李正凱 阮雁捷 郭冠軍 張 樂 張 品

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，給人類生命健康帶來嚴(yán)重危害，臨床上外科手術(shù)是主要治療方式。胃癌根治術(shù)對患者造成很大創(chuàng)傷，術(shù)后疼痛是患者要面臨的嚴(yán)重問題，尤其是深部內(nèi)臟牽拉的疼痛感，一直是術(shù)后鎮(zhèn)痛難題[1]。同時手術(shù)對機(jī)體產(chǎn)生損傷，患者容易發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步損傷正常組織。良好的鎮(zhèn)痛方式可以有效減輕患者術(shù)后炎癥反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)，降低并發(fā)癥發(fā)生率[2]。鹽酸羥考酮是一種μ、κ受體雙重激動的半合成阿片類藥物，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有強(qiáng)效鎮(zhèn)痛作用[3]。臨床研究表明，鹽酸羥考酮對內(nèi)臟痛具有良好鎮(zhèn)痛作用，常用于內(nèi)臟手術(shù)術(shù)后鎮(zhèn)痛[4]。超前鎮(zhèn)痛是指在傷害性刺激之前采取措施對其進(jìn)行阻滯，可有效減輕傷害性刺激誘發(fā)的疼痛感。研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸羥考酮超前鎮(zhèn)痛對惡性腫瘤患者術(shù)后鎮(zhèn)痛效果良好且不良反應(yīng)小，但其在胃癌根治術(shù)中的效果報道尚少[5]。本研究通過觀察鹽酸羥考酮對大鼠胃癌根治術(shù)超前鎮(zhèn)痛效果，并初步探討其鎮(zhèn)痛機(jī)制，為臨床胃癌根治術(shù)患者圍術(shù)期鎮(zhèn)痛提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Wistar大鼠40只，SPF級，雄性，4周齡，平均體質(zhì)量(100±20)g，購自上海南方模式生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0010，使用許可證號：使用許可SYXK(滬)2018-0002。大鼠在溫度(23±2)℃，濕度(55±5)%，12 h/12 h明暗循環(huán)下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)(大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度>95%)，鹽酸羥考酮注射液(以色列RAFA LABORATORIES LIMITED公司,國藥準(zhǔn)字J20180002，1 mL∶10 mg×5支)，一氧化氮(nitric oxide，NO)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondial dehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，大鼠P物質(zhì)(substance P，SP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海滬震生物科技有限公司)，兔抗大鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)多抗、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor κB，NF-κB)p65多抗、山羊抗兔IgG-HRP(美國Abcam公司)，38450-電子觸覺測量儀、熱輻射痛閾檢測儀(意大利Ugo Basile公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠胃癌模型及分組 隨機(jī)取30只大鼠，參照文獻(xiàn)[6]，采用MNNG誘導(dǎo)大鼠胃癌模型，用5%酒精-水溶液將MNNG配成濃度為1 g/L的母液，4 ℃避光保存，使用前再稀釋成MNNG終濃度為100 μg/mL的溶液，置于避光瓶內(nèi)。造模第1天起，給予大鼠飲用濃度為100 μg/mL MNNG的水劑作為常規(guī)飲用水，飼喂正常塊狀飼料；連續(xù)飲用8周后，飼喂上述MNNG水劑配制的粉狀飼料代替之前的塊狀飼料喂養(yǎng)大鼠；24周后改用正常塊狀飼料喂養(yǎng)，隔天給予MNNG水劑；28周起停止給予MNNG水劑，改用自來水喂養(yǎng)1周。剔除造模過程中死亡大鼠2只，剩余28只隨機(jī)分為模型組9只，前給藥組9只，后給藥組10只。其余10只大鼠正常喂養(yǎng)，為對照組。

1.2.2 干預(yù)方法 開腹前30 min，對照組、模型組大鼠按0.2 mg/kg腹腔注射生理鹽水，前給藥組大鼠按0.2 mg/kg腹腔注射鹽酸羥考酮注射液。注射30 min后，模型組、前給藥組、后給藥組大鼠按4 mL/kg腹腔注射水合氯醛(10% w/v)進(jìn)行麻醉，腹部剃毛，在腹部正中切口，切除胃部病變部分，將直徑1 mm硅膠管埋入胃內(nèi)，胃前壁雙層荷包縫合結(jié)扎，腹壁戳口引出導(dǎo)管，將戳口周圍腹膜縫合固定。開腹后30 min，后給藥組大鼠按0.2 mg/kg腹腔注射鹽酸羥考酮注射液。所有手術(shù)大鼠術(shù)后按0.1 mL/只注射青霉素(80萬單位)以防感染。對照組大鼠不做手術(shù)。肉眼觀察切除的胃黏膜有無灰白色結(jié)節(jié)、隆起、糜爛、潰瘍等變化，將胃黏膜病變部分行HE染色，鏡檢觀察胃黏膜有無腸化生及異型增生等胃癌典型病理變化，剔除胃黏膜無上述變化的大鼠，模型組、前給藥組、后給藥組各剔除一只。

1.2.3 測定機(jī)械性縮足反射閾值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT) 分別于術(shù)后24、48、72 h采用電子Von Frey測量儀測定大鼠PWMT。將大鼠單獨(dú)放入底部為鐵絲網(wǎng)的透明塑料隔間內(nèi)，適應(yīng)30 min后，用測量儀的測試探針刺激大鼠兩后足底中部，至尼龍絲出現(xiàn)彎曲，緩慢加壓，不同強(qiáng)度之間間隔30 s，直到大鼠出現(xiàn)縮足反應(yīng)，每個強(qiáng)度測試5次，出現(xiàn)3次縮足反應(yīng)為止，記錄儀器顯示的讀數(shù)。每足測量3次，取平均值。

1.2.4 測定熱刺激縮足反射潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL) 分別于術(shù)后24、48、72 h測定大鼠PWTL。大鼠測完P(guān)WMT值后，將大鼠單獨(dú)放置于底部為2 mm厚有機(jī)玻璃的塑料箱中，適應(yīng)30 min后，用熱輻射痛閾檢測儀照射大鼠兩后足底部，至大鼠出現(xiàn)縮足或舔足時停止照射，記錄檢測儀上的時間，為PWTL，設(shè)定檢測儀自動切斷時間為25 s，同一部位刺激間隔時間為5 min，每只大鼠重復(fù)測量5次，去除最大值與最小值，取剩余3次平均值。

1.2.5 檢測血清NO、SP水平 末次PWTL測完后，頸椎脫臼處死大鼠，心臟采血3 mL，放入EP管，4 ℃ 4000 r/min(離心半徑12 cm)離心10 min，分離上清液后保存在-80 ℃的冰箱中。取保存血清，根據(jù)試劑盒說明書采用硝酸還原酶法檢測血清中NO濃度；SP濃度檢測采用雙抗體夾心ELISA法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測光密度(A)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品大鼠血清SP濃度。

1.2.6 檢測脊髓組織GSH-Px、SOD、MDA水平 末次PWTL測完后，頸椎脫臼處死大鼠，快速分離并取出脊髓，放入液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。取脊髓組織70 mg制備組織勻漿，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，終止反應(yīng)后在450 nm處讀取吸光度(A)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品GSH-Px、SOD、MDA的濃度。

1.2.7 檢測脊髓組織iNOS、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量 取脊髓組織80 mg于液氮中研磨，加入全細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，檢測蛋白濃度后，蛋白樣本加入上樣緩沖液，變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離等量蛋白，濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，添加iNOS、NF-κB p65一抗(1∶1 000)4 ℃封閉過夜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶4 000)，室溫孵育2 h，ECL顯影、定影、拍照，分析蛋白條帶灰度值，計算iNOS、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量(以iNOS、NF-κB p65蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值表示)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間PWMT比較

24、48、72 h PWMT組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組、前給藥組、后給藥組24、48、72 h PWMT均減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，前給藥組、后給藥組24、48、72 h PWMT均增大，且后給藥組24、48、72 h PWMT均低于前給藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組、模型組、前給藥組、后給藥組24、48、72 h PWMT隨著時間延長而增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間PWMT比較

2.2 各組大鼠不同時間PWTL比較

24、48、72 h PWTL組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組、前給藥組、后給藥組24、48、72 h PWTL均縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，前給藥組、后給藥組24、48、72 h PWTL均延長，且后給藥組24、48、72 h PWTL均長于前給藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組、模型組、前給藥組、后給藥組24、48、72 h PWTL隨著時間延長而延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 血清NO、SP水平比較

血清NO、SP濃度組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組、前給藥組、后給藥組NO、SP濃度均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，前給藥組、后給藥組NO、SP濃度均降低，且后給藥組NO、SP濃度均高于前給藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 各組大鼠不同時間PWTL比較

表3 各組大鼠血清NO、SP水平比較

2.4 脊髓組織GSH-Px、SOD、MDA水平比較

脊髓組織GSH-Px、SOD活力、MDA含量組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組、前給藥組、后給藥組GSH-Px、SOD活力均下降，MDA含量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，前給藥組、后給藥組GSH-Px、SOD活力均升高，MDA含量均下降，且后給藥組GSH-Px、SOD活力均低于前給藥組，MDA含量高于前給藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

2.5 脊髓組織iNOS、NF-κB p65蛋白水平比較

脊髓組織iNOS、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組、前給藥組、后給藥組iNOS、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，前給藥組、后給藥組iNOS、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量均降低，且后給藥組iNOS、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量高于前給藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5，圖1。

表4 各組大鼠脊髓組織GSH-Px、SOD、MDA水平比較

表5 各組大鼠脊髓組織iNOS、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

胃癌根治術(shù)創(chuàng)口和內(nèi)臟疼痛刺激胃部及腹腔組織，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起外周及中樞敏化，增強(qiáng)痛覺信號，導(dǎo)致患者痛覺閾值降低，加劇疼痛反應(yīng)[7]。因此，選擇合適的鎮(zhèn)痛藥物最大限度減輕手術(shù)創(chuàng)傷帶給患者的疼痛至關(guān)重要。目前多數(shù)研究認(rèn)為，在術(shù)前采取干預(yù)措施阻滯傷害性刺激，以減少外周及中樞敏化，提高患者痛覺閾值，從而減少或避免術(shù)后使用鎮(zhèn)痛藥物，減小氧化應(yīng)激損傷[8]。目前研究發(fā)現(xiàn)，一些鎮(zhèn)痛藥物應(yīng)用于婦科等手術(shù)超前鎮(zhèn)痛，效果良好，本實驗將鹽酸羥考酮應(yīng)用于胃癌根治術(shù)大鼠，以研究其對胃癌根治術(shù)超前鎮(zhèn)痛的效果及其作用機(jī)制[9]。

圖1 各組大鼠脊髓組織中各蛋白的表達(dá)

鹽酸羥考酮可減輕與μ受體相關(guān)的傷害性疼痛，同時κ受體興奮可減輕術(shù)后內(nèi)臟痛，且不良反應(yīng)較小，術(shù)后鎮(zhèn)痛效果良好[10]。大鼠在胃癌根治術(shù)后表現(xiàn)對機(jī)械性刺激和熱刺激痛覺過敏，與人臨床術(shù)后疼痛相似。NO在機(jī)體疼痛調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，參與傳遞脊髓水平的傷害信息，與痛覺過敏的形成和發(fā)展密切相關(guān)，抑制體內(nèi)NO生成可發(fā)揮有效鎮(zhèn)痛作用[11]。SP是一種傳遞痛覺信息的神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛參與多種疾病性疼痛的傳導(dǎo)和調(diào)制[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前給藥組及后給藥組均可降低/縮短大鼠各個時間PWMT/PWTL，降低血清中NO及SP濃度，提示鹽酸羥考酮具有顯著鎮(zhèn)痛作用，且前給藥組比后給藥組的鎮(zhèn)痛效果更好，提示鹽酸羥考酮對大鼠胃癌根治術(shù)具有超前鎮(zhèn)痛作用。研究表明，采用鹽酸羥考酮超前鎮(zhèn)痛的腹腔鏡膽囊切除術(shù)患者，術(shù)后不同時間點疼痛評分和血清炎癥因子水平顯著降低[13]。研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸羥考酮超前鎮(zhèn)痛可以有效減輕內(nèi)鏡下兒童扁桃體切除術(shù)后的疼痛[14]。由此表明，使用鹽酸羥考酮超前鎮(zhèn)痛可有效減輕患者術(shù)后疼痛，結(jié)合本研究結(jié)果，提示鹽酸羥考酮在胃癌根治術(shù)超前鎮(zhèn)痛上同樣具有應(yīng)用價值。

正常體內(nèi)氧化和過氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，手術(shù)等傷害性刺激可以導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)MDA等氧化產(chǎn)物生成增多，SOD和GSH-Px等抗氧化酶生產(chǎn)減少，造成體內(nèi)氧化和過氧化系統(tǒng)失衡，損傷細(xì)胞和組織，引發(fā)神經(jīng)疼痛[15]。Mato等[16]研究表明，在關(guān)節(jié)炎疼痛大鼠中，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)可以降低大鼠機(jī)械性異常性疼痛。研究顯示，中線剖腹手術(shù)患者術(shù)后體內(nèi)SOD1水平顯著升高，且疼痛評分顯著降低[17]。本研究前給藥組和后給藥組脊髓組織SOD、GSH-Px活力顯著升高，MDA含量顯著減少，提示鹽酸羥考酮具有抗氧化作用，且前給藥組抗氧化作用效果更顯著，表明鹽酸羥考酮對胃癌根治術(shù)后鎮(zhèn)痛作用可能與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

NF-κB以p50/p65異二聚體形式存在，在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要作用，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基可以激活NF-κB，從而誘導(dǎo)iNOS轉(zhuǎn)錄，高表達(dá)的iNOS促進(jìn)大量合成NO，進(jìn)而增加傷害性痛覺信息在脊髓的傳遞和整合，加劇患者術(shù)后疼痛反應(yīng)[18]。研究證實，抑制NF-κB/iNOS信號通路可以減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[19]。另有研究表明，NF-κB、iNOS表達(dá)水平下調(diào)，抗氧化效果明顯[20]。本研究中前給藥組和后給藥組NF-κB p65、iNOS蛋白水平顯著下降，表明鹽酸羥考酮通過抑制NF-κB/iNOS信號通路發(fā)揮抗氧化作用，同時前給藥組NF-κB p65、iNOS蛋白水平更低，表明鹽酸羥考酮發(fā)揮超前鎮(zhèn)痛作用可能是通過抑制NF-κB/iNOS信號通路，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，鹽酸羥考酮在胃癌根治術(shù)大鼠中具有超前鎮(zhèn)痛作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB/iNOS信號通路，從而減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，阻斷傷害性信息傳遞，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，為臨床胃癌根治術(shù)患者圍術(shù)期鎮(zhèn)痛提供理論參考。