樓小華，高川川，朱文靜，巴金莎，扶勝，楊梅，易重任

1貴州省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，貴州省貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路貴陽 550025；2貴州勤邦食品安全科學技術有限公司，貴州省貴陽經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)科技路1號貴陽 550009

膠體金免疫層析法快速檢測煙葉中三唑酮殘留量

樓小華1，高川川1，朱文靜1，巴金莎1，扶勝2，楊梅2，易重任2

1貴州省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，貴州省貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路貴陽 550025；2貴州勤邦食品安全科學技術有限公司，貴州省貴陽經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)科技路1號貴陽 550009

[目的]應用膠體金免疫層析技術建立一種快速檢測煙葉中三唑酮殘留量的方法。[方法]采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，并將其與抗三唑酮抗體標記制備得金標抗體。三唑酮-OVA偶聯(lián)物和殘留量羊抗鼠IgG抗體分別結合于醋酸纖維膜上，依次將樣品墊、醋酸纖維膜和吸水紙組裝，切割成膠體金試紙條。[結果]測試結果表明，三唑酮膠體金試紙條檢測煙葉中三唑酮、三唑醇殘留量的靈敏度為1mg/kg，檢測時間為5~10 min，特異性高，重復性好，與氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法符合率為98%。

膠體金免疫層析法；煙葉；農(nóng)藥殘留；三唑酮

三唑酮（Triadimefon）是一種高效、廣譜、持效期長、內(nèi)吸性三唑類低毒殺菌劑，廣泛應用于我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中玉米、高粱、煙草等農(nóng)作物銹病和白粉病的防治[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，三唑酮及其代謝產(chǎn)物三唑醇會產(chǎn)生神經(jīng)、生殖和基因毒性，并有致癌和致畸性[3-6]。GB2763—2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[7]規(guī)定了三唑酮及其代謝產(chǎn)物三唑醇在糧谷、油料、蔬菜等作物上的限量要求，因此，對三唑酮殘留量的檢測，乃至快速檢測，就具有重要意義。

目前，煙草中三唑酮的檢測方法主要有氣相色譜（GC）法[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法[10-11]等。這些方法準確性好、靈敏度高，可以同時測定多種農(nóng)藥殘留，但是所需儀器設備昂貴，且樣品的前處理復雜、繁瑣費時，無法現(xiàn)場操作，不能在煙葉工商交接時及時對樣品農(nóng)藥殘留作出評價。膠體金免疫層析技術（Colloidal Gold Immunochromatography Assay，GICA）是一種以膠體金作為標記物應用于檢測特定抗原或抗體的一種新型免疫標記技術，它是建立在膠體金標記技術、單克隆抗體技術、免疫層析技術基礎上的一種快速診斷技術。近十年來，該項技術在禽流感、家畜疫病、微生物、農(nóng)藥殘留、食品藥物殘留檢測方面開始推廣應用，檢測的對象包括激素、重金屬、抗生素、農(nóng)藥、抗病毒試劑、激動劑、毒素及過敏原等[12-17]。本研究以制備的高親和力和高特異性的三唑酮單克隆抗體為基礎，建立了煙葉中三唑酮膠體金試紙條檢測方法，并對試紙條進行了性能測試。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 農(nóng)藥純品：三唑酮固體純品，含量98.0%，購于國家標準物質(zhì)中心。

1.1.2 煙葉樣品：鮮煙葉和烤后干煙葉，采集于貴州省煙區(qū)（空白樣和含三唑酮、三唑醇殘留樣）。

1.1.3 膠體金制備材料及儀器：抗三唑酮單克隆抗體、三唑酮偶聯(lián)抗原、羊抗鼠IgG抗體，貴州勤邦食品安全科學技術有限公司自制；牛血清蛋白（BSA）、氯金酸（HAuCl4·4H2O，分析純），均由美國Sigma公司提供；甲醇、氯化鈉、檸檬酸三鈉、碳酸鉀等常規(guī)試劑，均為分析純；玻璃纖維、硝酸纖維素膜（NC膜）、樣品吸收墊、PVC底板、吸水墊、CT 300數(shù)控切條機，均由上海金標生物科技有限公司提供；XYZ3000點膜儀，由Bio-Dot公司提供；TDL-40B低速大容量離心機、TGL-20b R高速冷凍離心機，由上海安亭科學儀器廠提供；90-2磁力攪拌器，由上海振榮科學儀器有限公司提供；雙蒸去離子水，自制。

1.1.4 驗證用儀器及試劑：Thermo Scienti fi c Trace GC Ultra-TSQ Quantum XLS氣相色譜–三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，由美國ThermoFisher Scienti fi c公司提供；Labnet VX200漩渦振蕩器，由美國Labnet公司提供；Centurion K-241高速離心機，由英國Centurion公司提供；乙腈（色譜純）、甲苯（色譜純），由德國Merck公司提供；超純水：電阻率18.2MΩ，自制；QuEChERS試劑盒（試劑包A：4 g無水硫酸鎂，1 g氯化鈉，1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉；試劑包B：150 mg無水硫酸鎂和50 mg N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑），由美國Agilent公司提供。

1.2 方法

1.2.1 膠體金的制備

將氯金酸用雙蒸去離子水稀釋至質(zhì)量分數(shù)為0.01%，于磁力加熱攪拌器上攪拌煮沸后，每100 mL中加入2.5 mL 1%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)攪拌加熱至溶液呈紅色，冷卻至室溫，按體積損失補足失水，于4℃保存?zhèn)溆?，保存時間不超過半年。

1.2.2 單克隆抗體-膠體金標記物的制備

用0.2 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至7.0，將一定量自制的三唑酮單克隆抗體加入至膠體金溶液，攪拌均勻后靜置10 min；然后加入質(zhì)量分數(shù)為10%的BSA直至其質(zhì)量分數(shù)為1%，攪拌均勻后靜置10 min。4 ℃條件下12000 r/min離心40 min，小心吸去上清液，用磷酸緩沖液重新溶解沉淀，置于4 ℃冰箱中備用，保存時間不超過半年。

1.2.3 試紙條的制備與組裝

將樣品墊置于含0.3 % BSA、0.05 mol/L的磷酸緩沖液（PH7.2）中浸泡30 s，37℃干燥4 h。用噴膜儀在玻璃纖維上噴金標抗體，噴量為5 μL/cm，37℃干燥2 h。偶聯(lián)抗原三唑酮-OVA用0.02 mol/L PBS（PH7.4）稀釋至0.5 mg/mL，用噴膜儀噴于NC膜（反應膜）上，噴量為2 μL/cm，為檢測線；在檢測線上5mm處噴涂羊抗鼠IgG抗體（0.3 mg/mL），噴量為2 μL/cm為質(zhì)控線，37℃干燥2h。將樣品吸收墊、膠體金結合物釋放墊、反應膜、吸水墊依次黏貼在底板上，切割成4 mm寬的試紙條并裝入塑料卡殼中，制成檢測試紙條。該試紙條對三唑酮、三唑醇兩個目標物的交叉率為100%，即同時對以上兩個化合物均有響應。試紙條的結構見圖1。

1.2.4 試紙條結果判讀

如圖2所示，T線（檢測線）顯色比C線（質(zhì)控線）顯色深或顯色一致，均表示組織樣本中三唑酮和三唑醇藥物濃度低于檢測限，為陰性；T線顯色比C線顯色淺或T線不顯色，表示組織樣本中三唑酮和三唑醇藥物濃度等于或高于檢測限，為陽性；若未出現(xiàn)C線，則表示操作過程不正確或試紙條已變質(zhì)失效。樣品實測試紙條實物圖見圖3。

圖1 試紙條剖面結構圖Fig. 1 Pro fi le of rapid detection strip

圖2 試紙條結果示意圖Fig. 2 Schematic diagram of rapid test strip

圖3 試紙條實物圖Fig.3 Real fi gure of rapid test strip

1.2.5 試紙條檢測限實驗

取空白煙葉樣本的甲醇提取液，在其中分別添加三唑酮+三唑醇（1:1）至終濃度為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg。試紙條放平，取配制好的待測樣品60 μL加入試紙條加樣孔中，液體流動開始計時，10 min后觀察檢測結果。每個質(zhì)量濃度重復5次，根據(jù)實驗結果判斷檢測試紙的檢測限。

1.2.6 試紙條重復性實驗

根據(jù)農(nóng)醫(yī)發(fā)﹝2005﹞17號文件，膠體金免疫層析法是一種定性方法，重復性以假陽性率和假陰性率表示[18]。取不同批次的3批膠體金試紙，分別檢測陰性煙葉樣本和添加了三唑酮的陽性煙葉樣本各20份，計算其假陽性率和假陰性率：

1.2.7 試紙條特異性實驗

考慮到煙葉生產(chǎn)中經(jīng)常會出現(xiàn)與三唑酮同時使用或結構類似的有機氮或雜環(huán)類農(nóng)藥如甲霜靈、吡蟲啉、多菌靈、烯唑醇、丙環(huán)唑、戊唑醇、腈菌唑等的干擾，特進行特異性實驗。分別向空白煙葉樣本提取液中添加上述農(nóng)藥至濃度為0、1、5、10、20、50、100mg/kg。用試紙條進行檢驗，不同農(nóng)藥每個濃度重復3次，根據(jù)試驗結果判定試紙條的特異性。

1.2.8 試紙條檢測操作

1.2.8.1 樣品提取

鮮煙葉：檢測前將樣剪成2×2mm2碎片。稱取1.0±0.05 g樣品置于含5 mL甲醇的10 mL螺口玻璃管中，擰緊管蓋，手持劇烈振蕩1 min。靜置5 min后移取0.1 mL上層清液加入到0.9 mL磷酸緩沖鹽溶液(0.1 M)中。

干煙葉：檢測前將樣品粉碎成20~40目粒度。稱取粉末狀樣品1.0±0.05 g至含5 mL甲醇的10 mL螺口玻璃管中，擰緊管蓋，手持劇烈振蕩1 min。靜置5 min后移取0.1 mL上層清液加入到0.9 mL磷酸緩沖鹽溶液(0.1 M)中。

1.2.8.2 試紙條檢測

用吸管吸取1.2.8.1中制得待檢樣品溶液垂直滴加2~3滴于試紙條加樣孔，液體流動時開始計時，反應5 min，對試紙條顯示的實驗結果進行判讀，其他時間判定無效。

1.2.9 試紙條符合性實驗

取50份煙葉樣本（鮮煙葉和烤后煙葉各占50%），分別用膠體金免疫層析法和儀器方法（氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法，GC-MS/MS）測定其中三唑酮和三唑醇殘留總量。當樣品中三唑酮和三唑醇殘留總量低于膠體金試紙條檢測限，判為陰性，試紙條陰性結果用“-”表示，儀器檢測法低于檢測限的結果用“ND”表示；當樣品中三唑酮和三唑醇殘留總量高于膠體金試紙條檢測限濃度，判為陽性，試紙條陽性結果用“+”表示，儀器檢測法陽性結果用實測值表示。儀器檢測方法參照YQ/T 47.1—2014《煙草及煙草制品多種農(nóng)藥殘留量的測定第1部分：氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法》[19]所述進行操作。

1.2.10 試紙條穩(wěn)定性實驗

選取試紙條3批，分別于4℃、25℃、37 ℃干燥條件下保存1、3、6、9、12、15個月。取出不同保存時段的試紙條對添加三唑酮標準品濃度分別為0、1 mg/kg的煙葉樣本進行檢測，每個樣本重復5次，觀察不同保存時間的試紙條檢測結果，確定試紙條的保存期。

2 結果與討論

2.1 試紙條檢測限

用試紙條檢測三唑酮濃度分別為0.25、0.5、1、1.5、2 mg/kg的煙葉樣本提取液。按照1.2.5所述方法進行檢測，確定檢測限。以只出現(xiàn)C線時的最低標準品質(zhì)量濃度作為試紙條的檢測限，由此得出，該試紙條檢測限為 1 mg/kg。檢測結果見表1。

2.2 試紙條重復性

用不同批次的3批膠體金試紙條分別對20份陽性和陰性煙葉樣本進行檢測，檢測結果如表2所示。由表2可以看出，陽性符合率為100%，即假陰性率為0；陰性符合率為100%，即假陽性率為0。實驗證明不同批次生產(chǎn)的檢測試紙條檢測結果穩(wěn)定可靠，具有良好的重復性。

2.3 試紙條特異性

試紙條與煙葉中常見的其他藥物交叉反應結果如表3所示。測定結果表明，膠體金試紙與甲霜靈、吡蟲啉、多菌靈等農(nóng)藥不存在交叉反應，因此膠體金試紙條對煙葉中的三唑酮殘留的檢測具有較高的特異性。

表1 煙葉中三唑酮快速檢測試紙條檢測限測試結果Tab. 1 Detection limit of triadimefon rapid test strip in tobacco leaves

表2 不同批次三唑酮快速檢測試紙條重復性檢測結果Tab. 2 Different batches of triadimefon rapid test strip reproducible test results

表3 煙葉中三唑酮快速檢測試紙條特異性檢測結果Tab. 3 Results of speci fi city of triadimefon rapid test strip in tobacco leaves

2.4 試紙條符合性

利用膠體金免疫層析法、GC-MS/MS法對50份煙葉盲樣進行對比測定，前者陰陽性判斷的臨界值設為1 mg/kg，后者高于檢測限的樣本均以實測值表示，實驗結果如表4所示。膠體金快速檢測試紙條檢出陽性樣本30份，陰性樣本20份；GC-MS/MS檢測結果顯示，共有29份煙葉樣本中三唑酮殘留量超過1 mg/kg，且樣本編號與試紙條檢出陽性樣品編號相同，其中13號樣本儀器測試結果為ND，膠體金免疫層析法為陽性，表現(xiàn)出了假陽性。另有6份樣本中儀器檢測結果在0.21～0.86mg/kg之間（低于1 mg/kg），膠體金免疫層析法亦為陰性。表明膠體金試紙與儀器檢測結果一致性程度較高，檢測符合率為98%。

2.5 試紙條穩(wěn)定性

檢測試紙條在分別于4、25、37 ℃溫度下保存15個月，對不同保存時間的試紙條進行抽檢，觀察其外觀、準確性、敏感性隨時間的變化情況。實驗結果表明，檢測試紙條在4~37℃溫度下至少能保存9個月。

表4 膠體金免疫層析法與氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）檢測結果對比Tab. 4 Comparison of detecting results between gold immunochromatography assay and GC-MS/MS

表5 三唑酮快速檢測試紙條穩(wěn)定性檢測結果Tab. 5 Results of stability of triadimefon rapid test strip

3 結論

本研究采用膠體金免疫層析法檢測煙葉樣本中三唑酮和三唑醇殘留，以此驗證三唑酮膠體金試紙條檢測效果，并將其檢測效果與GC-MS/MS法作對照。結果表明，三唑酮膠體金試紙條的檢測限為1 mg/kg，對煙葉生產(chǎn)中常用農(nóng)藥甲霜靈、吡蟲啉、多菌靈等無交叉反應，特異性良好，假陽性率和假陰性率均為0，檢測時間為5~10 min，能夠在4~37℃干燥條件下至少保存9個月。與儀器檢測方法相比，本法具有快速、簡便、儀器化程度低，經(jīng)濟實用等優(yōu)點，適合我國基層煙站對大批量樣品集中篩查檢測和待采收煙葉的田間現(xiàn)場快速檢測。但是由于膠體金免疫層析法主要通過目測顏色來判斷結果，比較主觀，可能出現(xiàn)假陽性問題，因此，如需對檢測中出現(xiàn)的陽性樣本進行仲裁，還需要用相關儀器方法進行進一步確證。

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：LOU Xiaohua, GAO Chuanchuan, ZHU Wenjing, et al. Rapid detection of triadimefon residues in tobacco leaves with colloidal gold immunochromatography [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(1)

*Corresponding author. Email：louxh6311@sina.com

Rapid detection of triadimefon residues in tobacco leaves with colloidal gold immunochromatography

LOU Xiaohua1*, GAO Chuanchuan1, ZHU Wenjing1,BA Jinsha1,FUSheng2, YangMei2, YI Zhongren2
1 Guizhou Tobacco Quality Supervision Station, Guiyang 550025, China;2 Guizhou Kwinbon Food Safety Science And Technology Co.,Ltd., Guiyang 550009, China

Gold immunochromatography assay was adopted to establish a rapid detection method for triadimefon residues in tobacco leaves. Colloidal gold was prepared by sodium citrate method, and was then conjugated to triadimefon antibodies. Triadimefon-OVA and anti-mouse goat immunoglobulins were jet-positioned onto a nitrocellulose membrane. Sample pad, gold jed pad, nitrocellulose membrane and absorbent paper were assembled and cut into detecting card, respectively. Results showed that the sensitivity of rapid triadimefon visual detection limit is 1 mg/kg for residues of triadimefon and triadimenol in tobacco leaves, and detection time was 5～10 min. Repeatability was good, and it gave almost no false positive or negative results compared with gas chromatography-tandem mass spectrometry.

gold immunochromatography; tobacco leaf; pesticide residue; triadimefon

樓小華，高川川，朱文靜，等. 膠體金免疫層析法快速檢測煙葉中三唑酮殘留量[J]. 中國煙草學報，2017,23（1）

貴州省煙草專賣局（公司）科技項目(No. 201518)

樓小華，本科，高級工程師，從事煙草質(zhì)量安全研究，Tel：0851-84117148，Email：louxh6311@sina.com

2016-08-30；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡出版日期：

日期：2017-01-25