蘭凱+張光偉+秦迎霞+倪菁

摘要：目的 探討帕立骨化醇對(duì)糖尿病腎?。―N）大鼠尿液足細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白Podocalyxin（PCX）的影響。方法 采用鏈尿佐菌素（STZ）腹腔注射的方法構(gòu)建DN大鼠動(dòng)物模型，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為帕立骨化醇組（P組）、DN組（D組），并設(shè)置健康對(duì)照組（N組）。P組大鼠每周灌胃帕立骨化醇3次，每次劑量0.4 μg/kg，給藥12 w后檢測(cè)各組大鼠尿液PCX水平、24 h尿蛋白定量及一般生化指標(biāo)。結(jié)果 與N組相比，D組和P組PCX水平和24 h尿蛋白定量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P組顯著低于D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 帕立骨化醇可以通過(guò)減輕腎小球PCX蛋白的損傷，從而改善糖尿病腎病大鼠蛋白尿的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：糖尿病腎??；帕立骨化醇；PCX

中圖分類(lèi)號(hào)：R587.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1959（2017）21-0028-03

Effects of Paricalcitol on Urine Podocalyxin Levels in Diabetic Nephropathy Rats

LAN Kai，ZHANG Guang-wei，QIN Ying-xia，NI Jing

（School of Clinical Medicine，Xi'an Medical University，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of paclitaxel on the expression of Podocalyxin（PCX）in the urine podocyte of diabetic nephropathy（DN） rats.Methods Using streptozotocin（STZ）intraperitoneal injection method to construct DN rat animal model，the successful model of the rats were randomly divided into paricalcitol group（P group），DN group（D group），and set up a healthy control group（N group）.P rats by gavage every week paricalcitol 3 times per dose 0.4 μg/kg，urine PCX levels of rats in each group after treatment for 12 w，24 h urinary protein and biochemical indices. Results Compared with N group，D group and PCX P group and 24 h urinary protein was significantly increased，the differences were statistically significant（P<0.05）；P group was significantly lower than that in D group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion Paricalcitol can reduce glomerular PCX protein damage，thereby improving proteinuria in diabetic nephropathy rats.

Key words：Diabetic nephropathy；Paricalcitol；PCX

糖尿病腎病（diabeticnephropathy）是糖尿病的主要慢性微血管并發(fā)癥之一，是目前引起慢性腎功能衰竭的主要原因。在西方國(guó)家，糖尿病腎病是終末期腎病的首要原因，在我國(guó)糖尿病腎病雖然在終末期腎病各種病因中的發(fā)生率還居原發(fā)性腎小球腎炎之后，但隨著人們生活質(zhì)量的改善有逐年遞增的趨勢(shì)。糖尿病腎病一旦發(fā)展到終末期腎病必須依靠替代治療來(lái)維持，因此早期治療非常重要。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腎小球足細(xì)胞損傷和脫落在糖尿病腎病腎小球?yàn)V過(guò)屏障通透性的改變及蛋白尿的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。PCX是腎小球足細(xì)胞足突頂端膜區(qū)的主要跨膜蛋白之一，參與維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障正常結(jié)構(gòu)。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)活性維生素D類(lèi)似物帕立骨化醇具有減少糖尿病腎病大鼠尿蛋白及腎臟保護(hù)作用[1-2]，但具體作用機(jī)制尚不清楚，可能與改善腎小球?yàn)V過(guò)屏障結(jié)構(gòu)有關(guān)，目前這方面的研究較少。本研究擬通過(guò)帕立骨化醇對(duì)糖尿病腎病大鼠尿蛋白和PCX水平的影響，探討其對(duì)腎臟保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型的建立與分組

清潔級(jí)封閉群雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（210±20）g。20只大鼠造模，10只為健康對(duì)照組（N組）。大鼠造模后禁食10 h，單次無(wú)菌腹腔注射65 mg/kg鏈脲菌素（購(gòu)于美國(guó)Sigma公司）。72 h后取尾靜脈血測(cè)空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG≥16.65 mmol/L確定為糖尿病大鼠，3 w后24 h尿蛋白量≥30 mg確認(rèn)糖尿病腎病大鼠模型制備成功；健康對(duì)照組注射等量的檸檬酸緩沖液。造模成功的糖尿病腎病大鼠隨機(jī)分成：帕立骨化醇治療組（P組，10只），將帕立骨化醇溶于丙二醇中，以0.4 μg/kg的劑量3次/w灌胃；糖尿病腎病組（D組，10只）。D組與N組給予等量丙二醇灌胃，連續(xù)12 w。12 w后收集24 h尿，心臟取血4～5 ml。

1.2一般指標(biāo)檢測(cè)

芐乙氯銨沉淀法檢測(cè)24 h尿蛋白。自動(dòng)生化儀檢測(cè)空腹血糖（FBG）、血肌酐（Scr）、血鈣、血磷和甲狀旁腺激素（PTH）。endprint

1.3尿液PCX測(cè)定

根據(jù)試劑盒操作流程，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定尿液PCX水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1治療12 w后各組大鼠指標(biāo)變化

P、D組24 h尿蛋白量、空腹血糖、肌酐和PTH均高于N組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P組24 h尿蛋白量、肌酐顯著低于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P組血鈣、血磷與N組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

2.2治療12 w后各組大鼠尿液PCX水平變化

P組和D組PCX水平高于N組（P<0.05）；P組PCX水平低于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

在西方國(guó)家，糖尿病腎病是終末期腎病的首要原因，在我國(guó)糖尿病腎病雖然在終末期腎病各種病因中的發(fā)生率還居原發(fā)性腎小球腎炎之后，但隨著人們生活方式的改變有逐年遞增的趨勢(shì)。糖尿病腎病是糖尿病最常見(jiàn)并發(fā)癥，一旦發(fā)展到終末期腎病必須依靠腎臟替代治療，因此早期干預(yù)非常重要。糖尿病腎病表現(xiàn)為腎小球內(nèi)高灌注、高濾過(guò)、高壓力，進(jìn)而出現(xiàn)腎小球毛細(xì)血管袢基底膜增厚和基質(zhì)增生。由于糖尿病腎病患者機(jī)體存在極其復(fù)雜的代謝紊亂，一旦發(fā)展到終末期腎病，往往比其它腎臟疾病治療更加棘手。因此在糖尿病腎病早期進(jìn)行積極有效地干預(yù)治療，已成為當(dāng)前糖尿病和腎臟病學(xué)界十分熱點(diǎn)的課題。研究發(fā)現(xiàn)糖代謝異常、腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變、氧化應(yīng)激等因素，可引起腎小球?yàn)V過(guò)屏障的損傷，導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生，而微量蛋白尿是糖尿病腎病的早期標(biāo)志[3-4]。由于腎小球?yàn)V過(guò)膜因炎癥、免疫、代謝等因素?fù)p傷后濾過(guò)膜孔徑增大、斷裂和靜電屏障作用減弱，血漿蛋白質(zhì)特別是清蛋白濾出，超出近端腎小管重吸收能力而形成的蛋白尿。臨床上見(jiàn)到持續(xù)性蛋白尿往往意味著腎臟的實(shí)質(zhì)性損害。當(dāng)?shù)鞍啄蛴啥嘧兩贂r(shí)，既可反映腎臟病變有所改善，也可能是由于大部分腎小球纖維化，濾過(guò)的蛋白質(zhì)減少，腎功能日趨惡化，病情加重的表現(xiàn)。蛋白尿已被證實(shí)是腎臟損害的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有效減少蛋白尿可以延緩糖尿病腎病腎臟功能減退。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)活性維生素D具有廣泛的生理功能，除調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝外，還影響免疫、神經(jīng)、生殖、內(nèi)分泌、上皮及毛發(fā)生長(zhǎng)等生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)?；钚跃S生素D是一種前類(lèi)固醇激素，它通過(guò)細(xì)胞內(nèi)特異的維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）介導(dǎo)發(fā)揮其生物學(xué)活性。VDR分為兩大類(lèi)：膜受體（membrance VDR）和核受體（nuclear VDR）。膜受體主要參與維持鈣磷代謝平衡，核受體則主要影響基因轉(zhuǎn)錄，以及靶蛋白合成的調(diào)節(jié)。未結(jié)合維生素D的VDR既存在于胞漿也存在于細(xì)胞核內(nèi)；而與維生素D結(jié)合后的VDR即以二聚體形式轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子與存在于靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的維生素D反應(yīng)元件相作用，調(diào)控靶蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。維生素D類(lèi)似物的分子結(jié)構(gòu)同維生素D相似，可以和VDR結(jié)合，具有與活性維生素D3相似的生物學(xué)活性。目前主要包括骨化三醇（Calcitriol， 1，25-Dihydroxycholecalciferol）、帕立骨化醇（Paricalcitol，19-nor-1，25-dihydroxyvitamin D2）和度骨化醇（doxercalciferol，1-alpha-hydroxyergocalciferol）。維生素D類(lèi)似物通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾改變產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。維生素D類(lèi)似物的分子結(jié)構(gòu)同維生素D相似，可以和VDR結(jié)合，具有與活性維生素D相似的生物學(xué)活性。帕立骨化醇作為維生素D類(lèi)似物的一種，目前對(duì)其的研究主要集中在調(diào)節(jié)鈣磷代謝及預(yù)防佝僂病等方面的作用，近年來(lái)有關(guān)帕立骨化醇可能參與腎臟保護(hù)作用的研究越來(lái)越多。研究發(fā)現(xiàn)帕立骨化醇不僅具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝的生物學(xué)作用，還可通過(guò)抑制RAS系統(tǒng)、炎癥因子分泌、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、系膜細(xì)胞增殖等途徑改善糖尿病腎病病理生理過(guò)程，具有獨(dú)立于鈣磷代謝以外的腎臟保護(hù)作用[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病時(shí)活性維生素D水平與血漿腎素活性和血管緊張素Ⅱ呈負(fù)相關(guān)。研究表明帕立骨化醇可以使糖尿病腎病大鼠腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及小管間質(zhì)改變減輕，同時(shí)伴有腎保護(hù)作用，并且未發(fā)生高鈣血癥等問(wèn)題[7-8]。帕立骨化醇可以通過(guò)抑制腎素合成基因表達(dá)的環(huán)腺苷酸信號(hào)通路，阻斷部分環(huán)腺苷酸與環(huán)腺苷酸反應(yīng)原件結(jié)合區(qū)對(duì)腎素基因啟動(dòng)子的活化，可以抑制腎素基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，從而減少腎素的合成[9-11]，從而有效改善腎臟內(nèi)環(huán)境，擴(kuò)張腎動(dòng)脈，降低腎小球內(nèi)壓，改善血流動(dòng)力學(xué)，起到腎臟保護(hù)作用。帕立骨化醇能通過(guò)抑制循環(huán)及腎臟局部組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性而對(duì)腎臟具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用不依賴(lài)于細(xì)胞外鈣磷水平的變化，在本研究中也得到證實(shí)。有研究觀察缺失VDR突變型糖尿病小鼠生長(zhǎng)發(fā)育，發(fā)現(xiàn)此類(lèi)小鼠體內(nèi)存在強(qiáng)大腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活作用，同時(shí)伴有嚴(yán)重腎損傷，而通過(guò)給予維生素D類(lèi)似物治療，明顯改善腎損傷。研究發(fā)現(xiàn)腎臟部分切除的小鼠給予補(bǔ)充活性維生素D類(lèi)似物可使足細(xì)胞損傷減少，通過(guò)降低足細(xì)胞蛋白丟失和消除足細(xì)胞過(guò)度肥大，從而減少蛋白尿及腎小球硬化。這種保護(hù)不依賴(lài)于腎小球?yàn)V過(guò)率或血壓等因素改變，也不是血液動(dòng)力學(xué)機(jī)制可以解釋的，可能是通過(guò)足細(xì)胞修復(fù)或者腎小管間質(zhì)損傷的修復(fù)而實(shí)現(xiàn)。

足細(xì)胞是腎小囊臟層上皮細(xì)胞，它附著于腎小球基底膜的外側(cè)，連同腎小球基底膜和毛細(xì)血管內(nèi)皮一起構(gòu)成腎小球血液濾過(guò)屏障，是各種腎小球炎癥及非炎癥損傷的靶位。足細(xì)胞的損傷在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能蛋白逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，其中PCX作為足細(xì)胞上表達(dá)的一種標(biāo)志性蛋白，通過(guò)離子交換調(diào)控因子復(fù)合物對(duì)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)形成和維持起重要作用，同時(shí)也是腎小球主要帶負(fù)電荷的蛋白分子，參與形成腎小球電荷屏障[12-13]。PCX是CD34相關(guān)性唾液黏蛋白，由腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞合成，在足細(xì)胞成熟過(guò)程中固定于足細(xì)胞頂膜。PCX是腎小球足細(xì)胞足突頂端膜區(qū)的主要跨膜蛋白之一，參與維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障正常結(jié)構(gòu)。正常腎小球通過(guò)分子屏障和電荷屏障幾乎可以完全阻止血漿清蛋白分子的濾過(guò)，而足細(xì)胞PCX表達(dá)的減少將直接導(dǎo)致腎小球電荷屏障的陰離子分布減少，使得清蛋白更容易濾過(guò)；同時(shí)，PCX的減少也影響足細(xì)胞裂隙隔膜正常結(jié)果的維持。研究發(fā)現(xiàn)，多種腎臟疾病在發(fā)生腎損傷時(shí)，尿液中都可以檢測(cè)到PCX水平增加，同時(shí)伴隨腎小球基底膜的損傷，足細(xì)胞頂膜區(qū)的PCX表達(dá)也增加。研究證實(shí)腎臟損傷后，尿液中增加的PCX來(lái)源于足細(xì)胞頂膜區(qū)，而非脫落的足細(xì)胞碎片，表明尿液中PCX水平增加在腎臟損傷早期，早于足細(xì)胞從基底膜脫落以及足細(xì)胞損傷后活化的細(xì)胞膜脫落。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病病人尿液中檢測(cè)到的PCX水平增加，并且伴有腎小球基底膜的損傷，足細(xì)胞頂膜區(qū)的PCX表達(dá)相應(yīng)增加，同時(shí)PCX減少會(huì)影響足細(xì)胞裂孔膜正常結(jié)構(gòu)維持，與糖尿病腎病蛋白尿的產(chǎn)生關(guān)系密切[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)在帕立骨化醇治療12 w后糖尿病腎病大鼠蛋白尿指標(biāo)較未治療組明顯下降，肌酐水平也有下降，尿液中的PCX蛋白水平較未治療組有所下降，證實(shí)了其具有獨(dú)立于鈣磷代謝以外的腎臟保護(hù)作用，我們推測(cè)帕立骨化醇可能具有修復(fù)足細(xì)胞PCX蛋白損傷的作用，其作用途徑有待于經(jīng)一步研究。endprint

綜上所述，糖尿病腎病大鼠會(huì)出現(xiàn)蛋白尿，蛋白尿是引起腎功能減退的重要原因，帕立骨化醇可以減輕腎小球PCX蛋白的損傷，從而改善糖尿病腎病大鼠蛋白尿的，改善腎臟功能，延緩糖尿病腎病的發(fā)展，給臨床上糖尿病腎病的治療提供了新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]Tuncdemir M，Ozturk M.The effects of angiotensin-II receptor blockers on podocyte damage and glomerular apoptosis in a rat model of experimental streptozotocin-induced diabetic nephropathy[J].Acta Histochem，2010（12）：234-241.

[2]Li C.Vitamin D and diabetic nephropathy[J].Curr Diab Rep，2008（8）：464-469.

[3]Chen J，Cui W，Zhang Q，et al.Low molecular weight fucoidan ameliorates diabetic nephropathy via inhibiting epithelial mesenchymal transition and fibrotic processes[J].Am J Transl Res，2015，7（9）：1553-1563.

[4]安明，張瑞霞.早期糖尿病腎病相關(guān)危險(xiǎn)因素分析[J].醫(yī)學(xué)信息，2016，29（22）：282.

[5]Valdivielso JM，Cannata-Andía J，Coll B，et al.A new role for vitamin D receptor activation in chronic kidney disease[J].Am J Physiol Renal Physiol，2012，297（6）：1502-1509.

[6]Wang Y，Deb DK，Zhang Z，et al.Vitamin D receptor signaling in podocytes protects against diabetic nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2012，23（2）：1977-1986.

[7]Zhang Y，Ma KL，Liu J，et al.Dysregulation of low-density lipoprotein receptor contributes to podocyte injuries in diabetic nephropathy[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2015，308（12）：1140-1148.

[8]Li YC.Vitamin D regulation of the renin-angiotensin system[J].J Cell Biochem，2013（88）：327-331.

[9]Sugimoto Y，Inazumi T，Tsuchiya S.Roles of prostaglandin receptors in female reproduction[J].J Biochem，2015，157（2）：73-80.

[10]Friis U G，Madsen K，Stubbe J，et al.Regulation of renin secretion by renal juxtaglomeru- lar cells[J].PflugersArch，2013，465（1）：25-37.

[11]Yan C L.Renoprotective effects of vitamin D analogs[J].Kidney International，2010，78 （2）：134.

[12]Wang XM，Yao M，Liu SX，et al.Interplay between the Notch and P13KAkt pathways in high glucose induced podocyte apoptosis[J].Am J Physiol Renal Physiol，2014，30（6）：205-213.

[13]Tian Y，Lv G，Yang Y，et al.Effects of vitamin D on renal fibrosis in diabetic nephropathy model rats[J].Int J Clin Exp Pathol，2014，7（6）：3028-3037.

[14]Wolf G，Chen S，Ziyadeh FN.From the periphery of the glomerular capillary wall toward the center of disease：podocyte injury comes of age in diabetic nephropathy[J].Diabetes，2005，25（6）：1626-1634.

[15]De Boer IH，Sachs M，Hoofnagle AN，et al.Paricalcitol does not improve glucose metabolism in patients with stage 3-4 chronic kidney disease[J].Kidney Int，2013，83（2）：323-330.

編輯/李樺e(cuò)ndprint