牛雯穎，李詩暢，袁茵，鄧思瑤，黃雅晨，肖洪彬

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

實驗研究

丹參飲對兩種血瘀模型大鼠紅細(xì)胞膜組分的影響

牛雯穎，李詩暢，袁茵，鄧思瑤，黃雅晨，肖洪彬*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：觀察丹參飲對兩種血瘀模型大鼠的作用，從紅細(xì)胞膜組分入手探討其改善血瘀證的作用機理。方法：寒凝血瘀實驗選取Wistar大鼠，隨機分為空白組、寒凝血瘀模型組、丹參飲高、低劑量組，每組10只。除空白組外，其他各組復(fù)制寒凝血瘀模型，給藥組每日給藥1次，連續(xù)造模14 d。第15 d大鼠皮下注射鹽酸腎上腺素2次，間隔4 h，兩次之間冰水浴浸泡5 min，末次造模后禁食不禁水12 h。氣虛血瘀實驗選取Wistar大鼠，隨機分為空白組、氣虛血瘀模型組、丹參飲高、低劑量組，每組10只。除空白組外，其他組復(fù)制氣虛血瘀模型，造模14 d。各組每天灌胃給藥，連續(xù)15 d。取血測定血液流變學(xué)及紅細(xì)胞膜組分相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果：對于寒凝血瘀模型組，丹參飲能夠顯著降低全血黏度(P<0.01)，升高紅細(xì)胞變形指數(shù)(P<0.01)，顯著升高巰基、唾液酸含量和SOD活力(P<0.05)。丹參飲具有顯著降低氣虛血瘀模型組低切全血黏度、血漿黏度的作用(P<0.05，P<0.01)，對紅細(xì)胞變形指數(shù)、Na+-K+-ATP酶活力具有升高作用(P<0.05，P<0.01),并可升高唾液酸、巰基含量(P<0.01，P<0.05)，顯著降低MDA及膜膽固醇含量(P<0.05)。結(jié)論：丹參飲可能是通過增加抗氧化性，減輕自由基對紅細(xì)胞攻擊程度，增加唾液酸含量從而增加紅細(xì)胞膜表面負(fù)電荷，降低紅細(xì)胞聚集性達到改善寒凝血瘀模型大鼠血液高凝狀態(tài)。此外，可能通過提高Na+-K+-ATP酶活力、膜膽固醇含量以及降低MDA含量，改善紅細(xì)胞的變形性，從而達到改善氣虛血瘀模型大鼠血瘀狀態(tài)。

丹參飲；寒凝血瘀；氣虛血瘀；血液流變學(xué)；紅細(xì)胞膜

丹參飲出自陳修園《時方歌括》，書中有云：“心腹諸痛有妙方，丹參為主義當(dāng)詳，檀砂佐使皆遵法，入咽咸知效驗彰”，該方“治心痛、胃脘諸痛多效”[1]。 丹參飲僅丹參、砂仁、檀香三味藥組成，現(xiàn)代藥理研究證明丹參飲對血小板有明顯的抑制作用[2]。臨床多加味應(yīng)用，對慢性萎縮性胃炎、胸痹、胃痛均具有良好的療效[3]。本實驗采用寒凝血瘀和氣虛血瘀兩種血瘀模型，從不同角度探討丹參飲對于兩種血瘀模型的作用機理，為血瘀證的治療提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級雄性Wistar老齡大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量(265±19)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供(動物合格證號SCXK(黑)2008004)。

1.2 藥物

丹參飲由丹參30 g、檀香5 g、砂仁5 g組成，藥液煎煮2次，具體參見文獻[4]。

1.3 儀器

LBY-N75B型血液黏度儀(北京普利生儀器有限公司)；LBY-BX型紅細(xì)胞變形儀(北京普利生儀器有限公司)；Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；蒸發(fā)光散射檢測器ELSD 2000(美國Alltech公司)；BECKMAN低溫超速離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司)；TGL-16G型高速臺式離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠)。

1.4 試劑

甲醇(色譜純，美國迪馬技術(shù)有限公司)；甲醇(分析純，西隴化工股份有限公司)；氯仿(分析純，天津市化學(xué)試劑六廠分廠)；膽固醇對照品(美國Sigma公司)；Na+-K+-ATP酶、巰基、唾液酸、SOD及MDA試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 模型制備及給藥

2.1.1 寒凝血瘀模型制備及給藥

造模方法見參考文獻[4]。40只大鼠按體質(zhì)量隨機分為4組，即丹參飲高劑量組、低劑量組、寒凝血瘀模型組和空白組。每天給藥1次，連續(xù)給藥15 d。

2.1.2 氣虛血瘀模型制備及給藥

氣虛血瘀模型制備方法見參考文獻[5]。40只大鼠按體質(zhì)量隨機分為4組，即丹參飲高劑量組、低劑量組、氣虛血瘀模型組和空白組。每天給藥1次，連續(xù)給藥15 d。

2.2 紅細(xì)胞膜的制備及指標(biāo)測定

紅細(xì)胞膜的制備方法參見本課題組前期研究成果[3-6]。LBY-N75B型血液黏度儀測定全血黏度；LBY-BX型紅細(xì)胞變形儀測定紅細(xì)胞變形性；紅細(xì)胞膜膽固醇含量、Na+-K+-ATP酶活性、唾液酸及巰基含量及SOD及MDA水平檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件處理所得數(shù)據(jù)，選用One-way ANOVA進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)的變化

丹參飲具有顯著降低寒凝血瘀模型大鼠全血黏度的作用，并能升高紅細(xì)胞變形指數(shù)(P<0.05)，結(jié)果見表1；與氣虛血瘀模型組大鼠比較，丹參飲能夠顯著降低全血黏度和血漿黏度(P<0.05，P<0.01)，升高紅細(xì)胞變形指數(shù)(P<0.05)，結(jié)果見表2。

表1 丹參飲對寒凝血瘀模型大鼠血液流變學(xué)的影響

注：與寒凝組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表2 丹參飲對氣虛血瘀模型大鼠血液流變學(xué)的影響

注：與氣虛組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 寒凝血瘀模型大鼠紅細(xì)胞膜組分變化

與空白組比較，寒凝血瘀組Na+-K+-ATP酶活力、唾液酸含量及SOD活力均顯著降低(P<0.05,P<0.01)，膜膽固醇含量升高顯著(P<0.05)；與寒凝血瘀組相比，丹參飲高劑量組可顯著升高巰基、唾液酸含量并提高SOD活力(P<0.05)，低劑量組對于唾液酸含量可顯著升高(P<0.05)。結(jié)果見表3。

3.3 氣虛血瘀模型大鼠紅細(xì)胞膜組分變化

氣虛血瘀模型組大鼠巰基、唾液酸含量以及Na+-K+-ATP酶活力與空白組比較均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，MDA含量和膜膽固醇含量均顯著升高(P<0.05)；丹參飲可顯著升高模型組巰基、唾液酸含量以及鈉鉀ATP酶活力(P<0.05，P<0.01)，顯著降低MDA含量和膜膽固醇含量(P<0.05)。結(jié)果見表4。

4 討論

丹參飲中君藥丹參的現(xiàn)代藥理研究較多，其主要成分丹參酮具有降低血黏度、抗凝、抗血栓、抗血小板黏附、改善微循環(huán)、抗氧化等多種藥理學(xué)活性。能夠促纖維蛋白溶解、改善微循環(huán)、緩解心肌缺氧缺血、縮小心肌梗死范圍[6-11]。

表3 丹參飲對寒凝血瘀模型大鼠紅細(xì)胞膜各成分的變化

注：與寒凝組比較，*P<0.05;與空白組比較，△P<0.05,▲P<0.01。

表4 丹參飲對氣虛血瘀模型大鼠紅細(xì)胞膜各成分的變化

注：與氣虛組比較，*P<0.05，**P<0.01;與空白組比較，△P<0.05,▲P<0.01。

對于寒凝血瘀模型大鼠，丹參飲可顯著降低全血黏度，升高紅細(xì)胞變形指數(shù)，在紅細(xì)胞膜分子水平上增加了唾液酸和巰基含量以及SOD活力。唾液酸攜帶負(fù)電荷，能有效防止紅細(xì)胞聚集[12]。巰基是一種膜蛋白，存在于細(xì)胞膜表面，具有保護細(xì)胞膜免遭過氧化損傷的作用。紅細(xì)胞膜蛋白巰基的氧化還原對紅細(xì)胞膜的粘彈性具有重要的影響，巰基氧化后構(gòu)象發(fā)生改變導(dǎo)致膜粘彈性增加，變形性改變[13]。丹參飲可增加巰基含量和SOD活性，都起到清除自由基，抗氧化的作用。由上述結(jié)果我們推斷，丹參飲可能是通過增加抗氧化性，使紅細(xì)胞受自由基攻擊程度減少，并且唾液酸含量的增加能夠抑制紅細(xì)胞聚集，達到改善寒凝血瘀模型大鼠血液高凝狀態(tài)。

對于氣虛血瘀模型大鼠，丹參飲可使全血黏度和血漿黏度顯著降低，紅細(xì)胞變形指數(shù)升高，在紅細(xì)胞膜分子水平上可升高Na+-K+-ATP酶活力、巰基和唾液酸的含量，降低MDA和膜膽固醇含量。Na+-K+-ATP酶活性降低，紅細(xì)胞內(nèi)K+、Na+發(fā)生變化，使紅細(xì)胞增大導(dǎo)致破裂。丹參飲對于巰基含量的增加和MDA含量的降低都有一定效果，可達到清除自由基，抗氧化的作用。由此我們推斷丹參飲可能是通過提升鈉鉀泵活力、改變巰基和唾液酸含量，使得紅細(xì)胞抵抗自由基的攻擊程度有所提升，紅細(xì)胞變形性有所改善，最終對氣虛血瘀模型大鼠有明顯改善作用。

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TheEffectofDanshenYinontheComponentsofErythrocyteMembraneinTwoKindsofBloodStasisRats

NIU Wen-ying, LI Shi-chang, YUAN Yin, DENG Si-yao, HUANG Ya-chen, XIAO Hong-bin*

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To investigate the action mechanism of Danshen Yin(DSY) for two kinds of blood stasis rats. The components of erythrocyte membrane were studied. Methods:Wistar rats were selected by the cold stagnation and blood stasis experiment, they were randomly assigned to the blank group, the model group, the DSY high-dose group, and the DSY low-dose group, with 10 rats in each group. These rats were put into ice water (0℃～1℃) every day for 8-10 minutes until the rats were frozen. The DSY was given at the same time for 14 days. On the 15thday, adrenalin hydrochloride was injected into rats for twice with 4 h interval. In blood stasis due to qi deficiency experiment, the Wistar rats were randomly assigned to the blank group, the model group, the DSY high-dose group, and the DSY low-dose group, with 10 rats in each group. These rats were made into qi deficiency and blood stasis model. The DSY was given every day for 14 days. The related indexes of hemorheology and the components of erythrocyte membrane were determined. Results: Compared to the cold stagnation and blood stasis model group, the whole blood viscosity was decreased(P<0.01), and the red blood cell deformability were increased (P<0.01) by DSY. The contents of sialic acid, hydrosulphonyl and SOD in erythrocyte membrane were increased by DSY(P<0.05). Compared to the blood stasis due to qi deficiency model group, DSY could decrease the whole blood viscosity and plasma viscosity (P<0.05,P<0.01) and increase the red blood cell deformability (P<0.05). The contents of sialic acid, hydrosulphonyl and Na+-K+-ATP in erythrocyte membrane were decreased(P<0.05,P<0.01), and the contents of MDA and CHO in erythrocyte membrane were decreased (P<0.05) by DSY. Conclusion: DSY could improve the cold stagnation and blood stasis by reducing the free radical damage on red blood cell and by increasing the contents of sialic acid to decrease aggregation of red blood cells. Therefore, the hypercoagulable state of rats with cold stagnation and blood stasis were improved. In addition, DSY could improve qi deficiency and blood stasis by increasing the enzyme activity of Na+-K+-ATP and the content of membrane cholesterolsialic, and by decreasing the content of MDA to improve the deformability of red blood cells.

Danshen Yin; Cold stagnation and blood stasis; Qi deficiency and blood stasis; Hemorheology; Erythrocyte membrane

R285.5

A

1002-2406(2017)06-0019-04

國家自然科學(xué)基金項目(No. 81473555)；黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃(UNPYSCT-2016077)；黑龍江省博士后科研啟動金資助項目(No. LBH-Q16213)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(No.81703981)

牛雯穎(1982-)，女，副研究員，主要從事中藥藥理學(xué)研究工作。

肖洪彬*(1957-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理學(xué)研究工作。

2016-10-12

修回日期：2016-11-05