方法C57BL/6J雄鼠20只隨機分為對照組和高脂組，分別喂飼基礎(chǔ)飼料和高脂飼料。每周測體重及攝食量，16周后收集血清，ELISA法檢測血清Ⅱ型膠原C端肽水平；取小鼠左下肢膝關(guān)節(jié)，固定、脫鈣、石蠟包埋，切片后行HE及番紅O染色并進行修改后的Mankin評分；TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡。結(jié)果與對照組相比，高脂組小鼠體重、血清Ⅱ型膠原C端肽水平顯著升高,而攝食量方面則無明顯差異。HE及番紅O染色結(jié)果顯示，高脂組小鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨細胞減少，排列混亂，基質(zhì)染色不均勻，可出現(xiàn)潮線部分缺失，顏色變淺等；且高脂組的修改后的Mankin評分也顯著高于對照組。TUNEL檢測結(jié)果顯示，高脂組小鼠關(guān)節(jié)軟骨凋亡細胞數(shù)增多，但與對照組相比差異不顯著。結(jié)論利用高脂飲食誘導C57BL/6J小鼠肥胖的方法可以建立骨關(guān)節(jié)炎模型，該模型可用于肥胖相關(guān)骨關(guān)節(jié)炎的研究。

高脂飲食；肥胖；骨關(guān)節(jié)炎；動物模型；小鼠

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis, OA）是以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變?yōu)橹饕卣鞯穆躁P(guān)節(jié)疾病。OA的病因復雜，與年齡、性別、肥胖、關(guān)節(jié)損傷、遺傳、炎癥、代謝障礙等有關(guān)[1]，其中肥胖在OA的發(fā)生和發(fā)展中起著很重要的作用。隨著我國人群肥胖患病人數(shù)的不斷增加，OA的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢[2]，因此，探討肥胖相關(guān)OA的發(fā)病機制對防治OA具有重要意義。對OA機制的研究離不開合適的動物模型，根據(jù)研究目的不同，可采用不同的OA造模方法，如手術(shù)、關(guān)節(jié)制動、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射等方法。肥胖相關(guān)OA屬于代謝性O(shè)A的一種，肥胖引起的機械應(yīng)激、全身性介質(zhì)及脂肪因子的分泌、低度炎癥、代謝變化直接影響OA的發(fā)生發(fā)展[3]，采用諸如手術(shù)等造模方法不能反映這些特點，而通過高脂飲食誘導動物發(fā)生肥胖，進而建立OA模型是研究肥胖相關(guān)OA發(fā)病機制的理想手段。目前，采用高脂飲食誘導OA動物模型的方法還無定論。因此，本研究擬采用高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6J雄鼠使之發(fā)生肥胖，通過血清學、病理學指標判定OA的發(fā)生情況，并觀察軟骨細胞的凋亡，以期為肥胖相關(guān)OA研究中合適動物模型的建立提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1 主要試劑

乙二胺四乙酸二鈉（Genview），4%多聚甲醛（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司），乙醇、二甲苯、伊紅、蘇木素、番紅O（國藥集團化學試劑有限公司），凋亡檢測TUNEL試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），血清Ⅱ型膠原C端肽（collagen typeⅡ C-telopeptide,CTX-Ⅱ）ELISA試劑盒（武漢華美生物技術(shù)有限公司）。

2 實驗動物分組

6周齡雄性C57BL/6J小鼠20只，初始體重20±2g，由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXE（遼）2003-0009；實驗動物許可證號：SCXE（遼）2003-2013。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組和高脂組，每組10只。對照組喂飼普通基礎(chǔ)飼料（購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司），高脂組喂飼自制高脂飼料（由53%基礎(chǔ)飼料、24%豬油、3%酪蛋白及20%蒸餾水制成，脂肪供能比58%）。實驗共進行16周，期間各組小鼠均自由進食及飲水，每周稱重并記錄攝食量。

3 樣品采集和處理

小鼠經(jīng)乙醚麻醉后，摘眼球取血，室溫靜置30min，3000r/min離心15min，收集血清。取左下肢膝關(guān)節(jié)，撥離干凈，4%多聚甲醛固定24h后放入10%EDTA-Na2脫鈣液中脫鈣30d。常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，切片厚度6μm,行HE染色、番紅O染色及軟骨細胞凋亡檢測。

4 血清CTX-Ⅱ水平檢測

按照ELISA試劑盒說明書進行檢測，在反應(yīng)終止后用酶標儀在450nm波長測量各孔的吸光度。

5 軟骨組織形態(tài)學觀察

5.1 HE染色

切片用二甲苯浸泡10min，更換二甲苯再浸泡10min，依次過100%酒精I、Ⅱ各10min，90%酒精5min，85%酒精5min；蘇木素染色20min后水洗1次，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，立即水洗然后清水浸泡3.5h；伊紅染色1.5min，用85%、90%酒精先后瞬時浸泡，再用100%酒精I、Ⅱ各浸泡10min。二甲苯I、Ⅱ各透明10min，中性樹膠封片。

5.2 番紅O染色

常規(guī)脫蠟至水，1%番紅O染色1min，鏡下體積分數(shù)95%乙醇分化數(shù)秒，風干；二甲苯透明，中性樹膠封片。

5.3 修改后的Mankin評分評價

Mankin評分是學術(shù)界公認的對OA軟骨退變程度進行評價的通用標準。本實驗采用修改后的Mankin評分[4]，由兩名觀察者采用雙盲法對兩組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織的HE染色、番紅O染色結(jié)果進行評價，分值從0～14，得分越高者病變程度越重（表1）。

表1 修改后的Mankin評分標準Tab. 1 Modified Mankin scores

6 TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡

軟骨組織切片常規(guī)脫蠟處理，加0.01mol/L TBS1∶200新鮮稀釋proteinase K 37℃消化15min，TBS洗2min，3次。按每張切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl，加入18μl標記緩沖液中，混勻。每片20μl，置樣品于濕盒中，37℃標記2h。再用0.01mol/L TBS洗2min，3次。加封閉液每片50μl，室溫30min，甩掉封閉液，不洗。用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，混勻后按每片50μl加至標本片。置樣品于濕盒中，37℃反應(yīng)30min，0.01mol/L TBS洗2min，3次。用抗體稀釋液1∶100稀釋SABCFITC，混勻后50μl每片加至標本片37℃反應(yīng)30min，0.01mol/L TBS洗5min，4次?？篃晒馑p封片劑封片。熒光顯微鏡觀察，藍色光激發(fā)，細胞核中有黃綠色熒光顆粒為陽性細胞，即凋亡細胞。計數(shù)膝關(guān)節(jié)軟骨組織的所有凋亡細胞數(shù)，取平均值。

7 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 高脂飲食可以誘導C57BL/6J小鼠發(fā)生肥胖

對兩組小鼠的體重和攝食量分析顯示，高脂飲食喂養(yǎng)1周后高脂組小鼠體重即顯著高于對照組，且一直持續(xù)至實驗結(jié)束；但兩組小鼠在整個實驗期內(nèi)的平均攝食量方面無明顯差異（圖1）。

圖1 高脂飲食小鼠體重變化及攝食量統(tǒng)計學分析。A，體重；B，平均攝食量；n=10；#，與對照組比較，P＜0.01Fig. 1 Statistical analysis on mice body weight and average food intake. A, body weight; B, average food intake; n=10; #, P＜0.01, compared with control group

2 高脂組小鼠血清CTX-Ⅱ水平升高

ELISA檢測顯示，在第16周末，高脂組小鼠血清CTX-Ⅱ水平顯著高于對照組（圖2）。

圖2 高脂飲食小鼠血清CTX-Ⅱ水平統(tǒng)計學分析。*，與對照組相比，0.01＜P＜0.05， n=10Fig. 2 Comparison of serum CTX-Ⅱ levels between control and high-fat diet fed mice. n=10, *, 0.01＜P＜0.05, compared with control group

3 高脂飲食誘導的肥胖小鼠發(fā)生OA

HE染色顯示，對照組小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞排列整齊，軟骨組織表面平整，基質(zhì)染色正常；而高脂組小鼠的軟骨細胞減少或者局部增加，排列混亂不齊，基質(zhì)染色不均。番紅O染色檢測顯示，對照組軟骨組織潮線較為清晰、完整，無缺失現(xiàn)象；而高脂組軟骨組織可見潮線界限較為模糊，顏色變淺等現(xiàn)象（圖3A）。修改后的Mankin評分結(jié)果顯示，高脂組小鼠膝關(guān)節(jié)Mankin評分顯著高于對照組（圖3B）。

4 高脂飲食誘導的肥胖OA小鼠軟骨細胞凋亡增加

TUNEL法染色檢測顯示，大多數(shù)對照組小鼠的凋亡細胞較少，而絕大多數(shù)高脂組小鼠的凋亡細胞較多，且在軟骨組織各個分層中都有分布,特別是在軟骨表層（圖4A）。經(jīng)計數(shù)兩組小鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡細胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，高脂組的平均凋亡細胞數(shù)（12.2/只）遠遠高于對照組（4.8/只），但由于對照組小鼠也有凋亡細胞數(shù)較高者，而高脂組小鼠亦有凋亡細胞數(shù)較少者，因而造成標準差較大，統(tǒng)計學上無顯著性差異（圖4B）。

圖3 高脂飲食小鼠軟骨組織形態(tài)學染色及修改后Mankin評分。A，HE及番紅O染色（比例尺，100μm）；B，修改后的Mankin評分；#，與對照組相比，P＜0.01； n=5Fig. 3 Histological staining and modified Mankin scores in experimental mice. A, representative sections of HE and SafraninO staining (scale bar∶100μm); B, modified Mankin scores of knee joint; #, P＜0.01, compared with control group; n=5

圖4 高脂飲食小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡檢測。A，凋亡細胞的TUNEL法染色檢測；比例尺，100μm；B，凋亡細胞的統(tǒng)計學分析； n=5Fig. 4 Detection of apoptotic chondrocytes in experimental mice. A, TUNEL staining of apoptotic cells (A1 control, A2 high fat diet); scale bar, 100μm;B, statistical analysis for apoptotic cells; n=5

討 論

骨關(guān)節(jié)炎是由增齡、肥胖、勞損、創(chuàng)傷等諸多因素引起的一種退行性病變。肥胖作為OA發(fā)病的重要影響因素，其致病機制可能是通過增加機械負荷，促進細胞因子、炎癥介質(zhì)及脂肪因子的釋放，上調(diào)軟骨細胞外基質(zhì)降解酶的產(chǎn)生，加重氧化應(yīng)激損傷，增加關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡，影響軟骨及軟骨下骨的營養(yǎng)供給等促進OA的發(fā)病和進展[5]。研究肥胖影響OA發(fā)病及進展的確切機制需要適合的動物模型。目前常用的OA模型多以膝關(guān)節(jié)內(nèi)半月板切除、交叉韌帶切斷等關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)途徑造模，穩(wěn)定性好但不能排除創(chuàng)傷性滑膜炎的干擾[6-8]，不適合研究肥胖引起的代謝性O(shè)A。BrunnerAM等[9]研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食是引發(fā)OA的危險因素；Griffin等[10]發(fā)現(xiàn)C57BL/6J小鼠飲食性肥胖可引發(fā)OA及全身低度炎癥。高脂飲食誘導C57BL/6J小鼠肥胖與人類肥胖有類似的顯著性特征（中心性肥胖、高血糖和高血壓、脂質(zhì)代謝紊亂等）[11]，因此，本研究利用高脂飲食誘導C57BL/6J小鼠肥胖來建立OA模型具有一定可行性，可能適合研究人類肥胖相關(guān)的代謝性O(shè)A。

常用的OA判定方法有影像學檢查（核磁共振成像、X線檢查、Micro-CT等）及病理學診斷、生物標志物檢測等。檢測OA生物標志物的方法常用于OA實驗研究，如檢測大鼠血清中iNOS、SOD、CTX-Ⅱ濃度[12,13]。作為OA的生物標志物，血清及尿液中CTX-Ⅱ濃度與軟骨組織退化程度成正相關(guān)[14,15]；關(guān)節(jié)液中CTX-Ⅱ的含量在關(guān)節(jié)損傷或發(fā)生OA后明顯升高[16]。相比于影像學檢查和病理學診斷，檢測血液或尿液中CTX-Ⅱ含量可能是一種更方便的檢測OA的方法，并且可以動態(tài)監(jiān)測OA的變化。本研究檢測了小鼠血清中CTX-Ⅱ的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂組血清CTX-Ⅱ濃度顯著高于對照組，提示高脂誘導的肥胖小鼠軟骨組織退化程度更為嚴重。本研究的組織病理學檢測發(fā)現(xiàn)，高脂組小鼠呈現(xiàn)出程度不同的OA病理改變，如基質(zhì)染色變淺、軟骨細胞排列紊亂、數(shù)量局部增多或減少、潮線不完整等；修改后的Mankin評分的結(jié)果也顯示高脂組的評分顯著高于對照組，與病理學觀察結(jié)果一致。因此，結(jié)合血清學、病理學及修改后的Mankin評分的結(jié)果，本研究提示通過高脂飲食誘導的肥胖C57BL/6J小鼠可以發(fā)生OA。Kelsey H. Collins[17]同樣采用高脂高糖飲食誘導雄性大鼠肥胖研究OA，也發(fā)現(xiàn)高脂高糖飲食可能促進OA發(fā)展。而Triantaphyllidou IE等[18]研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠不會導致OA的發(fā)生，這可能是因為該研究采用的高脂飲食中脂肪供能比較低（42%），而本研究采用較高脂肪供能比（58%）的高脂飲食所致。

關(guān)節(jié)軟骨細胞的異常凋亡與OA的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系[19]，且軟骨細胞在OA早期即發(fā)生大量凋亡，軟骨的凋亡細胞數(shù)量與軟骨損傷程度成正相關(guān)[20]。因此，本研究也檢測了兩組小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂組小鼠細胞凋亡數(shù)的平均值遠遠高于對照組，但統(tǒng)計學上沒有顯著性，究其原因可能是因為組內(nèi)差異過大造成。有研究表明軟骨細胞凋亡與年齡老化相關(guān)[21]，本研究中隨著小鼠月齡的增加，個別對照組小鼠也會出現(xiàn)軟骨細胞凋亡增多的情況；而高脂組小鼠OA嚴重程度也并不完全一致，造成組內(nèi)細胞凋亡數(shù)目差距較大。Iwata M等[22]研究發(fā)現(xiàn)，采用高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠8周可以顯著增加軟骨細胞凋亡；Asou Y等[23]采用高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠12周，也發(fā)現(xiàn)其軟骨細胞凋亡顯著高于對照組，且并不完全依賴于肥胖造成的關(guān)節(jié)負荷增加。因此，在本研究中高脂組軟骨細胞凋亡未出現(xiàn)顯著增加的情況，可能與實驗動物數(shù)較少（n=5）或喂養(yǎng)時間有關(guān)，可以通過適當增加樣本量或調(diào)整喂養(yǎng)時間來進行完善。

本研究利用高脂飲食誘導小鼠肥胖的方法可以建立OA動物模型，在研究肥胖相關(guān)OA的機制方面具有一定價值。但是OA的發(fā)生受多種因素影響，如何保證高脂誘導的小鼠OA病變程度的一致性還有待進一步探索，未來的研究需要在造模的時間、OA動物的篩選等方面做更多的探討。

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Establishment of osteoarthritis model in C57BL/6J obese mice induced by high fat diet

He Jianyi, Jiang Mengqi, Liu Xudan, Yu Xiaolu, Xu Xiaolei, Liu Li*
(Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, China Medical University, Shenyang 110122, China)

ObjectiveEstablish an osteoarthritic model in high-fat diet induced obese mice to study obesity-related osteoarthritis(OA).MethodsTwenty C57BL / 6J male mice were randomized into control and high-fat diet groups fed with basic or high-fat diet respectively. Body weight and food intake were measured weekly. Sixteen weeks later serum samples were collected to determine serum collagen typeⅡ C-telopeptide (CTX-Ⅱ) levels by ELISA. Their left knee joints were fixed, decalcified and paraffin embedded for histological examination (HE and Safranin O staining), modified Mankin scoring as well as apoptosis detection (TUNEL assay).ResultsCompared with control mice, the body weight and serum CTX-Ⅱ level significantly increased in obese mice, while food intake showed no difference. HE and Safranin O staining indicated reduced and disorganized articular chondrocytes, discontinuity of tidemark and poor staining in the knee joints of high-fat diet fed mice. The modified Mankin scores in high-fat diet group were significantly higher than that in control group. TUNEL assay showed that compared to control mice, the number of apoptotic cells in articular cartilage increased in the high-fat diet fed mice which however was not statistically significant.ConclusionOsteoarthritic model in obese mouse, which may be suitable for obesity related OA study, can be established through feeding mouse with high-fat diet.

High-fat diet; obesity; osteoarthritis; animal model; mouse

R684.3

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 003

2017-05-20

2017-10-10

國家自然科學基金（81372971）

何健宜，男 (1993年)，漢族， 碩士研究生

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：lliu@cmu.edu.cn