郭 尚，周 林，徐莉娜，李艷婷，南曉潔

(山西省農業(yè)科學院食用菌研究所，山西 太原 030031)

嗜藍孢孔菌屬(Fomitiporia)一新種

郭 尚，周 林*，徐莉娜，李艷婷，南曉潔

(山西省農業(yè)科學院食用菌研究所，山西 太原 030031)

【目的】在山西雁北地區(qū)沙棘樹腐木上采集到了野生嗜藍孢孔菌屬一新菌，研究其新菌的形態(tài)學特征、分子系統(tǒng)發(fā)育并確定新種?！痉椒ā啃螒B(tài)學觀察采用肉眼觀察標本以及制作Melzer、棉藍和5 % KOH 3種試劑的浮載切片，在顯微鏡下觀察標本形態(tài)，分子系統(tǒng)發(fā)育分析采用將新種的ITS序列與其他已經報道的20種真菌ITS進行同源聚類分析，構建基于ITS的分子系統(tǒng)發(fā)育樹?！窘Y果】形態(tài)學特征為具有馬蹄形擔子果，蓋狀無柄，有時平伏反卷生長，單系菌絲系統(tǒng)；骨架菌絲在Melzer試劑和棉藍試劑中呈負反應；擔孢子近球形或球形，無色，厚壁等。分子系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明新種與嗜藍孢孔菌屬親緣關系較近，聚在一個分支中，并在系統(tǒng)發(fā)育樹中形成了一個獨立的亞分枝?！窘Y論】根據研究確認為嗜藍孢孔菌屬新種，定名為FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou(登陸號GenBank: KT861405, Fungal name: FN570360)。

嗜藍孢孔菌；新種；形態(tài)學；分子系統(tǒng)發(fā)育樹；分類

【研究意義】嗜藍孢孔菌屬真菌是一類非常重要的藥用真菌，含有三萜類化合物、葡聚糖、黃酮等多種健康有益的功能成分，對人類健康保健品的開發(fā)，具有很重要的價值?！厩叭搜芯窟M展】以前有些人將這類真菌與桑黃屬的Phellinuspunctatus-robustus的復合體混為一類相似體[1]，但是近年來的研究認為，這兩個種類屬于不同的屬，在分子系統(tǒng)發(fā)育研究中形成了明顯的、單系的分支[2]。在分類學研究中，近年來分子生物學技術應用于傳統(tǒng)的分類學研究中，使之產生了巨大的進步，嗜藍孢孔菌屬Fomitiporia的分類也隨之發(fā)展，報道了一些新種[3-5]?！颈狙芯壳腥朦c】2015年秋，在山西雁北地區(qū)的野生沙棘樹腐木上采到了一株野生嗜藍孢孔菌。從子實體形態(tài)和顯微鏡下的觀察結果，以及分子ITS測序分析結果認為，該菌具有明顯的嗜藍孢孔菌Fomitiporia屬的特征，在分子系統(tǒng)發(fā)育樹中形成單獨的分支，因此確認該菌為Fomitiporia屬的1個新種，定名為FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou。【擬解決的關鍵問題】現將FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou的形態(tài)學特征、分子生物學特征和系統(tǒng)發(fā)育情況報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本和菌株

2015年10月，著者們在山西雁北地區(qū)采集到了一株野生嗜藍孢孔菌屬真菌，此菌株生長在沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)腐木上，采集地點海拔1352 m，北緯39°98′、東經112°47′，采集標本(SXSYJBB1510)，以及用新鮮子實體分離得到純菌株(SXSYJJZ No.1510)，保存于山西省農科院食用菌所內。同時送中國農科院微生物菌種保藏中心收藏(CGMCC No.13380)。

1.2 獲得純菌種

培養(yǎng)基為常規(guī)的PDA培養(yǎng)基，pH 6。采用組織分離法，將子實體表面消毒(高錳酸鉀或乙醇)，無菌操作切取子實體內部菌肉，接于滅菌后的PDA培養(yǎng)基試管中，培養(yǎng)條件為27 ℃，黑暗。

1.3 形態(tài)學鑒別

以裸眼確認標本，鑒別真菌標本的色、形、質、邊緣、菌蓋、菌柄、以及紋飾，毛刺有無等特征，記錄菌體大小、輪廓長、寬度等。

標本顯微特征鑒別，以Melzer試劑制作切片觀察菌絲系統(tǒng)的淀粉質反應或擬糊精反應，在5 % KOH試劑中觀察菌絲系統(tǒng)的變化反應、菌髓或菌肉菌絲的排列方式等。在棉藍切片中觀察菌絲的嗜藍反應，同時觀察生殖菌絲、骨架菌絲、囊狀體或擬囊狀體以及其他結構等在棉藍試劑和Melzer試劑中的反應。

資料對比判斷，根據標本的特征以及采集地的生態(tài)環(huán)境，查閱相關資料對比鑒別[6]。

1.4 分子生物學分析

采集的嗜藍孢孔菌新菌株培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基，DNA提取用CTAB法，檢測純度和完整性用微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳。引物用ITS5，對提取的ITS DNA進行PCR擴增，PCR反應，變性(95 ℃預變性2 min)-復性(57 ℃復性1 min)-延伸(72 ℃延伸1 min)等3個過程35個循環(huán)，最后保溫10 min(72 ℃)。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的研究

從GenBank中收集嗜藍孢孔菌屬Fomitiporia21個標本和14個物種的參考序列(表1)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，軟件ClustalX2.0.11進行默認程序的核苷酸序列自動比對，序列對齊，進一步優(yōu)化和手工調整，構建基于ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹。相同寄主的種FomitiporiahippophaeicolaMUCL 31746和FomitiporiahippophaeicolaMUCL31747兩個菌株選作外群。進化分枝上Bootstrap檢驗度為1000，Values大于50 %。

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育樹分析的相關菌株及ITS序列登錄號

續(xù)表1 Continued table 1

屬/種名Genus/speciesnamesVoucher地點LocalityGenBank登錄號GenBankAccessionNo.作者AuthorsFomitiporiaerectaMUCL49871FranceGU461939A.David.FomitiporiagabonensisMUCL47576(T)GabonGU461971Amalfi&DecockFomitiporiasp.GL-2016ChinaKT861405FomitiporiahippophaeicolaMUCL31746BelgiumGU461945Fiasson&NiemelaMUCL31747BelgiumGU461946Fiasson&NiemelaFomitiporiapunctateMUCL34101GermanyAY618200Murrill.MUCL47629JapanGU461982Murrill.MUCL53548EuropeJX093834Murrill.FomitiporiarobustaMUCL51297EstoniaJQ087892Fiasson&NiemelaMUCL51327CzechGU461949Fiasson&NiemelaFomitiporiasp.MUCL53009SouthAfricaJQ087890Amalfi.FomitiporiatenuisMUCL49948GabonGU461958Decock.FomitiporiatorreyaeMUCL47628JapanJQ087896Y.C.Dai&B.K.CuiFomitiporiaPS3MUCL52350MexicoJQ087885Amalfi.

2 結果與分析

2.1 形態(tài)特征描述

子實體：擔子果多年生，干燥的子實體呈木質狀，無柄，蓋狀，馬蹄形，單生，平伏有時反卷生長，無異味，木栓化。單片菌蓋長徑大約5～7 cm，寬徑2～4 cm寬，厚度1～2 cm。菌蓋上表面棕褐色，粗糙，無同心環(huán)帶，菌蓋下表面呈綠褐色，木栓質，具同心的環(huán)區(qū)。菌蓋邊緣鈍化，黃褐色，菌肉也呈黃褐色，達30 mm厚。菌管比菌肉顏色稍暗，呈棕黃色，木質 (圖1)。

菌絲結構：單系菌絲系統(tǒng)，生殖菌絲有鎖狀聯合。在Melzer試劑和棉藍試劑中骨架菌絲呈負反應，在氫氧化鉀試劑中無反應，菌絲即不消解，也不膨脹。

新種 A～C:沙棘樹上的子實體；Bar=5cmA-C: Habit on Seabuckthorn trees; Bar=5cm圖1 嗜藍孢孔菌 Fig.1 Fomitiporia yanbeiensis

菌肉：生殖菌絲為無色或淺黃色，數量較少，壁較薄或稍厚，偶有分枝，直徑約1.4～2.5 μm。骨架菌絲較多，呈黃褐色至銹褐色，厚壁，有一內腔，有分枝無分隔，交織排列，直徑為1.7～3.2 μm。

菌管: 生殖菌絲較少，無色，薄壁，偶爾分枝，直徑為2.0～3.0 μm；多數為呈黃褐色的骨架菌絲，大致沿菌平行排列，壁較厚，直徑為2.5～4.8 μm。

孢子: 擔孢子球形或近球形，平滑，無色。壁很厚，Melzer中呈淀粉反應，在棉藍中無嗜藍反應。大小為 4.0～5.1 μm×5.4～6.1 μm，平均長為4.52 μm，平均寬為4.18 μm，長寬比約為1.08。子實層中有囊狀體，無剛毛，壁薄，大小約為4.6～8.0 μm×3.8～4.0 μm；擔子桶狀不著生擔孢子梗，大小約為 6.0～12.0 μm×4.0～6.5 μm。擬擔子很少，與擔子的形狀有些相似，但與擔子相比略小一些。

模式標本存放在山西省農科院食用菌研究所(SXSYJBB1510)。寄主為沙棘樹。采集地位山西省的雁北地區(qū)，北緯39°98′、東經112°47′，海拔1352 m。

2.2 DNA測序鑒定

所提取的Fomitiporiayanbeiensis基因組用微量分光光度計檢測后，結果顯示其OD260/280=1.68，OD260/230=1213，濃度為47.2 ng/μl，表明所提取的基因組質量高、純度好，符合下游PCR的要求。以提取的Fomitiporiayanbeiensis基因組為模板，ITS DNA的擴增結果見圖2。

Sanger測序結果上傳NCBI 檢索得到登錄號：KT861405.1，并將此序列Blast同源比對，結果顯示出新菌標本ITS DNA與嗜藍孢孔菌屬的一些種類具有極高的同源性。

2.3 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank中經Blast檢索后，下載相似性大于90 %的相關菌株的ITS1-5.8S-ITS2區(qū)段序列，用ClustalX2.0.11軟件對菌株Fomitiporiayanbeiensis和下載的序列進行比對，用Mega5軟件，以FomitiporiahippophaeicolaMUCL 31747為外群，構建鄰接(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。本研究菌株Fomitiporiayanbeiensis和嗜藍孢孔菌屬Fomitiporia的一些種以100 %的支持率聚在同一分支中。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，菌株Fomitiporiayanbeiensis的系統(tǒng)發(fā)育地位屬于嗜藍孢孔菌屬?；谛螒B(tài)特征與其嗜藍孢孔菌屬種的比較結果，以及分子系統(tǒng)發(fā)育分析，支持菌株Fomitiporiayanbeiensis是嗜藍孢孔菌屬中的一個新分類單元。

圖2 ITS PCR產物凝膠電泳結果Fig.2 Gel electrophoresis results of ITS PCR products.

3 討 論

根據資料記載，嗜藍孢孔菌屬Fomitiporia真菌有37個種被研究報道過[7]，是銹革孔菌科中的一個獨立的類群[8]，目前在中國報道過的種類有13個種[4]。我們的新菌標本具有嗜藍孢孔菌屬真菌種類Fomitiporiagenus的代表特性，因此可以確認Fomitiporiayanbeiensis是Fomitiporia屬的一個種類。

近年來應用DNA條碼技術研究生物分類，為微生物特別是真菌分類提供了一個確切可靠的鑒定手段，ITS序列分析被視為微生物種類鑒定的簡便有效的方法之一[9-10]。在本研究中，獲得Fomitiporiayanbeiensis了長度為789 bp的ITS序列片段，經在GenBank中的Blast檢索比對，與嗜藍孢孔菌屬真菌種類Fomitiporiagenus的代表菌株親緣關系較近11]，相似性為95 %～96 %。而與其他的Fomitiporiasp.都親緣較遠，相似性91 %以下。與具有相同寄主的Fomitiporiahippopha?icola(H. Jahn) Fiasson & Niemel?[11-12]的序列相似度只有88 %[13]，這意味著兩個種類應該不屬于同種。

在系統(tǒng)發(fā)育樹中，Fomitiporiayanbeiensis內嵌于Fomitiporiasp.進化枝中，形成了明顯的、支持率高的、單獨的分枝。Fomitiporiasp.在中國已經有很多報道， Dai YC等[3,14]發(fā)表的新種中，FomitiporiabannaensisY.C. Dai和FomitiporiatorreyaeY.C. Dai & B.K. Cui，在系統(tǒng)發(fā)育樹中與FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou相距較遠，這可能說明這些種類與本研究報道的Fomitiporiayanbeiensissp.nov.具有較遠的親緣關系(圖3)。

在我國報道過的木生真菌大約有百十余種，南方的廣西、云南以及東北地區(qū)較多，銹革孔菌科的很多木生真菌種類都是樹木的病原菌，侵染活樹使樹體罹病，造成樹木腐爛甚至死亡[15]。在山西雁北地區(qū)發(fā)現的此新菌是野生狀態(tài)的，采集地實地考察以及訪問當地居民，沒有關于沙棘林因為生長有這種新菌而造成樹木死亡的說法，當地居民們說這是在沙棘樹死后才長出來的。筆者們是在沙棘樹的腐木上采集到的這種菌株，沒有在活樹上發(fā)現，可能是我們采集到的菌株是多年生標本，樹木已經死亡。再就是可能調查范圍有限，未能發(fā)現活體樹上的標本，今后我們將繼續(xù)調查采集，擴大采集地區(qū)、采集樹的樹齡以及生長季節(jié)。同時也在進行新菌的菌種培養(yǎng)基質研究和人工栽培馴化試驗，利用小麥、小米、玉米等培養(yǎng)基質接種，大約30～45 d即可培養(yǎng)出健壯的菌絲[16]，在野外活體沙棘樹上或斷木上做接種實驗，研究這個新菌(Fomitiporiayanbeiensis)在活體沙棘樹上以及其他樹種上能否生長，是否使樹體罹病，能否進行人工馴化，為實現仿野生栽培和人工栽培提供一些基本實驗依據。

分支樹上的數據表示Bootstrap檢驗的支持百分率，顯示菌株的GenBank序列號，標尺參數表示進化距離The confidence values of 50 or above from 1000 replicate bootstrap sampling are shown at each node, GenBank accession numbers are shown.Bars=distance corresponding to 10 base changes per 100圖3 依據ITS區(qū)序列構建的嗜藍孢孔菌屬及相關類群系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Molecular phylogenetic tree inferred from the rDNA-ITS sequence of Fomitiporia (obtained from this study) and related strains (obtained from GenBank)nucleotide positions.

4 結 論

分析鑒定確認，該研究標本嗜藍孢孔菌屬新種(Fomitiporiayanbeiensis) 具有Fomitiporiagenus的代表特性，如子實體、菌絲體、擔孢子等特征，屬于Fomitiporia屬種類，是嗜藍孢孔菌屬的一個新種，定名為FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou(登陸號GenBank: KT861405, Fungal name: FN570360)，與Fomitiporiahippopha?icola具有相同的沙棘分離源，但從形態(tài)學特征和ITS分子序列分析結果看，不屬于相同種類。

[1]Fischer M. On the species complexes within Phellinus:Fomitiporiarevisited[J]. Mycological Research, 1996, 100:1459-1467.

[2]Decock C, Bitew A, Castillo G.FomitiporiatenuisandFomitiporiaaethiopica(Basidiomycetes, Hymenochaetales), two undescribed species from the Ethiopian highlands: taxonomy and phylogeny[J]. Mycologia, 2005，97(1): 121-129.

[3]戴玉成，徐梅卿，吳興亮. 中國亞熱帶地區(qū)闊葉樹上一種新的立木腐朽病[J]. 林業(yè)科學研究，2001，14(1): 47-49.

[4]戴玉成.中國多孔菌名錄[J].菌物學報,2009, 28(3): 315-327.

[5]崔寶凱, 孫向前, 陳建新, 等. 浙江天目山兩種新的闊葉樹心材腐朽病[J]. 林業(yè)科學研究,2007,20(1): 97-100.

[6]張曉青,戴玉成. 中國真菌志—銹革孔菌科 [M].北京: 科學出版社, 2005.

[7]Wikipedia. Fomitiporia[EB/OL].https//en.wikipedia.org/wiki, 2016, on 26 November.

[8]昝立峰. 粗毛纖孔菌與橢圓嗜藍孢孔菌子實體的化學成分及其藥理活性研究[D]. 長春:吉林農業(yè)大學, 2012.

[9]林惠嬌，蔣 湘，王新國，等.DNA條形碼技術及其在真菌研究中的應用[J]. 植物檢疫， 2013，27(2):11-18.

[10]王壽南，陳青君，張國慶，等. 一株野生桑黃的分離鑒定與生物學特性[J]. 應用與環(huán)境生物學報，2016,22(40): 667-674.

[11]Si J, Dai Y C. Wood-decaying fungi in eastern Himalayas 5. Polypore diversity[J]. Mycosystema, 2016,35(3): 252-278.

[12]李 玉，李泰輝. 中國大型菌物資源圖鑒[M]. 鄭州:中原農民出版社，2015:381-390.

[13]National Center for Biotechnology Information(NCBI)https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

[14]Dai Y C, Zhang M.Fomotiporiatibetica, a new species of Hymenochaetaceae(Basidiomycota) from China [J]. Mycotaxon, 2002, 83: 217-222.

[15]崔寶凱,杜 萍,陶萬強,等. 北京地區(qū)黃櫨和桑樹上的新病原腐朽菌[J].林業(yè)科學研究，2009, 22(2):274-278.

[16]郭 尚,周 林,徐莉娜，等. 一個嗜藍孢孔菌屬新菌株的分離、鑒定與菌種培養(yǎng)基質研究[J].安徽農學通報，2017，23(14):35-37.

ANewSpeciesofGenusFomitiporia

GUO Shang，ZHOU Lin*，XU Li-na，LI Yan-ting，NAN Xiao-jie

(Shanxi Provincial Academy of Agricultural Sciences, Institute of Edible Fungi, Shanxi Taiyuan 030031, China)

【Objiective】A newFomitiporiafungus,Fomitiporiasp. nov., was collected from the Yanbei area Shanxi province China in the wild buckthorn trees rot wood. The purpose of this study was to identify the morphological characteristics, molecular phylogeny and new species of new strain. 【Methods】Morphological observation was carried out by naked eye observation, and under the Nikon E80i microscope, 3 kinds of reagents, Melzer, cotton blue and 5 % KOH, were used as slides to observe the microscopic shape,Molecular phylogenetic analysis was carried out by homologous clustering analysis of the new ITS sequences with 20 other reported fungal ITS, and a phylogenetic tree based on ITS was constructed. 【Result】The morphological feature was that it has a horseshoe shaped cover basidiocarps, sessile, sometimes procumbent backscroll mycelium growth, single system; skeletal hyphae showed a negative reaction in the Melzer reagent and cotton blue reagent; basidiospore near spherical or spherical, colorless, thick wall etc. Molecular phylogenetic analysis showed that the new species had close relationship with the genus Cladosporium and clustered into one branch and formed an independent sub clade in the phylogenetic tree. 【Conclusion 】According to the study, it was confirmed as a new species ofFomitiporiagenus and namedFomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou (GenBank: KT861405, Fungal name: FN570360). The type specimen SXSYJBB1510 was stored in the Institute of edible fungi of Shanxi Academy of Agricultural Sciences, and the strain specimen CGMCC No.13380 has been deposited in China General Microbiological Culture Collection Center.

Fomitiporia; New species; Morphology; Phylogenetic trees; Classification

1001-4829(2017)10-2334-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.029

2017-04-27

山西省煤基重點科技攻關(FT2014-03)

郭 尚(1967-)，男，山西陽高人，博士，副研究員，主要從事食用菌菌根共生機理、食(藥)用菌生產技術與種質資源研究，E-mail:gs0351@sohu.com,*為通訊作者，E-mail: nkysyj301@126.com。

S567.3+4

A

(責任編輯 李 潔)