崔文霞，陳 睿，張峰華，崔忠華，李勤凡

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，陜西臨潼 710600)

魚腥草內(nèi)生真菌多樣性分析

崔文霞1，陳 睿1，張峰華1，崔忠華2，李勤凡1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，陜西臨潼 710600)

為探索魚腥草(HouttuyniacordataThunb)內(nèi)生真菌類群組成及多樣性，采用組織分離法對(duì)不同季節(jié)、不同部位的魚腥草內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，以形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定，通過分離頻率、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)等分析魚腥草內(nèi)生真菌的多樣性。結(jié)果表明，分離得到內(nèi)生真菌3 822 株，分屬于19 個(gè)屬，其中交鏈孢屬Alternaria和鐮孢菌屬Fusarium為優(yōu)勢(shì)菌群,分別達(dá)37.55%和18.50%；在夏季分離得到的內(nèi)生真菌最多；根中分離得到的內(nèi)生真菌Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)最大，為2.06；不同季節(jié)中魚腥草內(nèi)生真菌春季和夏季的相似性最高，為0.74；不同組織中葉與花的相似性最高，為0.83。魚腥草內(nèi)生真菌具有多樣性，不同季節(jié)和不同組織部位的魚腥草內(nèi)生真菌存在差異性。

魚腥草；內(nèi)生真菌；優(yōu)勢(shì)菌群

植物內(nèi)生真菌(Fungi endophyte)指在其生活史中某一段時(shí)期內(nèi)或整個(gè)生命時(shí)期生活于植物組織內(nèi)部，對(duì)其宿主不引起明顯疾病的一類真菌[1]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌普遍存在于目前研究的各種植物中，具有豐富的物種多樣性[2-4]。植物內(nèi)生真菌在宿主水平甚至在同一宿主不同組織之間都存在偏好性[5-6]，故研究內(nèi)生真菌多樣性對(duì)理解其與宿主的生態(tài)演化、發(fā)掘活性菌株等具有重要意義。

魚腥草(HouttuyniacordataThunb)是一種常見的中草藥，具有清熱解毒，化痰止咳和利尿涌淋等功效[7]。李光富等[8]從魚腥草中分離得到13 株內(nèi)生真菌，其中12 株內(nèi)生真菌發(fā)酵液有抑菌活性；劉正瓊[9]對(duì)魚腥草內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定及抑菌活性研究，結(jié)果表明魚腥草內(nèi)生真菌十分豐富，共分離得到127 株內(nèi)生真菌，且有26 株內(nèi)生真菌能夠同時(shí)抑制3 種以上病原菌。但有關(guān)魚腥草內(nèi)生真菌的系統(tǒng)研究還未見報(bào)道，本研究對(duì)魚腥草內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、鑒定，探究魚腥草內(nèi)生真菌的菌群多樣性，了解不同季節(jié)、不同部位魚腥草內(nèi)生真菌的組成與分布，為進(jìn)一步研究魚腥草與內(nèi)生真菌的關(guān)系以及內(nèi)生真菌資源利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

魚腥草全草樣品分別于2012年9月(秋)、2013年4月(春)和2013年6月(夏)采自陜西省西安市長安區(qū)灤鎮(zhèn)(E108.62°，N33°47′)，選擇6～10個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)采集植物樣本約10株。樣品采集后，立即放入密封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃ 保存，3 d內(nèi)完成內(nèi)生真菌的分離。

1.2 內(nèi)生真菌的分離純化

參照文獻(xiàn)[10]對(duì)魚腥草植株進(jìn)行表面消毒，并將其切成0.5 cm3大小的組織塊，接種于PDA平板，20 ℃避光培養(yǎng)7～10 d。待切口處長出菌絲，采用尖端菌絲挑取法對(duì)所分離的內(nèi)生真菌進(jìn)行反復(fù)分離純化，待純化后轉(zhuǎn)移到 PDA 斜面中保存。表面消毒效果的檢驗(yàn)采用漂洗液檢驗(yàn)法和組織印跡法。

1.3 內(nèi)生真菌種屬鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 采用點(diǎn)植法和插片法，對(duì)分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行顯微形態(tài)觀察，根據(jù)其菌絲顏色、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征進(jìn)行初步鑒定[11]。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 利用真菌DNA提取試劑盒提取DNA，以真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物，擴(kuò)增ITS保守區(qū)域[12-13]。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。將所得序列在GenBank中BLAST比對(duì)，使用MEGA 6.0 進(jìn)行序列分析，采用鄰近連接法(Neghbor-joining)1 000 次重復(fù)自展構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果確定菌株種屬。

1.4 內(nèi)生真菌多樣性分析

采用分離頻率、Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)、相似性指數(shù)分析魚腥草內(nèi)生真菌的多樣性以及分布特性[12,14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚腥草內(nèi)生真菌分離

通過從不同季節(jié)不同組織部位的3 435個(gè)魚腥草組織樣品中共分離得到內(nèi)生真菌3 822 株，其中從根分離834 株、莖1 177 株、葉1 521 株、花290 株；春季 411 株、夏季 2 782 株、秋季 629 株。經(jīng)菌株群落的培養(yǎng)特征初步劃分為116 個(gè)形態(tài)型，部分菌落照片及其主要形態(tài)特征分別見圖1和表1。

2.2 魚腥草內(nèi)生真菌分子生物學(xué)鑒定

結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和真菌5.8S rDNA-ITS序列分析，將從魚腥草組織中分離得到的內(nèi)生真菌劃分為55 個(gè)分類單元。其中，33 個(gè)鑒定到種水平，19 個(gè)到屬水平，1 個(gè)到科水平，1 個(gè)到門水平。在目的分類水平上，以叢梗孢目Moniliales為優(yōu)勢(shì)菌群，占總菌株數(shù)量的70.69%；在科的分類水平上，暗梗孢科Dematiaceae占總菌株數(shù)量的38.41%；在屬的水平上以交鏈孢屬Alternaria和鐮孢菌屬Fusarium為優(yōu)勢(shì)類群，分別占總菌株數(shù)量的37.55%和18.50%(圖2)。

圖中A為秋季的縮寫，Y、J、 G 為葉、莖和根的縮寫，1、2、3、7、8、10、17、18、19為分離出的內(nèi)生真菌 A is the abbreviation of autumn,Y,J and G are the abbreviation of leaf,stem and root,respectively. 1,2,3,7,8,10,17,18 and 19 are the serial of endophytic fungi isolated.下表同 The same below.

圖1 純化后內(nèi)生真菌Fig.1 Purified fungi isolated from Houttuynia cordata Thunb

圖2 魚腥草內(nèi)生真菌的組成Fig.2 Composition of endophytic fungi isolated from Houttuynia cordata Thunb

2.3 魚腥草內(nèi)生真菌多樣性分析

2.3.1 不同季節(jié) 由表2可知，夏季分離得到的菌株最多，為2 782 株，秋季629 株，春季411 株。從真菌種屬來看，夏季分離得到的內(nèi)生真菌類群最多，為14 個(gè)屬，春季為13 個(gè)屬，秋季最少，為9個(gè)屬。在3 個(gè)季節(jié)中，魚腥草內(nèi)生真菌中都以交鏈孢屬(Alternaria)為優(yōu)勢(shì)菌群，但夏季的分離頻率遠(yuǎn)高于其他2季。春夏的第2優(yōu)勢(shì)菌群為鐮孢菌屬(Fusarium)，分別為22.14%、19.12%，而秋季為附球菌屬(Epicoccum)，為15.90%。此外，不同季節(jié)的魚腥草也各有其特色的內(nèi)生真菌種屬，春季的筍頂孢霉屬(Acrostalagmus)、白粉寄生孢屬(Ampelomyces)和四分枝孢屬(Tetracladium)；夏季的毛殼菌屬(Chaetomium)、葉點(diǎn)霉屬(Phyllosticta)和赤霉屬(Gibberella)；秋季的聚端孢屬(Trichothecium)和木霉屬(Trichoderm)(表3)。

從Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)來看，各個(gè)季節(jié)的多樣性指數(shù)平均值為1.88，說明不同季節(jié)內(nèi)生真菌多樣性表現(xiàn)比較一致；春季的豐富度指數(shù)最高，為1.38。秋季的均勻度指數(shù)最高(表2)。

圖3 基于ITS序列由鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed with the program Neighbor-joining (NJ) based on ITS sequences

2.3.2 不同組織 從魚腥草的根部組織分離出內(nèi)生真菌834 株，隸屬于16 個(gè)屬；從莖中分離出1 177 株，隸屬于13 個(gè)屬；葉分離出1 521株，隸屬于7個(gè)屬；花中分離出290 株，隸屬于5 個(gè)屬。根中以鐮孢菌屬(Fusarium)為主，為26.98%，葉、莖、花組織中均以交鏈孢屬(Alternaria)為主，分別為45.43%、39.93%、59.66%。交鏈孢屬(Alternaria)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、鐮孢菌屬(Fusarium)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)為個(gè)體不同部位的共同菌種。同時(shí)，魚腥草中有些內(nèi)生真菌具有一定的組織專一性。只在莖中分離得到筍頂孢霉屬(Acrostalagmus)、白粉寄生孢屬(Ampelomyces)和葉點(diǎn)霉屬(Phyllosticta)；而聚端孢屬(Trichothecium)、木霉屬(Trichoderma)等只從根中分離得到(表3)。

從多樣性指數(shù)來看，魚腥草不同組織部位的多樣性指數(shù)差別較大。根中 Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)(H′=2.06)和Margalef 豐富度指數(shù)(R=1.55)最大，表明魚腥草根中內(nèi)生真菌的多樣性和豐富度最高。葉的均勻性指數(shù)最高，為0.80?；ǖ腟hannon-Wiener 多樣性指數(shù)、Margalef 豐富度指數(shù)及均勻度指數(shù)最低，分別為1.17、0.49、0.73(表2)。

表2 魚腥草內(nèi)生真菌菌群多樣性分析Table 2 Diversity indices of endophytic fungi from Houttuynia cordata Thunb

表3 不同季節(jié)和不同組織魚腥草內(nèi)生真菌菌落的組成Table 3 Composition of endophytic fungi isolated from different tissues of Houttuynia cordata Thunb in various seasons

2.4 魚腥草內(nèi)生真菌菌群的相似性分析

3個(gè)季節(jié)的相似性比較結(jié)果表明，春季和夏季的相似性最高，為0.74；春季和夏季的相似性為0.61；秋季和春季的相似性最低，為 0.55。從魚腥草組織間分布的內(nèi)生真菌菌群的相似性來看，葉子與花的相似性最高，為 0.83；莖與花的相似性最低，為 0.44。

3 討 論

本試驗(yàn)從魚腥草植株中分離得到3 822株內(nèi)生真菌，利用形態(tài)學(xué)和5.8S rDNA-ITS序列分子鑒定的方法將其鑒定為55 個(gè)分類單元，分布在3 個(gè)亞門7 個(gè)綱7 個(gè)目19 個(gè)屬，交鏈孢屬(Alternaria)和鐮孢菌屬(Fusarium)為優(yōu)勢(shì)菌群。由此可知，魚腥草中蘊(yùn)藏豐富的內(nèi)生真菌，且受組織部位、生長時(shí)間等因素的影響，有些內(nèi)生真菌表現(xiàn)為一定的宿主偏好性。根中菌株數(shù)量與屬的類別呈相反趨勢(shì)，根部適宜較多類群的菌株生長繁殖，這與白周艷等[16]報(bào)道結(jié)果一致，是因?yàn)楦H真菌在長期的適應(yīng)過程中選擇性的進(jìn)入植物體內(nèi)，而根內(nèi)真菌數(shù)較少，是由于根內(nèi)較多的細(xì)菌和放線菌對(duì)真菌有頡頏作用?；ㄖ蟹蛛x得到的內(nèi)生真菌數(shù)量及屬的類別均最少，這與花的生存時(shí)間較短有一定關(guān)系；夏季分離得到的內(nèi)生真菌數(shù)量及菌屬類別均多于春秋，較高的溫度適宜真菌生長，植物體內(nèi)的真菌不斷增殖，體外的真菌可通過自然孔口或傷口等渠道侵入到植物體內(nèi)[17]。

多樣性分析中，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)用來估算群落多樣性的高低；均勻度指數(shù)用來描述物種中個(gè)體的相對(duì)豐富度[18-19]。本試驗(yàn)中魚腥草內(nèi)生真菌多樣性水平差異適中，相近程度較好，這一定程度上表明在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，內(nèi)生真菌群與魚腥草植株形成相對(duì)穩(wěn)定的關(guān)系。目前國內(nèi)外還未見關(guān)于魚腥草內(nèi)生真菌多樣性的研究，故無法與其他地區(qū)魚腥草多樣性指數(shù)對(duì)比。為更好地研究魚腥草內(nèi)生真菌種群多樣性，有必要采集更多不同地區(qū)的樣品，獲得更多可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌，其結(jié)果可為今后深入探討不同地域魚腥草內(nèi)生真菌多樣性提供理論依據(jù)，也為進(jìn)一步闡明魚腥草與內(nèi)生真菌相互關(guān)系、發(fā)掘活性菌株奠定基礎(chǔ)。

Reference：

[1]周永強(qiáng),程玉鵬,劉丹丹,等.藥用植物內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的活性研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(3):158-161.

ZHOU Y Q,CHENG Y P,LIU D D,etal.Research on activities of medicinal plant endophytic fungi metabolites[J].InformationonTraditionalChineseMedicine,2014,31(3):158-161(in Chinese with English abstract).

[2]NASCIMENTO T L,OKI Y,LIMA D M M,etal.Biodiversity of endophytic fungi in different leaf ages of Calotropis procera and their antimicrobial activity[J].FungalEcology,2015,14:79-86.

[3]GAZIS R,CHAVERRI P.Diversity of fungal endophytes in leaves and stems of wild rubber trees(Heveabrasiliensis) in Peru[J].FungalEcology,2010,3(3):240-254.

[4]ZHOU S L,YAN S Z,LIU Q S,etal.Diversity of endophytic fungi associated with the foliar tissue of a hemi-parasitic plantMacrosolencochinchinensis[J].CurrentMicrobiology,2015,70(1):58-66.

[5]SANDBERG D,BATTISTA L,AMOLD E.Fungal endophytes of aquatic macrophytes:diverse host generalists characterized by tissue preferences and geographic structure[J].MicrobialEcology,2014,67(4):735-747.

[6]ZHENG J H,KANG J C,LEI B X,etal.Diversity of endophytic fungi associated withGinkgobiloba[J].Mycosystema,2013,32(4):671-681.

[7]李秀清.中藥魚腥草的現(xiàn)代藥理研究[J].黑龍江醫(yī)藥,2014,27(4):865-868.

LI X Q.Modern pharmacological studies ofHouttuyniacordataThunb[J].HeilongjiangMedicalJournal,2014,27(4):865-868 (in Chinese).

[8]李光富,路華方,李雪玲.魚腥草內(nèi)生真菌的分離,鑒定及抑菌活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(28):13784-13786.

LI G F,LU H F,LI X L.Isolation,identification and the antibacterial activity of endophytic fungi fromHouttuyniacordataThunb[J].JournalofAnhuiAgriculturalScience,2012,40(28):13784-13786 (in Chinese with English abstract).

[9]劉正瓊.魚腥草內(nèi)生真菌分離及其活性研究[D].四川雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

LIU ZH Q.The study on the isolation and the antifungal activity of endophytic fungi fromHouttuyniaThunb[D].Ya’an Sichuan:Sichuan Agricultural University,2012 (in Chinese with English abstract).

[10]侯曉強(qiáng),付亞娟,袁建平,等.大花杓蘭內(nèi)生真菌多樣性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,54(6):1357-1360.

HOU X Q,FU Y J,YUAN J P,etal.Diversity of endophytic fungi inCypripediummacranthum[J].HubeiAgriculturalSciences,2015,54(6):1357-1360 (Chinese with English abstract).

[11]魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1979.

WEI J CH,Fungi Identification Handbook [M].Shanghai:Shanghai Science and Technology Publishing House,1979 (in Chinese).

[12]周雯娜,吳遠(yuǎn)雙,初 龍,等.云南大圍山四種苔蘚植物內(nèi)生真菌多樣性[J].微生物學(xué)報(bào),2015,55(6):764 -771.

ZHOU W N,WU Y SH,CHU L,etal.Endophytic fungal diversity of four bryophyte species in Dawei Mountain,Southwest of China [J].ActaMicrobiologicaSinica,2015,55(6):764-771(in Chinese with English abstract)

[13]DOUANLA-MELI C,LANGER E,TALONTSI M F.Fungal endophyte diversity and community patterns in healthy and yellowing leaves ofCitruslimon[J].FungalEcology,2013,6(3):212-222.

[14]HUANG W Y,CAI Y Z,HYDE K D,etal.Biodiversity of endophytic fungi associated with 29 traditional Chinese medicinal plants fungal[J].FungalDiversity,2008,33(61):61-75.

[15]曹丹丹,路 浩,李小蒙,等.莖直黃芪內(nèi)生真菌分離鑒定及其多樣性分析[J].草地學(xué)報(bào),2015(6):1252-1258.

CAO D D,LU H,LI X M,etal.Isolation,identification and diversity analysis of fungal endophyte inAstragalusstrictus[J].ActaAgrestiaSinica,2015(6):1252-1258(in Chinese with English abstract).

[16]白周艷,王曉煒,馬 榮,等.新疆杏樹內(nèi)生真菌多樣性分析[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,34(4):321-327．

BAI ZH Y,WANG X W,MA R,etal.Analysis on diversity of endophytic fungi from apricot(ArmeniacaMill.) in Xinjiang[J].JournalofXinjiangAgriculturalUniversity,2011,34(4):321-327(in Chinese with English abstract)．

[17]曹晉靜,康冀川,何 勁,等.喜樹根際和內(nèi)生真菌多樣性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(5):2002-2004.

CAO J J,KANG J CH,HE J,etal.Study on the diversity of the rhizosphere fungi and the endophytic fungi ofCamptothecaacuminataDecne[J].JournalofAnhuiAgriculturalSiences,2009,37(5):2002-2004(in Chinese with English abstract).

[18]路 浩,李國中,楊曉雯,等.甘肅棘豆內(nèi)生真菌種群多樣性[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2014,34(7):1094-1099.

LU H,LI G ZH,YANG X W,etal.Diversity of endophytic fungi fromOxytropiskansuensis[J].ChineseJournalofVeterinaryScience,2014,34(7):1094-1099 (in Chinese with English abstract).

[19]VAZA B M,FONTENLA S,ROCHA F S.Fungal endophyte β-diversity associated with Myrtaceae species in an Andean Patagonian forest (Argentina) and an Atlantic forest (Brazil)[J].FungalEcology,2014,8:28-36.

DiversityofEndophyticFungiinHouttuyniacordataThunb

CUI Wenxia1,CHEN Rui1,ZHANG Fenghua1,CUI Zhonghua2and LI Qinfan1

(1.College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China;2.Animal Disease Prevention and Control Center,Lintong Shaanxi 710600,China)

The composition and diversity of endophytic fungal taxa inHouttuyniacordataThunb was analyzed. Endophytic fungi from different seasons (autumn,spring and summer) and different parts (root,stem,flower and leaf) ofHouttuyniacordataThunb were isolated by tissue expand method. Strains were classified by morphology and similarity of internal transcribed spacer (ITS) sequence. Composition,diversity of endophytic fungal community were analyzed by the isolation rate(IR),isolation frequency(IF),Shannon-Wiener biodiversity index (H′) and Margalef richness index(R).3 822 strains fromHouttuyniacordataThunb were divided into 19 genera,55 species,of whichAlternariaandFusariumwere predominant,respectively accounting for 37.55% and 18.50% of the total. The endophytic fungi of summer were the most among the 3822 strains. The Shannon-Wiener biodiversity index associated with roots was the highest (H′=2.06). The highest Sorensen coefficient was detected in spring and summer(Cs=0.74). Among the different tissues,the highest Sorensen coefficient was in leaf and flower(Cs=0.83).The endophytic fungi inHouttuyniacordataThunb have abundant diversity. Meanwhile,there were some notable differences between distribution and composition of the endophytic fungi isolated from different seasons and different parts ofHouttuyniacordataThunb.

HouttuyniacordataThunb; Endophytic fungi; Dominant population

2016-06-28

2016-08-30

CUI Wenxia,female,master student. Research area: animal clinical diseases. E-mail:572038273@qq.com

S567.23+9

A

1004-1389(2017)10-1513-07

日期：2017-10-18

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171018.1733.025.html

2016-06-28

2016-08-30

崔文霞，女，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物臨床疾病。E-mail:572038273@qq.com

李勤凡，男，副教授,碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物臨床疾病。E-mail:liqf1131@163.com

CorrespondingauthorLI Qinfan,male,asociate professor,master supervisor. Research area: animal clinical diseases.E-mail: liqf1131@163.com

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsibleeditor:GUYulan)