石一飛，陳巧青，徐永進，李 思，汪財生，張慧恩

（浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江寧波 315000）

超臨界流體CO2萃取浙貝母花生物堿的工藝研究

石一飛，陳巧青，徐永進，李 思，汪財生，張慧恩

（浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江寧波 315000）

通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化，建立了浙貝母花生物堿超臨界萃取的工藝參數(shù)，確定了最佳萃取工藝條件。結(jié)果表明，生物堿超臨界萃取的最佳工藝條件為萃取溫度70 ℃，萃取壓力35 MPa，萃取時間50 min，夾帶劑流速0.15 mL/min，在此條件下總生物堿的理論提取率為3.52±0.15 mg/g。

貝母花；生物堿；超臨界萃??；正交試驗

（College of Biological and Environmental Science， Zhejiang Wanli University， Ningbo， Zhejiang 315000， China）

浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.） 是多年生百合科貝母屬植物，主要分布在浙江、江蘇、安徽等地，是一種常用的藥用植物，《中國藥典》記載功能與主治為清熱化痰止咳、解毒散結(jié)消癰，用于風熱咳嗽、痰火咳嗽、肺癰、乳癰、瘰疬、瘡毒等。其藥用部分主要是地下鱗莖[1-3]。目前，浙貝母的栽培地區(qū)主要在浙江鄞州，貝農(nóng)在種植過程中為了促進地下鱗莖生長，通常在貝母花期將花和花蕾摘除，由于利用方式有限，大量浙貝母花被丟棄。而現(xiàn)在許多研究表明，浙貝母花中含有大量與地下鱗莖相似的有效成分，特別是鱗莖中的功效成分生物堿，在浙貝母花中也含量豐富。因此，浙貝母花是亟待開發(fā)利用的藥用資源。

超臨界萃取技術(shù)目前已廣泛應用于中草藥及天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域，通常以超臨界CO2為媒介。處于臨界狀態(tài)的CO2，具有液體和氣體的雙重優(yōu)點，既具有液體對物料的高滲透性和溶解能力，又具有氣體的高擴散性和低黏度，而且在提取物中無溶劑殘留，有機溶劑使用量少。根據(jù)CO2分子的特性，其作為超臨界萃取溶劑極性小，依照“相似相溶”原理，特別適用于萃取小極性化合物。而在常規(guī)浙貝母生物堿的提取過程中，使用親脂性有機溶劑提取。目前，已有許多關(guān)于超臨界CO2應用于中藥中生物堿的萃取[4-7]。因此，超臨界CO2非常適用于提取浙貝母生物堿。試驗利用超臨界CO2萃取浙貝母花中的生物堿物質(zhì)，旨在為浙貝母花活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究和資源的進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與儀器

浙貝母花，采自寧波市鄞江鎮(zhèn)，由浙江萬里學院周旭章鑒定，為浙貝母的花；浙貝甲素，阿拉丁試劑Lot#J1422097；甲醇、乙醇、氯仿、氫氧化鈉、二氧化碳，均為分析純；溴百里香酚藍（0.3 g溴百里香酚藍，溶于5 mL，1 mol/L NaOH溶液中加水稀釋至1 000 mL，定容后搖勻），pH值5.0的緩沖液（50 mL的0.2 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀與23.66 mL的0.2 mol/L NaOH溶液混合，搖勻）。

SFE-2型超臨界CO2萃取儀，美國Applied Separations公司產(chǎn)品；M20 IKA-WERKE型精細研磨機；BSA124S型天平，賽多利斯科學儀器有限公司產(chǎn)品；UV-2400型紫外可見分光光度計；5810R型離心機，德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

2 試驗方法

將新鮮貝母花置于-80 ℃超低溫冰箱中，完全凍結(jié)后取出，置于冷凍干燥設(shè)備中，干燥條件為溫度-50 ℃，干燥時間48 h。將干燥的貝母花粉碎，過60目篩，待用。

取20.0 mg浙貝甲素放置在100 mL容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，得到0.2 mg/mL的對照品溶液。分別吸取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL，加入1 mL pH值5.0緩沖液和0.4 mL溴百里香酚藍顯色劑搖勻，再加氯仿定容至5 mL，取下層清液，在紫外可見分光光度計415 nm處，以氯仿作為空白對照，測吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程：

Y=5.930 2X+0.025，R2=0.999 6.

準確稱取2.0 g貝母花粉末，加入萃取釜中，通入CO2并設(shè)定萃取溫度。待萃取溫度穩(wěn)定后，通入夾帶劑并設(shè)定流速，將萃取壓力升高至試驗設(shè)定值，開始靜態(tài)萃取。靜態(tài)萃取10 min后，開始動態(tài)萃取，打開減壓閥，攜帶有萃取物的超臨界流體通過減壓閥后節(jié)流膨脹，釋放出萃取物后變?yōu)槌篊O2氣體，放空流速由浮子流量計測量，流速保持在5 L/min，萃取完畢后，將萃取物用甲醇溶解，定容至25 mL，測定浙貝甲素的質(zhì)量濃度，根據(jù)下式計算浙貝素甲提取率：

式中：C——浙貝甲素質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——萃取物定容后體積，mL；

m——貝母花質(zhì)量，g。

選擇影響貝母花生物堿提取率的4個因素及設(shè)置為萃取溫度（40，50，60，70，80 ℃）、萃取壓力（15， 20， 25， 30， 35 MPa）、 萃取時間 （10， 20，30， 40， 50 min）、 夾帶劑流速 （0.05， 0.10， 0.15，0.20，0.25 mL/min），在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計，進行方差分析，優(yōu)化生物堿的超臨界萃取條件。

3 結(jié)果與討論

在萃取壓力25 MPa，萃取時間30 min，CO2流速保持在5 L/min的條件下，考查萃取溫度對生物堿提取率的影響。

萃取溫度對生物堿提取率的影響見圖1。

圖1 萃取溫度對生物堿提取率的影響

由圖1可知，當萃取溫度在40～60 ℃時，生物堿提取率有顯著提高，并在60 ℃達到最高，繼續(xù)提高溫度，生物堿的提取率有明顯下降的趨勢。這可能是因為溫度的增加使CO2的擴散性增加，有利于生物堿的溶解；但另一方面溫度過高會使雜質(zhì)的溶出量增加，影響生物堿的溶出，提取率反而下降。故選擇萃取溫度為50～80 ℃。

在萃取溫度40 ℃，萃取時間30 min，CO2流速保持在5 L/min的條件下，考查萃取壓力對生物堿提取率的影響。

萃取壓力對生物堿提取率的影響見圖2。

圖2 萃取壓力對生物堿提取率的影響

由圖2可知，在25 MPa前隨著萃取壓力的升高，生物堿提取率有一定提高，之后緩慢下降。這可能是因為萃取壓力過高使物料之間的空隙過于緊密，不利于CO2的擴散和傳質(zhì)，導致生物堿提取率下降。故選擇萃取壓力為20～35 MPa。

在萃取壓力25 MPa，萃取溫度40 ℃，CO2流速保持在5 L/min的條件下，考查萃取時間對生物堿提取率的影響。

萃取時間對生物堿提取率的影響見圖3。

由圖3可知，在30 min內(nèi)生物堿提取率隨萃取時間迅速提高，之后隨萃取時間的延長，提取率略有下降。這可能是因為在動態(tài)萃取過程中，CO2在長時間的放空氣化時會帶走極少量的生物堿。綜合考慮，選擇萃取時間為20～50 min。

夾帶劑流速對生物堿提取率的影響見圖4。

圖3 萃取時間對生物堿提取率的影響

圖4 夾帶劑流速對生物堿提取率的影響

在貝母中存在的生物堿當萃取溫度和萃取壓力及萃取時間不變的情況下，改變夾帶劑流速，夾帶劑流速在0.05～0.20 mL/min時，隨著夾帶劑流速的增加，總生物堿的提取率呈上升的趨勢；當夾帶劑流速超過0.20 mL/min時，提取率基本不變。這可能是因為樣品中的生物堿都已被提取出來了。夾帶劑流速選擇在0.10～0.20 mL/min較為合適。

浙貝母花中總生物堿的提取正交試驗選擇萃取壓力（A）、萃取時間（B）、萃取溫度（C）、夾帶劑流速（D） 4個因素為變量，在單因素試驗基礎(chǔ)上進行正交試驗，采用四因素四水平的正交試驗對工藝進行優(yōu)化。

正交試驗參數(shù)見表1，生物堿超臨界萃取正交試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗參數(shù)

由正交試驗結(jié)果來看，各因素對試驗結(jié)果的主次影響關(guān)系依次為萃取壓力＞萃取溫度＞萃取時間＞夾帶劑流速。其中，萃取壓力的F值大于F0.05，說明萃取壓力對試驗結(jié)果有顯著影響。以萃取壓力35 MPa，萃取溫度70 ℃，萃取時間50 min，夾帶劑流速0.15 mL/min為最佳組合。

取2.0 g貝母花，按照正交試驗得到的最佳條件進行萃取，3次重復驗證試驗，測得生物堿的提取率為3.52±0.15 mg/g。驗證工藝數(shù)據(jù)與正交條件吻合，該工藝確實可行。

表2 生物堿超臨界萃取正交試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

表3 方差分析

4 結(jié)論

目前，超臨界CO2萃取技術(shù)以其綠色、環(huán)保、高效等特點，已廣泛應用于中藥材領(lǐng)域，是提取活性成分的重要手段。浙貝母花是中藥種植過程中的副產(chǎn)物，通過超臨界CO2萃取技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)資源的充分利用。運用正交試驗選擇最佳工藝條件，可以得到較為合理可靠的結(jié)果，可以大大減少試驗次數(shù)，研究確定了超臨界CO2萃取最佳工藝為萃取壓力35 MPa，萃取溫度70 ℃，萃取時間50 min，夾帶劑流速0.15 mL/min，在此條件下生物堿的提取率為3.52±0.15 mg/g。

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TQ464.4

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.10.010

1671-9646（2017） 10a-0034-03

2017-09-18

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201610876026）。

石一飛（1996— ），男，本科，研究方向為食品科學工程。