趙騰騰 楊雪雨 董珂珂 朱小蕾

乙酰膽堿酯酶AChE與1，7-二氮雜咔唑抑制劑的作用機(jī)理的分子動(dòng)力學(xué)模擬

趙騰騰 楊雪雨 董珂珂 朱小蕾＊

（南京工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009）

通過分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬以及成鍵自由能分析方法,從原子水平上模擬研究了3種1,7-二氮雜咔唑衍生物（分別記為M1、M2和M3）與AChE的結(jié)合模式及相互作用機(jī)理,分析和討論了研究體系的靜電相互作用和范德華相互作用（vdW）。用MM-PBSA方法計(jì)算的3種抑制劑與AChE之間的結(jié)合自由能與抑制劑的實(shí)驗(yàn)生物活性數(shù)據(jù)（IC50值）相對(duì)應(yīng)。分析結(jié)果表明,殘基S286與抑制劑之間形成的氫鍵作用有利于抑制劑與AChE之間的結(jié)合。范德華相互作用,尤其是抑制劑與關(guān)鍵殘基W279和Y334的作用,對(duì)抑制劑與AChE之間的結(jié)合自由能有較大的貢獻(xiàn),在區(qū)分抑制劑M1（或M2）和M3的生物活性上發(fā)揮著重要的作用。

阿爾茨海默癥；乙酰膽堿酯酶；1,7-二氮雜咔唑類抑制劑；分子動(dòng)力學(xué)模擬；MM-PBSA

眾所周知,世界正面臨老齡化問題,阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)病率隨著年齡的增加而顯著增加。阿爾茨海默癥病人的主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙［1]、記憶缺失及語言障礙［2-3]等神經(jīng)精神癥狀。迄今為止,阿爾茨海默病本質(zhì)上可能的病因是基底前腦膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的缺陷,尤其是乙酰膽堿（ACh）的大量缺失［4-6]。膽堿酯酶包括乙酰膽堿酯酶（AChE）和丁酰膽堿酯酶（BChE）,其主要作用是使膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)水解。在ACh的水解酶作用下［7],ACh將被水解為膽堿和乙酸,從而引起阿爾茨海默癥。因此,抑制AChE和BChE被認(rèn)為是最有前途的治療阿爾茨海默病的策略。

根據(jù)X射線結(jié)構(gòu)分析［8],AChE的活性位點(diǎn)中存在一個(gè)狹而深的峽谷,包括兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn):位于峽谷底部的Ser-His-Glu催化位點(diǎn)（CAS）,以及位于峽谷入口的外圍陰離子結(jié)合位點(diǎn)（PAS）［8]。 因此,AChE抑制劑可分為兩種類型,即單位點(diǎn)抑制劑和雙位點(diǎn)抑制劑［8-12]。前人研究［10，13]表明,與單位點(diǎn)抑制劑相比,雙位點(diǎn)抑制劑能更有效的治療AD。

至今,實(shí)驗(yàn)上已經(jīng)設(shè)計(jì)合成了許多AChE和BChE抑制劑。例如,Xie等［14]設(shè)計(jì)合成了一系列新型的具有多功能多靶點(diǎn)的香豆素類混合抑制劑,其中大多數(shù)抑制劑能有效地抑制AChE的活性。Alpan等［15]設(shè)計(jì)合成了苯并咪唑及其衍生物類抑制劑,并進(jìn)行了活性分析,發(fā)現(xiàn)改變雜環(huán)上的親脂性原子或者環(huán)上的取代基均可增強(qiáng)AChE抑制劑的活性。Maryam等［16]合成了一系列的新型的吖啶酮連接到1,2,3,-三唑的衍生物,并預(yù)測了它們對(duì)AChE和BChE的生物活性,對(duì)接結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。Asadipour等［17]設(shè)計(jì)合成了一系列由香豆素、甲酰胺基以及芐基哌啶這幾個(gè)結(jié)構(gòu)組成的芐基哌啶類AChE抑制劑,對(duì)接研究表明它們具有雙重結(jié)合位點(diǎn)。Gao 等［18]和 Liu 等［19]設(shè)計(jì)合成了一系列新型的氯查耳酮的叔胺衍生物,并評(píng)估了這一類衍生物對(duì)AChE和BChE的生物活性。最近,Gazzard等［20]發(fā)現(xiàn),1,7-二氮雜咔唑衍生物是AChE強(qiáng)有效的抑制劑。在理論研究方面,Niu等［21]采用拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬方法研究了抑制劑E2020與AChE的結(jié)合機(jī)制,并在原子水平上為E2020從乙酰膽堿酯酶 （TcAChE）的解離提供了新的思路。Puiatti等［22]通過分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)抑制劑與AChE的結(jié)合模式進(jìn)行了研究,并比較了3種石松類生物堿抑制劑與AChE的結(jié)合模式,通過MM-GBSA方法計(jì)算的3個(gè)復(fù)合物的結(jié)合能與實(shí)驗(yàn)上抑制劑的IC50值相一致。Zhu等［23]利用分子動(dòng)力學(xué)和MM-PBSA方法,研究了syn1-TZ2PA6和anti1-TZ2PA6兩種同分異構(gòu)體分別對(duì)AChE1和AChE2的選擇性機(jī)制。Zhou等［24]通過3DQSAR方法、分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)60種他克林衍生物及其對(duì)AChE抑制活性的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,AChE與抑制劑形成的復(fù)合物的空間位阻和氫鍵對(duì)抑制劑的生物活性影響較大。AChE的結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵殘基包含 Tyr70、Trp84、Tyr121、Trp279 和Phe330。Shi等［25]用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬方法,研究了對(duì)映體（RS,S）-17b 和（RS,R）-17b 與 AChE 的結(jié)合模式,為設(shè)計(jì)新型高效的AChE抑制劑提供了新的線索。最近,Mohammadi等［26]通過改變烷基取代基設(shè)計(jì)出了許多氨基甲酸酯衍生物,并利用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬方法研究了取代結(jié)構(gòu)對(duì)抑制劑與AChE結(jié)合能以及AChE構(gòu)象變化的影響。Hossain等［27]在化學(xué)計(jì)量學(xué)和動(dòng)力學(xué)模擬分析的基礎(chǔ)上研究了乙酰膽堿酯酶抑制劑對(duì)分子結(jié)構(gòu)的要求。

目前許多AChE抑制劑已經(jīng)在臨床上應(yīng)用于AD的治療,例如他克林（Tacrine）［28]、多奈哌齊（Donepezil）［29-30]、加蘭他敏（Galanthamine）［31]、利凡斯的明（Rivastigmine）［32-33]等藥物,但是治療中仍然伴隨著一定的副作用。上述問題出現(xiàn)的主要原因之一是抑制劑與AChE之間的作用機(jī)理還沒有清楚地理解,這是一個(gè)亟待解決的問題。因此,設(shè)計(jì)高效的最小副作用的新型AChE抑制劑仍然是非常重要且具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。目前,從原子層次上揭示抑制劑與AChE詳細(xì)的作用機(jī)理還沒有報(bào)道,而這些研究的進(jìn)行有利于解決上述問題以及加速實(shí)驗(yàn)研究。在這個(gè)過程中,分子動(dòng)力學(xué)模擬是一個(gè)關(guān)鍵性的技術(shù)［21-27]。因此,我們選擇了3個(gè)1,7-二氮雜咔唑衍生物作為AChE抑制劑,利用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、自由能計(jì)算以及能量分解等方法來研究抑制劑與AChE的結(jié)合機(jī)理,揭示AChE抑制劑的生物活性大小的原因。模擬結(jié)果證明了范德華相互作用（vdW）對(duì)結(jié)合自由能有較大的貢獻(xiàn),靜電相互作用（包括氫鍵作用）有利于3個(gè)抑制劑穩(wěn)定在AChE的結(jié)合位點(diǎn)中。結(jié)合位點(diǎn)上的主要關(guān)鍵殘基 （W279和Y334）,在抑制劑與AChE的結(jié)合中以及區(qū)分3個(gè)抑制劑的生物活性上發(fā)揮著重要作用。本文的研究為今后設(shè)計(jì)更高效的AChE抑制劑提供了理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 準(zhǔn)備初始結(jié)構(gòu)

AChE的X射線晶體結(jié)構(gòu)是從PDB數(shù)據(jù)庫（PDB代碼:1EVE,分辨率為 0.25 nm）［34]中提取的,去除該晶體結(jié)構(gòu)中的配體、結(jié)晶水分子和氫原子,作為初始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。利用畫圖軟件構(gòu)建3個(gè)1,7-二氮雜咔唑衍生物（分別標(biāo)記為M1、M2和M3）,如表1中所示,并在B3LYP/6-31G*水平上用Gaussian 09軟件［35]進(jìn)行優(yōu)化得到最優(yōu)結(jié)構(gòu),優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)作為分子對(duì)接所需配體的初始結(jié)構(gòu)。

表1 3個(gè)1,7-二氮雜咔唑衍生物抑制劑的結(jié)構(gòu)和IC50值Table 1 Structures and bioactivity of three 1,7-diazacarbazole derivative inhibitors to AChE

1.2 對(duì)接方法

小分子配體與受體的相互作用首先通過分子對(duì)接研究。我們采用Autodock4.0軟件的拉馬克遺傳算法［36]進(jìn)行了分子對(duì)接的研究,將極性氫原子添加到蛋白質(zhì)的各個(gè)殘基上,再將科爾曼聯(lián)合原子電荷添加到AChE的部分原子上。在對(duì)接過程中,將受體的格點(diǎn)盒子大小設(shè)置為6.5 nm×6.5 nm×6.5 nm,間隔為0.037 5 nm。用遺傳算法共進(jìn)行200次獨(dú)立對(duì)接計(jì)算,然后從對(duì)接構(gòu)象的最大簇（均方根偏差RMSD設(shè)定為0.2 nm）選出最優(yōu)構(gòu)象,最終得到的復(fù)合物體系的結(jié)構(gòu)用作后續(xù)的MD模擬的初始結(jié)構(gòu)。

1.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬

我們采用AMBER10.0軟件分別對(duì)3個(gè)復(fù)合物體系的進(jìn)行MD模擬,本文中受體和配體的力場分別為AMBERFF03［37]和 GAFF［38]力場,用 Antechamber模塊添加配體的氫原子并擬合RESP（限制靜電勢）［39]電荷。將3個(gè)復(fù)合物體系分別加到一個(gè)溶劑為TIP3P水分子模型［40]的盒子中,盒子半徑為1.0 nm。氫原子通過LEaP模塊添加,并添加抗衡離子Na+使體系電荷呈中性。在MD之前,對(duì)每個(gè)體系進(jìn)行能量最小化,采用 2 000步的最小化法和2 000步的共軛梯度法,非鍵截?cái)喟霃皆O(shè)為1.0 nm。MD模擬過程先進(jìn)行200 ps的41 840 kJ·mol-1·nm-2限制性加熱（0～300 K）,然后在 NPT 系綜（P=101 kPa,T=300 K）下進(jìn)行時(shí)間步長為0.002 ps的50 ns非限制的MD模擬。在MD模擬過程中,采用SHAKE算法［41]對(duì)原子鍵長進(jìn)行約束,長程靜電相互作用采用 Particle-mesh Ewald （PME）［42]進(jìn)行處理。

1.4 結(jié)合自由能計(jì)算

為了清楚地了解3個(gè)抑制劑與AChE的結(jié)合機(jī)制,我們通過AMBER10.0中的MM-PBSA程序［43]計(jì)算得到每個(gè)復(fù)合物體系的結(jié)合自由能以及能量分解。對(duì)于每個(gè)體系,取穩(wěn)定后的最后5 ns的MD軌跡,提取200個(gè)構(gòu)象對(duì)抑制劑與AChE的結(jié)合自由能計(jì)算來研究生物活性。配體與受體結(jié)合自由能（ΔGbind）可表述為［44-45]:

其中ΔGcomplex、ΔGprotein和ΔGligand分別代表復(fù)合物、蛋白質(zhì)以及配體的自由能。結(jié)合自由能又可分解為三部分:氣相結(jié)合能（ΔEgas）、溶劑化自由能（ΔGsol）和熵貢獻(xiàn)（-TΔS）（式 2）。 ΔEgas又可進(jìn)一步分解成靜電能（ΔEele）和范德華作用能（ΔEvdW）（式 3）。 溶劑化自由能（ΔGsol）可以分為兩部分:極性溶劑化自由能（ΔGpolar）和非極性溶劑化自由能 （ΔGnonpolar）（式 4）。 非極性溶劑化自由能（ΔGnonpolar）通過計(jì)算方程 （式5）中的溶劑可及表面積（SASA）獲得,其中SASA可以通過AMBER 10.0軟件中的Molsurf方法得到。溶劑的探針半徑設(shè)為0.14 nm。對(duì)應(yīng)的溶劑參數(shù)γ和β分別設(shè)為0.226 77 kJ·mol-1·nm-1和 3.85 kJ·mol-1。 溶質(zhì)和溶劑的介電常數(shù)分別設(shè)為1.0和80.0。另外,由于熵的計(jì)算對(duì)于大體系而言異常耗時(shí),并且對(duì)于相似的蛋白質(zhì)來說小分子的結(jié)合引起的熵變很接近［46]。因此,在本文的工作中忽略了熵（-TΔS）對(duì) ΔGbind的貢獻(xiàn)［46-47]。用這種方法對(duì)能量的計(jì)算在前人的研究工作中也被證實(shí)是合理的［48]。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)合模式

在本文中,我們分別將抑制劑M1、M2和M3對(duì)接到AChE中,得到最優(yōu)的對(duì)接構(gòu)象如圖1（a）所示,將用于后續(xù)的MD模擬。從圖1（a）中可以看出,3個(gè)抑制劑與AChE的結(jié)合模式大致相同,詳細(xì)的對(duì)接模式如圖2所示。在圖2中可以看出,所有抑制劑都位于由殘基 Y70（Tyr70）、V71（Val7l）、D72（Asp72）、S81（Ser81）、W84（Trp84）、N85（Asn85）、G118（Gly118）、Y121（Tyr121）、S122 （Ser122）、W279 （Trp279）、L282 （Leu282）、S286（Ser286）、I287 （Ile287）、F288 （Phe288）、R289（Arg289）、F290 （Phe290）、F330 （Phe330）、F331 （Phe331）、Y334（Tyr334）和 W432（Trp432）形成的結(jié)合口袋中。 同時(shí),我們還可以看出3個(gè)抑制劑均與AChE形成了氫鍵,使抑制劑與AChE結(jié)合模式更加牢固。選擇結(jié)合能較低且構(gòu)象較多的結(jié)構(gòu)作為最好的對(duì)接構(gòu)象,用作后續(xù)MD模擬的初始結(jié)構(gòu)。如圖1（b）和圖3所示,在MD模擬之后,3個(gè)復(fù)合物體系的構(gòu)象與圖1（a）和圖2中的對(duì)接結(jié)果很相似,配體周圍的殘基變化不大。每個(gè)體系的回旋半徑基本上都能保持穩(wěn)定。因此,抑制劑與AChE結(jié)合時(shí),AChE的結(jié)構(gòu)都是穩(wěn)定的。

圖1 抑制劑與AChE的結(jié)合模式:（a）3個(gè)AChE/M1～M3體系的對(duì)接構(gòu)象;（b）3個(gè)AChE/M1～M3體系的MD構(gòu)象Fig.1 Binding modes of the inhibitors with AChE:（a）Docking conformations of three AChE/inhibitor complexes;（b）MD conformations of three AChE/inhibitor complexes

圖2 AChE與3個(gè)1，7-二氮雜咔唑類抑制劑復(fù)合物Fig.2 Detailed docking binding modes of the three complexes

圖3 3個(gè)復(fù)合物體系MD模擬后的最低能量構(gòu)象Fig.3 Conformations with lowest energy after MD simulations for three complexes

為了深入了解結(jié)合態(tài)AChE殘基的變化,我們對(duì)蛋白質(zhì)的柔性進(jìn)行了分析,蛋白質(zhì)的柔性可由每一個(gè)殘基的B因子（B-factor）來評(píng)判。本文我們計(jì)算了3個(gè)復(fù)合物體系的蛋白質(zhì)殘基的B-factor值,并與游離態(tài)AChE的B-factor進(jìn)行比較。通過分析,3個(gè)復(fù)合物體系具有相似的B-factor值分布,并且結(jié)合態(tài)AChE的殘基與游離態(tài)AChE實(shí)驗(yàn)晶體結(jié)構(gòu)的B-factor值分布基本一致,這也說明3個(gè)抑制劑與AChE的結(jié)合模式比較相似。

2.3 AChE與抑制劑的結(jié)合機(jī)理及抑制劑的生物活性

抑制劑與AChE的結(jié)合自由能計(jì)算是衡量抑制劑活性的重要方法。本文我們用MM-PBSA的方法計(jì)算了3個(gè)復(fù)合物體系的結(jié)合自由能以及不同能量項(xiàng),結(jié)果列在表2中。表2中的能量值,正數(shù)表示這種作用不利于抑制劑與AChE的結(jié)合,負(fù)數(shù)表示這種作用使體系能量降低,有利于結(jié)合,負(fù)數(shù)絕對(duì)值越大,表示這種作用對(duì)結(jié)合的貢獻(xiàn)越大。從表2可以看出,M1、M2、M3與 AChE的結(jié)合自由能分別為:-144.35、-129.37、-102.47 kJ·mol-1,與實(shí)驗(yàn)中抑制劑生物活性（IC50值分別為 0.890、4.77、13.3 nmol·ml-1）［20]的大小次序相一致,表明抑制劑的生物活性順序:M1＞M2＞M3。

為了進(jìn)一步了解每個(gè)殘基在結(jié)合過程中的作用,我們用MM-PBSA方法對(duì)3個(gè)復(fù)合物體系中（AChE/M1～AChE/M3）每個(gè)殘基的結(jié)合自由能進(jìn)行了能量分解,如圖 5（a）所示,標(biāo)注出的是 ΔGbind小于約-3.5 kJ·mol-1的殘基,可以看出AChE與抑制劑相互作用的關(guān)鍵殘基有:AChE/M1（Y70、V71、W84、W279、S286、I287、Y334）、AChE/M2（V71、W84、W279、F331、Y334）、AChE/M3 （V71、Q74、W84、N85、W279、F290、F330、F331、Y334）,這與實(shí)驗(yàn)上［20]以及其它理論研究［24]的結(jié)果相一致。表2中比較了每一個(gè)能量項(xiàng) （ΔEele、ΔEvdW、ΔGpol、ΔGnonpolar）對(duì)總的自由能（ΔGbind）的貢獻(xiàn)。通過分析表2可以看出,范德華作用（ΔEvdW）對(duì)AChE與抑制劑的結(jié)合起主導(dǎo)作用（-241.17、-234.72、-200.58 kJ·mol-1）。 極性溶劑化能（ΔGpol）對(duì)結(jié)合是不利的,盡管氣相的靜電能（ΔEele）對(duì)結(jié)合是有利的,但也不能完全抵消極性溶劑化自由能對(duì)結(jié)合的不利影響［50-51]。 另外,非極性溶劑化能（ΔGnonpolar）也有較小的貢獻(xiàn)。

圖5 AChE/抑制劑復(fù)合物體系中抑制劑-殘基之間的相互作用能譜 （a）和3個(gè)復(fù)合物體系的主要?dú)埢╕70、V71、Q74、W84、N85、W279、S286、I287、F290、F330、F331、Y334）的能量比較 （b）Fig.5 Decomposition of total interaction energy on a per-residue basis for the three proteininhibitor complexes （a）and comparison of interaction energies of the major residues（Y70，V71，Q74，W84，N85，W279，S286，I287，F(xiàn)290，F(xiàn)330，F(xiàn)331，and Y334）for the three AChE/inhibitor complexes（b）

為了更好地驗(yàn)證3個(gè)抑制劑的生物活性,如圖5所示,我們深入分析了關(guān)鍵殘基與抑制劑之間的相互作用。從圖 5（a）中可以看出,對(duì)于 AChE/M1、AChE/M2、AChE/M3復(fù)合物體系,這些關(guān)鍵殘基包括Y70、V71、Q74、W84、N85、W279、S286、I287、F290、F330、F331 和Y334。 在這些殘基中,主要?dú)埢?W84、W279、Y334與抑制劑（M1、M2、M3）結(jié)合自由能的總和分別為-31.13、-30.17、-25.36 kJ·mol-1,使3個(gè)抑制劑的生物活性順序?yàn)?M1＞M2＞M3。 圖 5（b）表示關(guān)鍵殘基與 3 個(gè)抑制劑的結(jié)合自由能圖,殘基Y334與抑制劑的結(jié)合自由能明顯弱于殘基W279與抑制劑間的結(jié)合自由能,后者更能有效地區(qū)分3個(gè)抑制劑的生物活性。

通過表2得知,范德華作用對(duì)復(fù)合物的結(jié)合起主導(dǎo)作用,我們對(duì)范德華作用進(jìn)行了殘基自由能分解,結(jié)果如圖 6（a）所示,列出的是 ΔEvdW小于約-3.5 kJ·mol-1的殘基。由表2可以看出,抑制劑M1與AChE之間的范德華相互作用（ΔEvdW:-241.17 kJ·mol-1）明顯強(qiáng)于抑制劑M2（或M3）與AChE之間的范德華相互作用（-234.72 （或-200.58）kJ·mol-1）,使得 3 個(gè)抑制劑的生物活性順序?yàn)?M1＞M2＞M3。如圖 6（a）所示,抑制劑 M1與 關(guān) 鍵 殘 基 （Y70、V71、D72、S81、W84、Y121、W279、F330、F331、Y334）之間的范德華相互作用,尤其是殘基Y70、W84、W279、Y334,對(duì)結(jié)合自由能有較大的貢獻(xiàn)。從圖6（a）可以看出,盡管抑制劑M2和M3與殘基Y334之間的范德華相互作用相對(duì)更強(qiáng),但是抑制劑M1與殘基W279之間的范德華相互作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于M2（或M3）與W279之間的范德華相互作用。抑制劑M1、M2、M3 與 這 些 關(guān) 鍵 殘 基 （Y70、V71、D72、Q74、S81、W84、Y121、W279、F330、F331、Y334）范德華相互作用之和分別為-84.10、-85.22、-70.12 kJ·mol-1, 與 3個(gè)抑制劑的生物活性大小順序（M1（或 M2）＞M3）相一致。以上分析表明了抑制劑與殘基之間的范德華相互作用,尤其是殘基W279和Y334,對(duì)結(jié)合自由能以及區(qū)分3個(gè)抑制劑的生物活性上有很大的貢獻(xiàn)。

為了揭示靜電相互作用對(duì)抑制劑M1、M2、M3與AChE結(jié)合親和力的影響,我們用LIGPLOT［52]程序分析了抑制劑與AChE之間的氫鍵作用和疏水相互作用。如圖7所示,結(jié)合態(tài)AChE周圍的殘基與結(jié)合自由能殘基分解分析中得到的殘基是一致的。從圖7（a）中可以看出,在AChE/M1體系中,存在一條氫鍵,形成于殘基 S286的氧原子（O）與 M1上的氮原子（N9）之間。如表3所示,這條氫鍵的占有率高達(dá)90.36%,從圖7（d）可以看出,這條氫鍵（O（S286）-N9（M1）在 MD 模擬過程中是趨于穩(wěn)定的,平均距離是0.295 nm（表3）。在AChE/M2體系中,如圖 7（b）所示,在殘基 D72上的氮原子（N）與M2上的氮原子（N25）之間形成了一條占有率為31.56%的氫鍵,這條穩(wěn)定的氫鍵 （N（D72）-N25（M2）（圖 7（d）的平均距離為 0.334 nm（見表 3）。同樣的,在AChE/M3體系中,如圖 7（c）所示,殘基 D72上的氮原子（N）與 M3 上的氧原子（O26）之間形成了氫鍵,占有率為 40.94%,這條氫鍵（N（D72）-O26（M3）穩(wěn)定后的平均距離是0.323 nm（見表3）。為了考察每個(gè)殘基的靜電相互作用對(duì)抑制劑與AChE結(jié)合的細(xì)節(jié),我們對(duì)靜電相互作用進(jìn)行了殘基自由能分解,結(jié)果如圖6（b）所示,列出的是 ΔEele小于約-3.5 kJ·mol-1的殘基（Y70、D72、E73、E199、D276、D285、S286）。 從圖 6（b）可以看出,雖然M3與殘基D72之間的靜電相互作用很強(qiáng),但仍比M1與殘基S286之間的靜電相互作用要弱,這與上述的氫鍵分析結(jié)果是一致的。抑制劑M1、M2、M3分別與關(guān)鍵殘基（D72 和 S286）的凈靜電相互作用（ΔEele+ΔGpol）之和分別為3.60、9.92和10.17 kJ·mol-1,雖然不利于抑制劑與AChE的結(jié)合,但與抑制劑的生物活性相一致。上述分析表明,M1與殘基S286之間形成的氫鍵有利于抑制劑穩(wěn)定在結(jié)合位點(diǎn)。

圖6 3個(gè)抑制劑與AChE復(fù)合物抑制劑-殘基的范德華作用 （a）和3個(gè)抑制劑與AChE復(fù)合物抑制劑-殘基的靜電相互作用 （b）Fig.6 Van der Waals interaction energy spectra of inhibitor-residue pair in AChE/inhibitor complexes （a）and electrostatic interaction energy spectra of inhibitor-residue pair in AChE/inhibitor complexes （b）

圖7 氫鍵和疏水作用二維圖:虛線代表氫鍵，穗狀代表與3個(gè)抑制劑形成疏水作用的殘基（a）AChE/M1;（b）AChE/M2;（c）AChE/M3;（d）抑制劑與AChE之間形成的氫鍵的距離隨MD模擬的時(shí)間變化，其中，M1與殘基S286的距離曲線上移了0.05 nm;M2與殘基D72的距離曲線上移了0.2 nmFig.7 2D representation of hydrogen bonds and hydrophobic interactions:Dashed lines represent hydrogen bonds，and spiked residues form hydrophobic interactions for complexes AChE/M1 （a），AChE/M2 （b），and AChE/M3 （c）;（d）Interatomic distances with the MD time evolution show the stability of hydrogen bonds between three inhibitors and AChE;M1:Curve of S286 is shifted upward by 0.05 nm;M2:Curve of D72 is shifted upward by 0.2 nm

表3 MD模擬過程中抑制劑與AChE之間形成的氫鍵Table 3 Hydrogen bonds formed between inhibitors and AChE during MD simulations

基于上述分析,我們從表 2、圖 6（a）、圖 7 中可以看出,在AChE/M1～M3體系中,抑制劑與AChE之間有較強(qiáng)的范德華相互作用,特別是AChE上的殘基W279與抑制劑二氮雜咔唑母體、殘基Y334與抑制劑上苯環(huán)的關(guān)鍵作用。抑制劑M1、M2、M3與這2個(gè)關(guān)鍵殘基 （W279和Y334）的范德華相互作用之和分別為-31.17、-34.60、-24.10 kJ·mol-1。另外,抑制劑 M1 與殘基S286之間的靜電相互作用要強(qiáng)于抑制劑M2/M3與殘基D72之間的靜電相互作用。通過比較AChE/M1、AChE/M2、AChE/M3復(fù)合物體系的結(jié)構(gòu)和相互作用,可以看出母體二氮雜咔唑的重要性。如果二氮雜咔唑與含有一個(gè)苯環(huán)的適當(dāng)?shù)娜〈噙B,像抑制劑M1一樣,就會(huì)在殘基W279與抑制劑二氮雜咔唑母體之間產(chǎn)生較強(qiáng)的范德華相互作用,在殘基S286與二氮雜咔唑母體上的唑氮之間產(chǎn)生較強(qiáng)的氫鍵作用,形成的二氮雜咔唑衍生物抑制劑對(duì)AChE就可能有較強(qiáng)的抑制活性。上述分析揭示了殘基S286對(duì)M1與AChE的結(jié)合起有利作用,主要關(guān)鍵殘基W279和Y334在抑制劑與AChE的結(jié)合中和區(qū)分3個(gè)抑制劑的生物活性中發(fā)揮了重要的作用。

3 結(jié) 論

本文通過分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬和MMPBSA能量計(jì)算方法,從原子水平上研究了3個(gè)1,7-二氮雜咔唑衍生物抑制劑與AChE的相互作用,并揭示了1,7-二氮雜咔唑衍生物抑制劑對(duì)AChE的抑制機(jī)理和3個(gè)抑制劑之間的生物活性差別。模擬結(jié)果表明復(fù)合物中穩(wěn)定的氫鍵可以使抑制劑與AChE之間產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電作用,有利于兩者的結(jié)合。結(jié)合能的計(jì)算結(jié)果與抑制劑的實(shí)驗(yàn)生物活性數(shù)據(jù)（IC50）吻合較好,證實(shí)了抑制劑的生物活性順序?yàn)镸1＞M2＞M3。結(jié)果表明,抑制劑與殘基S286之間形成的氫鍵作用有助于抑制劑與AChE的結(jié)合。范德華相互作用對(duì)AChE/M1～M3體系的結(jié)合自由能有很大的貢獻(xiàn)。主要關(guān)鍵殘基W279和Y334對(duì)于抑制劑與AChE的結(jié)合及區(qū)分3個(gè)抑制劑的生物活性大小起了決定性作用。本文的工作有助于理解AChE抑制劑的抑制機(jī)理,并為設(shè)計(jì)新型的有潛力的AChE抑制劑提供了有價(jià)值的信息。

［1]Mussele S V D，Bastard N L，Vermeiren Y，et al.Int.J.Geriatr.Psychiatr.，2013，28（3）:265-275

［2]Sperling R A，Dickerson B C，Pihlajamaki M，et al.Neuromol.Med.，2010，12（1）:27-43

［3]Nestor P J，F(xiàn)ryer T D，Hodges J R.NeuroImage.，2006，30（3）:1010-1020

［4]Bartus R T，Dean R L，Beer B，et al.Science，1982，217（4558）:408-414

［5]Terry R D，Masliah E，Salmon D P，et al.Ann.Neurol.，1991，30（4）:572-580

［6]Francis P T，Palmer A M，Snape M，et al.J.Neurol.Neurosur.Ps.，1999，67（4）:558-558

［7]Talesa V N.Mech.Ageing Dev.，2001，122（16）:1961-1969

［8]Alipour M，Khoobi M，Moradi A，et al.Eur.J.Med.Chem.，2014，82:536-544

［9]Liu S，Shang R，Shi L，et al.Eur.J.Med.Chem.，2014，81:237-244

［10]Akrami H，Mirjalili B F，Khoobi M，et al.Eur.J.Med.Chem.，2014，84:375-381

［11]Wang C，Wu Z，Cai H，et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.，2015，25（22）:5212-5216

［12]Hong C，Luo W，Yao D，et al.Bioorg.Med.Chem.，2014，22（12）:3213-3219

［13]Giacobini E.Neurochem.Res.，2003，28（3）:515-522

［14]Xie S S，Wang X B，Jiang N，et al.Eur.J.Med.Chem.，2015，95:153-165

［15]Alpan A S，Parlar S，Carlino L，et al.Bioorgan.Med.Chem.，2013，21（17）:4928-4937

［16]Mohammadi-Khanaposhtani M，Saeedi M，Zafarghandi N S，et al.Eur.J.Med.Chem.，2015，92:799-806

［17]Asadipour A，Alipour M，Jafari M，et al.Eur.J.Med.Chem.，2013，70:623-630

［18]Gao X，Zhou C，Liu H，et al.J.Enzyme Inhib.Med.Chem.，2017，32（1）:146-152

［19]Liu H，Liu L，Gao X，et al.Eur.J.Med.Chem.，2017，126:810-822

［20]Gazzard L，Williams K，Chen H F，et al.J.Med.Chem.，2015，58（12）:5053-5074

［21]Niu C，XU Y，Xu Y，et al.J.Phys.Chem.B，2005，109（49）:23730-23738

［22]Puiatti M，Borioni J L，Vallejo M G，et al.J.Mol.Graph.Model.，2013，44:136-144

［23]Zhu X L，Yu N X，Hao G F，et al.J.Mol.Graph.Model.，2013，41:55-60

［24]Zhou A，Hu J，Wang L，et al.J.Mol.Model.，2015，21（10）:277

［25]Shi J，Tu W，Luo M，et al.Mol.Simul.，2016，43（2）:102-109

［26]Mohammadi T，Ghayeb Y.J.Biomol.Struct.Dyn.，2017:1-13

［27]Hossain T，Saha A，Mukherjee A.J.Biomol.Struct.Dyn.，2017:1-12

［28]El-Malah A，Gedawy E M，Kassab A E，et al.Arch.Pharm.Chem.Life Sci.，2014，347（2）:96-103

［29]Molinuevo J L，Berthier M L，Rami L.Arch.Gerontol.Geriatr.，2011，52（1）:18-22

［30]Knowles J.Core Evidence，2006，1（3）:195-219

［31]Marco L，Carreiras M C.Recent Pat.CNS Drug.Discovery，2006，1（1）:105-111

［32]Wolfson C，Oremus M，Shukla V，et al.Clin.Ther.，2002，24（6）:862-886

［33]Bono G F，Simo-Silva D P，Batistela M S，et al.Neurochem.Int.，2015，81:57-62

［34]Kryger G，Silman I，Sussman J L.Structure，1999，7（3）:297-307

［35]Larkin M，Blackshields G，Brown N P，et al.Bioinformatics，2007，23:2947-2948

［36]Morris G M，Goodsell D S，Halliday R S，et al.J.Comput.Chem.，1998，19（14）:1639-1662

［37]Cornell W D，Cieplak P，Bayly C I，et al.J.Am.Chem.Soc.，1995，117（19）:5179-5197

［38]Wang J，Wolf R M，Caldwell J W，et al.J.Comput.Chem.，2004，25（9）:1157-1174

［39]Bayly C I，Cieplak P，Cornell W，et al.J.Phys.Chem.，1993，97（40）:10269-10280

［40]Jorgensen W L，Chandrasekhar J，Madura J D，et al.J.Chem.Phys.，1983，79（2）:926-935

［41]Rycaert J P，Ciccotti G，Berendsen H J C.J.Comput.Phys.，1977，23:327-341

［42]York D M，Darden T A，Pedersen L G.J.Chern.Phys.，1993，99（10）:8345-8348

［43]KumariR，KumarR，OpenSource Drug Discovery Consortium，et al.J.Chem.Inf.Model.，2014，54（7）:1951-1962

［44]Saíz-Urra L，Cabrera M A，F(xiàn)roeyen M.J.Mol.Graph.Model.，2011，29（5）:726-739

［45]El-Barghouthi M I，Jaime C，Al-Sakhen N A，et al.J.Mol.Struct.THEOCHEM，2008，853（1）:45-52

［46]Fajer P，F(xiàn)ajer M，Zawrotny M，et al.Methods Enzymol.，2015，563:623-642

［47]Sa R，F(xiàn)ang L，Huang M，et al.J.Phys.Chem.A，2014，118:9113-9119

［48]Jamshidi S，Rafii-Tabar H，Jalili S.Mol.Simul.，2013，40:469-476

［49]Lobanov M Y，Bogatyreva N S，Galzitskaya O V.Mol.Biol.，2008，42（4）:623-628

［50]Hu G D，Zhu T，Zhang S L，et al.Eur.J.Med.Chem.，2010，45（1）:227-235

［51]Wu E L，Han K L，Zhang J Z H.Chem.Eur.J.，2008，14（28）:8704-8714

［52]Laskowski R A，Swindells M B.J.Chem.Inf.Model.，2011，51:2778-2786

Interaction Mechanism Between AChE and 1,7-Diazacarbazole Inhibitors Based on Molecular Dynamics Simulations

ZHAO Teng-TengYANG Xue-Yu DONG Ke-Ke ZHU Xiao-Lei＊
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Chemical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 210009,China）

The molecular docking，molecular dynamics （MD）simulation，and binding free energy analysis are used to gain the insight into the binding mechanism of three 1，7-diazacarbazole derivatives （marked as M1，M2，and M3，respectively）with AChE at the atom level.The electrostatic and van der Waals （vdW）interactions of the three inhibitors with AChE are analyzed and discussed.The ranking of the computed binding free energies based on MM-PBSA method is consistent with the ranking of experimental bioactivities for the three inhibitors.The hydrogen-bond interactions of the inhibitors with S286 are favorable to the binding affinity of inhibitors to AChE.The van der Waals interactions，especially the key contacts with W279 and Y334 have larger contributions to the binding free energy and play an important role in distinguishing the bioactivities of M1（or M2）and M3.

Alzheimer′s disease;AChE;1，7-diazacarbazole inhibitor;molecular dynamics simulation;MM-PBSA

A

1001-4861（2017）11-2065-10

10.11862/CJIC.2017.250

2017-08-31。收修改稿日期:2017-09-27。

國家自然科學(xué)基金（No.21276122）和國家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃培育項(xiàng)目（No.91434109）資助。

＊通信聯(lián)系人。E-mail:xlzhu@njtech.edu.cn