丁楠，高菁，陳丹陽，張旗，王晴，聶靜，陳素娟，韓晶晶，張艷秋，馮超，李強(qiáng)

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488)

清瘟敗毒飲清熱瀉火組干預(yù)急性肺損傷的譜效關(guān)系研究

丁楠，高菁，陳丹陽，張旗，王晴，聶靜，陳素娟，韓晶晶，張艷秋，馮超，李強(qiáng)*

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488)

目的：明確清熱瀉火組干預(yù)大鼠急性肺損傷(acute lung injury,ALI)的功效成分。方法：通過拆方配伍分析及多指標(biāo)平行比較，選出清熱瀉火組進(jìn)行功效成分研究。運(yùn)用偏最小二乘回歸法，將各提取物的HPLC圖譜信息與其對應(yīng)的藥效學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行譜-效相關(guān)性分析，計(jì)算藥效貢獻(xiàn)率，篩選出貢獻(xiàn)最大的功效成分。結(jié)果：各組提取物對ALI大鼠均有一定的干預(yù)作用，以50%乙醇提取物對蛋白濃度和肺濕干比干預(yù)作用最強(qiáng)。譜-效分析西紅花苷-1藥效貢獻(xiàn)率最大。結(jié)論：西紅花苷-1可能是清瘟敗毒飲干預(yù)內(nèi)毒素性ALI大鼠的功效成分。

清瘟敗毒飲；西紅花苷-1；急性肺損傷；譜效分析

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ALI辨證屬“溫?zé)狁倍尽敝C，應(yīng)根據(jù)衛(wèi)氣營血階段的不同進(jìn)行治療，早期應(yīng)運(yùn)用清熱解毒方藥急挫熱勢[1-4]。研究表明，清瘟敗毒飲對LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI有保護(hù)作用[5-8]，但中醫(yī)復(fù)方成分復(fù)雜且藥理作用具有多向性，究其干預(yù)ALI的藥效成分及作用機(jī)理尚不清楚。本課題組前期已對清瘟敗毒飲進(jìn)行了拆方配伍分析，經(jīng)多指標(biāo)平行比較，本實(shí)驗(yàn)選擇清瘟敗毒飲的“最佳”拆方組-清熱瀉火組，并運(yùn)用偏最小二乘回歸分析法探究其液相圖譜與藥效之間的關(guān)系，以期篩選出清瘟敗毒飲干預(yù)ALI的功效成分。

1 材料

北京同仁堂藥店購買所需藥材，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定；梔子苷對照品(純度≥98%，批號110749-201316)、芒果苷對照品(純度≥98%，批號111607-201503)、蘆丁對照品(純度≥98%，批號100080-201409)和西紅花苷-1對照品(純度≥98%，批號111588-201303)(中國食品藥品檢定研究院)；大腸桿菌內(nèi)毒素(L2880，Sigma)；牛血清白蛋白(A7030，PH-7，Sigma)；地塞米松注射液(批號1507111)；考馬斯亮藍(lán)G-250(北京拜爾迪生物科技有限公司)。

清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量約200 g，合格證號為11400700036742，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。

MK3型酶標(biāo)儀(賽默飛儀器有限公司)；Effendorf5810R離心機(jī)(德國)；血液分析儀；Bx40F4型光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，日本)；AxioCam ERC5s成像系統(tǒng)(德國蔡司數(shù)碼成像系統(tǒng))；十萬分之一電子分析天平(CAP225D Sartorius)；Waters 2698 高效液相色譜儀，2998/2489檢測器。

流動相:乙腈和甲酸為色譜純(美國Thermo Fisher)、水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物制備

清熱瀉火組(生石膏30 g、知母15 g、竹葉15 g、梔子12 g)2份，分別用10倍量水、10%、30%、50%、70%、90% 乙醇回流提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮依次得到6組提取物(b1組、b2組、b3組、b4組、b5組、b6組)，含生藥量約為0.72 g/ml。

2.2 HPLC圖譜建立

2.2.1 條件

色譜柱Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫25℃；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長246 nm；流動相A為0.1%甲酸水、B為乙腈，梯度洗脫: 0～5 min(5%～7% B),5～10 min(7%～7% B),10～20 min(7%～10.6% B), 20～36 min(10.6%～14.7% B), 36～43 min(14.7%～16% B),43～44 min(16%～20% B),44～79 min(20%～56% B),79～82 min(56%～60.6% B)。

2.2.2 供試品制備

精密量取各組提取物用不同濃度甲醇水稀釋12.5倍，超聲處理10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.3 對照品制備

分別精密稱取梔子苷、芒果苷、西紅花苷-1、蘆丁對照品適量，分別用甲醇溶解定容，并過0.22 μm 微孔濾膜，即得對照品溶液。

2.2.4 樣品測定

取各供試品10 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄82 min色譜圖，見圖1，其中13、15、17和19號峰經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品指認(rèn)分別為梔子苷、芒果苷、蘆丁和西紅花苷-1，結(jié)果見圖2。

圖1 各組提取物的HPLC圖

圖2 提取物b4組的HPLC圖及對照品HPLC圖注:A.提取物b4組的HPLC圖;B.蘆丁對照品HPLC圖;C.芒果苷對照品HPLC圖;D.西紅花苷-1對照品HPLC圖;E.梔子苷對照品HPLC圖。

2.3 藥效實(shí)驗(yàn)

2.3.1 造模

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5天，隨機(jī)分9組：空白對照組(空白組)、模型組、地塞米松陽性組(陽性組)、給藥組(分別為b1組、b2組、b3組、b4組、b5組、b6組)，每組9只。給藥組：b1～b6組分別給予“2.1”項(xiàng)下提取的各組藥液，每日1次，每次10 ml/kg，共計(jì)5天。造模前1 h，給藥組再灌胃一次，陽性組注射地塞米松注射液2 mg/kg。

用水合氯醛(4 mg/kg)將大鼠麻醉，給藥組、陽性組、模型組氣管內(nèi)滴注LPS(5 mg/kg)復(fù)制ALI模型, 空白組在相同條件下，氣管內(nèi)滴注等體積的生理鹽水。造模12 h后，各組動物均取材。

2.3.2 指標(biāo)檢測

各組按造模時(shí)間，腹主動脈取血處死，剪開頸、胸部皮膚，行氣管插管。右支氣管結(jié)扎，用磷酸鹽緩沖液(PBS)6 mL 分 3 次左肺充分灌洗，收集肺泡灌洗液(BALF)4.5 ml，離心(4℃,1 300 r,10 min)。取右肺上葉，計(jì)算濕干比(W/D)；取右肺下葉，蘇木精-伊紅(Hematoxylinand Eosin,HE)染色，光鏡下觀察病理組織，如圖3；考馬斯亮藍(lán)法測定BALF中蛋白含量，結(jié)果見表2。

抑制率(%)=(1-各給藥組/LPS組)×100%

與空白組相比，模型組中蛋白濃度及肺濕干比均顯著升高(P<0.01)，造模成功。與模型組相比，各給藥組及陽性組蛋白濃度及肺濕干比均明顯下降(P<0.05)，以b4組蛋白濃度及肺濕干比抑制率最高。

2.3.3 病理形態(tài)學(xué)變化

2.3.3.1 肺部形態(tài)

空白組大鼠肺臟呈粉紅色，表面光滑，體積正常，肺表面無暗紅色出血點(diǎn)。模型組大鼠肺臟體積明顯增大，伴暗紅色出血點(diǎn)。陽性組及給藥組大鼠肺臟體積增大情況及出血點(diǎn)情況較模型組均明顯減輕，顏色偏暗或接近粉紅色。

2.3.3.2 肺組織病理切片

空白組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，大小均勻，肺泡腔清晰，肺泡間隔正常，少量炎性細(xì)胞浸潤。模型組部分肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，部分視野肺組織呈實(shí)變，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)充血、水腫，表現(xiàn)特征性病理現(xiàn)象。給藥組及陽性組LPS誘導(dǎo)的病理變化均有改善，說明該清熱瀉火組對LPS誘導(dǎo)的ALI有一定的干預(yù)作用，結(jié)果見圖3。

圖3 各組肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察( HE染色，×100)注：A.空白組;B.模型組;C.b1組;D. b2組;E. b3組;F. b4組;G.b5組;H.b6組;I.陽性組。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.5 譜效相關(guān)性分析

本實(shí)驗(yàn)藥效數(shù)據(jù)和液相圖譜數(shù)據(jù)有著不同的度量標(biāo)準(zhǔn)，即量綱不同，所以采用標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)化，以消除變量量綱差異。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理的特征圖譜中代表化學(xué)成分各峰的峰面積積分值為自變量，標(biāo)準(zhǔn)化處理后的藥效抑制率指標(biāo)作為因變量，利用METALAB7.4.0統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用偏最小二乘回歸法進(jìn)行譜-效相關(guān)性分析，計(jì)算出各自變量對應(yīng)因變量的回歸系數(shù)?；貧w系數(shù)代表各自變量對因變量的貢獻(xiàn)大小，以回歸系數(shù)進(jìn)行建模，即得回歸方程。

以各提取物對蛋白的抑制率作為因變量得到回歸方程：

Y1=(-0.174 2)X1+(-0.108 1)X2+0.172 4X3+0.061 4X4+0.057 4X5+(-0.058 2)X6+0.064 1X7+0.158 8X8+0.057 9X9+0.210 7X10+0.004 2X11+(-0.243 2)X12+0.098 8X13+0.003 9X14+

(-0.013 9)X15+(-0.158 4)X16+(-0.145)X17+(-0.030 7)X18+0.209 1X19、+0.086 7X20+0.005 8X21

以各提取物對肺濕干比的抑制率作為因變量得到回歸方程：

Y2=(-0.148 5)X1+(-0.169)X2+0.094 4X3+(-0.11)X4+(-0.020 1)X5+(-0.325 2)X6+0.142 1X7+0.140 5X8+(-0.089 7)X9+0.144 4X10+0.142 1X11+(-0.156 1)X12+0.051 9X13+0.080 4X14+0.063 5X15+(-0.094 2)X16+(-0.178 9)X17+0.112 3X18+0.277 3X19+0.057 6X20+0.143 5X21

由上可知，回歸方程是系i×Xi之和組成，由此看出X對藥效Y 的貢獻(xiàn)率取決于系數(shù)和峰面積兩個(gè)因素，所以選取與Y 正相關(guān)(系數(shù)為正值) 的峰，并以所有(+)系i×Xi之和作為分母，以各個(gè)(+)系數(shù)i×Xi作為分子，得到自變量X 對藥效Y 的貢獻(xiàn)率。由藥效指標(biāo)可看出b4組對蛋白濃度和肺濕干比干預(yù)作用最強(qiáng)，對其各組分進(jìn)行貢獻(xiàn)率計(jì)算，結(jié)果見表3。

由貢獻(xiàn)率可知，組分3，8，10，13，19對Y1的累積貢獻(xiàn)率達(dá)71.34%，以組分10，19貢獻(xiàn)最大，分別為17.69%，17.55%；組分7，8，10，11，19，21對Y2的累積貢獻(xiàn)率達(dá)68.27%，以組分19貢獻(xiàn)最大達(dá)19.12%。由“2.2.4” 項(xiàng)下的結(jié)果可知，峰13，19分別為梔子苷和西紅花苷-1。結(jié)果提示，梔子苷和西紅花苷-1可能具有抗內(nèi)毒素性急性肺損傷活性。

表1 各提取物HPLC色譜峰的峰面積

表2 BALF中蛋白濃度及肺濕干比

表3 各提取物中各組分的藥效貢獻(xiàn)率

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先采用全波長掃描檢測，考察了238、246、258、300、440 nm 5個(gè)波長，發(fā)現(xiàn)246 nm下，樣品各色譜峰分離較好，峰相對較多且響應(yīng)值較高，故以246 nm為各樣品的特征圖譜檢測波長。之后采用更為靈敏的雙波長檢測，分別對色譜柱、柱溫、流速、進(jìn)樣量、流動相及洗脫條件進(jìn)行了考察，并進(jìn)行方法學(xué)考察，最終確定為“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件。

“清熱瀉火”組包括梔子、知母、石膏、竹葉4味藥，梔子為清熱瀉火要藥，且已有研究報(bào)道梔子苷對ALI具有干預(yù)作用[9]，但其余3味藥及其相關(guān)化學(xué)成分還未見有關(guān)ALI的報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)通過多指標(biāo)平行比較，選擇了在各指標(biāo)下表現(xiàn)均良好的“清熱瀉火”組。

本實(shí)驗(yàn)通過PLSR法，將復(fù)方干預(yù)大鼠ALI的藥效與其特征圖譜進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，獲得可實(shí)現(xiàn)“藥效還原”(與原中藥效果相當(dāng))的功效成分組，并量化各成分對藥效的貢獻(xiàn)大小。除此之外，還采用多指標(biāo)平行比較，將不同指標(biāo)的藥效與其特征圖譜進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，可實(shí)現(xiàn)針對不同指標(biāo)的功效成分組。PLSR法在最終模型中包含了原有所有自變量，既使數(shù)據(jù)信息得到最大限度地應(yīng)用，又實(shí)現(xiàn)了回歸建模(多元線性回歸)、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)簡化(主成分分析)以及兩組變量之間的相關(guān)性分析(典型相關(guān)分析)[10]。該方法不僅闡明了中藥可能的活性成分及各成分之間的協(xié)同、拮抗作用，通過藥效量化，還能直觀地反映出各活性成分與藥效的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，“清熱瀉火”組不同提取物的藥效作用有所不同，以50%乙醇提取物對ALI大鼠蛋白濃度和肺濕干比干預(yù)作用最強(qiáng)。譜-效相關(guān)性分析結(jié)果顯示，“清熱瀉火”組中有15個(gè)成分與藥效正相關(guān)，初步證明這些成分對ALI起協(xié)同作用。分析各正相關(guān)成分貢獻(xiàn)率大小，可知西紅花苷-1對蛋白濃度以及肺濕干比抑制作用均較強(qiáng)；由HPLC圖譜信息可知，西紅花苷-1在50%乙醇提取物中峰的響應(yīng)值也相對其他組較高。由此可推測，西紅花苷-1可能是清瘟敗毒飲干預(yù)內(nèi)毒素性ALI大鼠的功效成分。目前，西紅花苷的藥效作用研究主要集中在抗腫瘤、抗心腦血管疾病方面[11-12]，對其抗急性肺損傷的藥理研究，值得進(jìn)一步探究、開發(fā)。

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R285.5

A

1002-2406(2017)06-0023-04

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)-雙黃連粉針劑技術(shù)改造(No.2011ZX09201-201-15)；北京中醫(yī)藥大學(xué)在讀研究生自主選題項(xiàng)目(No.2016-JYB-XS119)

丁楠(1993-)，女，碩士研究生，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及功效成分組研究工作。

李強(qiáng)*(1972-)，男，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及功效成分組研究工作。

2017-08-15

修回日期：2017-09-01