田小曼，李朝紅

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西漢中 723002)

蕎麥派倫霉葉斑病病原學(xué)研究

田小曼1，李朝紅2

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西漢中 723002)

2015年，在陜西榆林地區(qū)發(fā)現(xiàn)一種新的蕎麥葉部病害，發(fā)病葉片上出現(xiàn)壞死斑，中間淺褐色，邊緣褐色，外圍有褪綠暈圈，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)葉片枯死。為明確引起該病害的病原菌種類，采用組織分離法分離和純化得到真菌分離物。通過柯赫氏法驗(yàn)證、形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列分析(GenBank注冊(cè)號(hào)：LC208725.1)，確定該病害病原菌為蕎麥派倫霉葉斑病菌(Peyronellaeacalorpreferensi,又名Didymellaheteroderae)。這是派倫霉所致蕎麥葉斑病在中國(guó)的首次報(bào)道。

蕎麥；派倫霉屬；形態(tài)特征；分子鑒定

蕎麥?zhǔn)寝た?Polygonaceae) 蕎麥屬(Fagpyrum)作物, 有苦蕎(F.tataricum)和甜蕎(F.esculentum) 2 個(gè)栽培種，起源于中國(guó)，具有生長(zhǎng)期短、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)[1]。蕎麥?zhǔn)且环N醫(yī)食同源的食物，除含有蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、礦質(zhì)元素和維生素外，還含有豐富的蘆丁，不僅能降血脂、降血糖、降膽固醇，而且對(duì)防治糖尿病等也有一定療效，已成為 21 世紀(jì)人類的綠色食品之一[2-3]。中國(guó)是世界上蕎麥栽培面積最大的國(guó)家，每年種植面積達(dá)70萬hm2，總產(chǎn)量0.735億kg，蕎麥主栽區(qū)為中國(guó)東北、華北、西北和西南(云、貴、川)一帶的高寒山區(qū)或丘陵地區(qū)，管理粗放，品種混雜，使得蕎麥病害的種類日趨增多且危害程度日趨嚴(yán)重[4]。

2015年進(jìn)行的病害調(diào)查中，在陜西榆林蕎麥種植區(qū)發(fā)現(xiàn)一種葉部病害，不同于常見的葉斑病、輪紋病和褐斑病，病害發(fā)展迅速，可導(dǎo)致大面積蕎麥發(fā)病葉片干枯死亡，嚴(yán)重影響蕎麥生產(chǎn)。本文采用形態(tài)學(xué)觀察、系統(tǒng)發(fā)育分析及致病性測(cè)定，明確該病害的病原菌種類，為正確診斷和及時(shí)有效防治該病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集和病原菌的分離與純化

2015年7月在陜西省榆林市蕎麥種植區(qū)采集典型發(fā)病的蕎麥病葉，品種為‘西農(nóng)9920’，采用組織分離法分離和純化病原菌[5]。選取蕎麥病葉病健交界處剪成4 mm2左右的組織塊，進(jìn)行表面消毒(φ=70%酒精浸泡1 min，1 g/mL NaClO消毒3 min，滅菌水沖洗3次)；然后將消毒過的病組織置于PDA平板上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落邊緣的少量菌絲于PDA上進(jìn)行純化培養(yǎng)，進(jìn)一步經(jīng)單孢分離獲得病原菌的純培養(yǎng)物。

1.2 致病性測(cè)定

致病性測(cè)定在四葉期的蕎麥幼苗上進(jìn)行，品種為‘西農(nóng)9920’。將在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng) 5 d 的菌落用無菌水洗下來，用4層無菌紗布過濾，并將濾液制成105～106CFU/mL的孢子懸浮液，加入φ=0.1% 的Tween 80。對(duì)照用含φ=0.1% Tween 80的無菌水。采用刺傷和噴霧法進(jìn)行接種，刺傷法用滅菌針頭輕輕扎破表皮后，每個(gè)傷口接種5 μL孢子懸浮液，對(duì)照用針刺后在傷口接 5 μL 含φ=0.1% Tween 80的無菌水；噴霧法將孢子懸浮液用噴霧器均勻噴灑到植株表面，以無菌水接種的為對(duì)照。每個(gè)處理接種10株，接種后保濕24 h后，植株置溫室培養(yǎng)[(25 ± 1)℃，16 h 光照]，定期觀察發(fā)病情況。待葉片上長(zhǎng)出病斑后，重新分離病原菌，進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.3 病原菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀觀察

將致病性接種試驗(yàn)確證的病原菌在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)后，用滅菌打孔器(直徑0.5 cm)打取菌餅接于新配置的PDA平板和燕麥培養(yǎng)基(50 g燕麥片加水1 L，在沸水浴上加熱1 h，紗布過濾后加水補(bǔ)足1 000 mL，加15～18 g瓊脂粉，分裝后121 ℃滅菌30 min)，于25 ℃黑暗/光照培養(yǎng)3 d 后每天觀察菌落形態(tài)及培養(yǎng)性狀， 用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，計(jì)算生長(zhǎng)速率。待培養(yǎng)基中長(zhǎng)出黑色小顆粒后，在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子器和分生孢子的形態(tài)、大小，分生孢子的隔膜有無及數(shù)目、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征并顯微拍照。每個(gè)處理接種6個(gè)培養(yǎng)皿。

1.4 病原菌的分子鑒定

1.4.1 基因組DNA提取 取菌株YLQM05菌塊接于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，在25 ℃、120 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)3～4 d，過濾收集菌絲體，采用CTAB法提取DNA[6]。

1.4.2 rDNA-ITS序列的PCR擴(kuò)增 利用通用引物ITS1 和 ITS4[7]擴(kuò)增核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)。引物序列為：上游引物 ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和下游引物ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGAGATATGC-3′。PCR產(chǎn)物用TaKaRa 瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒回收純化，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以DNA Maker DL2000為對(duì)照檢測(cè)產(chǎn)物片段大小。

1.4.3 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得的菌株序列在NCBI網(wǎng)站上利用BLAST比對(duì)分析，在GenBank中查找相關(guān)序列，獲取目標(biāo)菌株信息并下載相關(guān)序列。本研究所下載序列選擇衍生模式培養(yǎng)菌株或標(biāo)準(zhǔn)菌株。將下載的序列和目標(biāo)菌株序列整理，應(yīng)用Clustal X(1.83)軟件進(jìn)行比對(duì)分析，由BioEdit 5.0.9.1進(jìn)行修正，然后利用軟件MEGA 6.06鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

蕎麥葉斑病主要為害葉片，發(fā)病率可達(dá)60%，嚴(yán)重田塊可達(dá)100%。發(fā)病初期，葉片上出現(xiàn)中央灰白，外圍紫紅色的壞死斑，后期發(fā)展為大小不一的近圓形輪紋狀病斑，病斑邊緣不明顯，病斑中央淺褐色，四周褐色，外圍有褪綠暈圈，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)病斑融合，葉片黃化枯死(圖1)。后期病斑上生出黑色小粒點(diǎn)，即病原菌分生孢子器。經(jīng)病原菌分離和純化，從具有典型癥狀的病葉組織上獲得一株真菌(編號(hào)YLQM05)。

2.2 對(duì)蕎麥的致病性測(cè)定

在蕎麥四葉期采用刺傷和噴霧法進(jìn)行接種，刺傷接種的植株發(fā)病快且嚴(yán)重，接種5 d后在針刺接種處發(fā)現(xiàn)灰色壞死斑，外圍有褪綠暈圈，10 d后病斑表面有少量小黑點(diǎn)，為病原菌的分生孢子器(圖2)。噴霧接種的植物發(fā)病緩慢，僅在葉片表面形成少量壞死斑，未接種病原菌的對(duì)照未發(fā)病。對(duì)發(fā)病的葉片用組織分離法重新分離獲得病原菌，且與田間采集病葉上分離的病原菌形態(tài)一致。證明分離的病原菌對(duì)蕎麥具有致病性。

A.發(fā)病田塊 Diseased field；B.單個(gè)葉片 Single leaf

A.針刺接種 Needle-prick wounding inoculation；B.噴霧接種 Spray inoculation；C.針刺接種對(duì)照 Needle-prick wounding control

2.3 病原菌的分離與形態(tài)觀察

從蕎麥葉斑病病部分離的真菌分離物，在PDA平板25 ℃黑暗條件下，3 d菌落直徑為4.0 cm。菌落呈圓形，前3 d的時(shí)候菌落為白色，第4天起菌落變成灰黑色，中間有小黑點(diǎn)，為病原菌的分生孢子器。病原菌在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)不受光照的影響，都能產(chǎn)生分生孢子器(圖3-A)，而在燕麥培養(yǎng)基上，黑暗條件下可以產(chǎn)生少量的分生孢子器(圖3-B)，光照條件下基本不產(chǎn)生(圖3-C)。在PDA培養(yǎng)基上第10天，菌落呈黑褐色，基部有大量的小黑點(diǎn)(圖3-D，3-E)。分生孢子器未成熟時(shí)呈梨形(圖3-F)，大小為(55～63) μm×(86～98) μm，成熟后近球形(圖3-G)，具孔口，直徑96～118 μm。分生孢子卵圓形至橢圓形，兩端鈍圓，無色，單胞，有兩個(gè)油點(diǎn)4.7(4.1～5.5) μm×2.8 (2.5～3.4) μm (圖3-H)。

A.PDA上菌落形態(tài)(5 d) Colony on PDA (5 days)；B.OM上菌落形態(tài)(黑暗5 d) Colony on oatmeal agar (dark 5 days)； C.OM上菌落形態(tài)(5 d光照) Colony on oatmeal agar (light 5 days)；D, E.PDA上分生孢子團(tuán)(10 d) Conidial masses formed on PDA (10 days)；F.未成熟的分生孢子器 Immature pycnidium；G.成熟的分生孢子器 Mature pycnidium; H.分生孢子 Conidia;標(biāo)尺：F, G=50 μm, H=5 μm Bars: F,G=50 μm, H=5 μm

圖3蕎麥葉斑病病原菌形態(tài)Fig.3Morphologicalcharacteristicsofpathogen

2.4 病原菌的分子鑒定

將PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測(cè)序，GenBank中的注冊(cè)號(hào)為No. LC208725.1，利用Clustal X(1.83)、BioEdit 5.0.9.1和MEGA 6.06等軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。所選菌株均是衍生主模式或衍生等模式菌株和被廣泛承認(rèn)的各個(gè)種的標(biāo)準(zhǔn)菌株(表1)。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，供試菌株YLQM05和菌株CBS 875.97、CBS109.92及PD96/2022聚在一個(gè)大的分枝上，支持率為94%，而CBS 875.97、CBS109.92及PD96/2022是Peyronellaeacalorpreferens，說明供試菌株YLQM05為P.calorpreferens(圖4)。

圖4 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequences

種類Species菌株號(hào)Strainnumber登錄號(hào)GenBankAccessionNo.參考文獻(xiàn)ReferencesBoeremiaexiguaCBS431.74FJ427001AveskampMM(2009)[8]BoeremiaexiguaCBS101150GU237715AveskampMM(2010)[9]BoeremiaexiguaCBS569.79GU237892AveskampMM(2010)ConiothyriumglycinesCBS124141KF251211QuaedvliegW(2013)[10]PeyronellaeacalorpreferensCBS109.92*FJ426983AveskampMM(2009)PeyronellaeacalorpreferensCBS875.97GU237908AveskampMM(2010)PeyronellaeacalorpreferensPD96/2022GU237925AveskampMM(2010)PeyronellaeaobtusaCBS391.93GU237858AveskampMM(2010)PeyronellaeaobtusaCBS377.93GU237847AveskampMM(2010)PeyronellaeapinodellaCBS567.97GU237891AveskampMM(2010)PeyronellaeapinodellaCBS110.32EU167565Simon,U.K.(2009)[11]

3 討 論

通過對(duì)陜西省榆林市蕎麥種植區(qū)新發(fā)現(xiàn)的葉斑病病原菌的致病性測(cè)定、形態(tài)特征觀察、rDNA-ITS序列分析，證明該病害是由(Peyronellaeacalorpreferens)侵染引起的。該病原菌可導(dǎo)致蕎麥發(fā)病葉片干枯死亡，植物生長(zhǎng)衰弱，甚至整株植株干枯死亡，嚴(yán)重影響蕎麥生產(chǎn)。

本研究在陜西榆林發(fā)現(xiàn)的蕎麥葉部病害與蕎麥葉斑病、蕎麥褐斑病、蕎麥輪紋病癥狀相似，但病原菌形態(tài)相差較大。戴芳瀾[12]報(bào)道蕎麥葉斑病是由蕎麥葉點(diǎn)霉(Phyllostictafagopyri)引起，病斑圓形，初期褐色，從中央向外變灰色，有褐色邊緣，在此邊緣內(nèi)有一圈青灰色部分，直徑2～5 mm；分生孢子器葉面生，小，散生，埋生，無孔口，近球形，帶黑色，直徑35～40 μm；分生孢子卵形或?qū)挋E圓形，無色，無油點(diǎn)，兩端圓，(4～5) μm× (3～3.5) μm。魏景超[13]報(bào)道蕎麥褐斑病是由蕎麥尾孢(CercosporafapopyriNakaterer et Takoimato)引起，葉片病斑圓形或不規(guī)則形，邊緣深褐色，微具輪紋，病斑中央灰綠色至褐色，嚴(yán)重時(shí)病斑連成一片，呈不規(guī)則形。分生孢子梗單生或束生，分生孢子針形，直或微彎，基部平截或圓形，無色, 有1～9 個(gè)隔膜，大小為(50～150) μm×(2～4) μm。Bresadola[14]報(bào)道蕎麥輪紋病是由(AscochytafagopyriBres.)引起，主要侵害蕎麥葉片和莖稈。葉片上產(chǎn)生中間較暗淡褐色病斑，病斑呈圓錐或近圓形，直徑2～10 mm，有同心輪紋，病斑中間有黑色小點(diǎn)，即病菌的分生孢子器。莖稈受害后，病斑呈梭形，橢圓形，紅褐色。植株死后變?yōu)楹谏?，上生有黑褐色小斑。分生孢子器生在葉表面，埋生在組織里，球形，大小(88～150) μm×(88～138) μm，有孔口。分生孢子橢圓筒形，直或稍彎曲，兩端鈍，無色，大小(8.7～17.5) μm×(3.7～6.5) μm，有1個(gè)隔膜或無。本研究經(jīng)過柯赫氏法驗(yàn)證、形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列分析將該病原菌鑒定為P.calorpreferens。

Aveskamp等[8]依據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，將Phomapomorumvar.calorpreferens提升為Phomacalorpreferens種，Aveskamp等[9]依據(jù)多基因序列特征，將Phomacalorpreferens歸為Peyronellaea屬，定種為Peyronellaeacalorpreferens，并將Phomaheteroderae作為它的異名。Peyronellaeacalorpreferens最早從荷蘭的一種無名食材上分離得到，目前，該種分布于世界各地，是一種常見的土壤習(xí)居菌和植物內(nèi)生菌。Chen等[15]研究發(fā)現(xiàn)Peyronellaeacalorpreferens與Didymellaheteroderae為同一真菌，在GeneBank中以Didymellaheteroderae提交。

Boerema[16]認(rèn)為該種是種子植物的一種機(jī)會(huì)致病菌。在病原菌的致病性試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，從蕎麥葉片上分離的P.calorpreferens在針刺接種的時(shí)候發(fā)病快，產(chǎn)生葉斑癥狀，且病斑上能產(chǎn)生小黑點(diǎn)，即病原菌的分生孢子器；而無傷接種時(shí)發(fā)病緩慢，病斑上不產(chǎn)生小黑點(diǎn)，表明該菌寄生性或致病性較弱。

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PathogenofPeyronellaeaLeafSpotinBuckwheat

TIAN Xiaoman1and LI Zhaohong2

(1.Yangling Vocation and Technical College, Yangling Shaanxi 712100, China；2.Hanzhong Vocational and Technical College,Hanzhong Shaanxi 723002，China)

In 2015, a new disease of leaf spot in buckwheat was observed in Yulin, Shaanxi Province, which could cause necrosis with brown edge, and it was surrounded by pale green ring. The heavy diseased leaves turned yellow and died. The pathogen strain was isolated and purified by tissue isolation method. Based on morphological observation, sequence analysis of rDNA-ITS(GenBank Accession No. LC208725.1), and Koch’s postulate, the pathogen was identified asPeyronellaeacalorpreferensi, also namedDidymellaheteroderae.P.calorpreferensi infecting buckwheat was reported first time in China.

Buckwheat;Peyronellaeacalorpreferensi; Morphological characters; Molecular identification

2016-09-30

2017-03-24

TIAN Xiaoman,female, associate professor.Research area:plant protection.E-mail:yltxiaoman@163.com

S435.17

A

1004-1389(2017)10-1544-06

日期：2017-10-18

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171018.1733.036.html

2016-09-30

2017-03-24

田小曼，女，副教授，從事植物保護(hù)方面的研究。E-mail：yltxiaoman@163.com

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsibleeditor:GUOBaishou)