王見(jiàn)璋++何志明　黃金鳳　李煒霞

[摘要]目的 探討LASS2及Ki67表達(dá)與鼻咽癌復(fù)發(fā)的相關(guān)性及其意義。方法 收集我院2011年～2014年的126例鼻咽癌活檢標(biāo)本，其中首發(fā)病例77例，復(fù)發(fā)病例49例。采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)LASS2及Ki67在126例鼻咽癌活檢組織中的表達(dá)，分析LASS2及Ki67在兩組間的表達(dá)差異及其之間的相關(guān)性。結(jié)果 LASS2在復(fù)發(fā)病例中的陽(yáng)性率為61.2%，低于首發(fā)病例的88.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。Ki67與鼻咽癌復(fù)發(fā)無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05），但LASS2表達(dá)與Ki67表達(dá)相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 LASS2在鼻咽癌復(fù)發(fā)的病例中呈低表達(dá)，檢測(cè)LASS2蛋白可能有助于提示腫瘤是否容易復(fù)發(fā)，LASS2在預(yù)測(cè)鼻咽癌復(fù)發(fā)中可能具有重要的臨床意義。LASS2與Ki67存在負(fù)相關(guān)，提示LASS2有可能抑制鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的增殖。

[關(guān)鍵詞]鼻咽癌；LASS2；Ki67；復(fù)發(fā)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R739.62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）10（c）-0120-03

Relationship between the expression of LASS2 and Ki67 with recurrent of nasopharyngeal carcinoma and its significance

WANG Jian-zhang HE Zhi-ming HUANG Jin-fen LI Wei-xia

Department of Pathology，Shunde Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Province，F(xiàn)oshan 528333，China

[Abstract]Objective To investigate the relationship between LASS2 and Ki67 expression with the recurrent of nasopharyngeal carcinoma （NPC） and its significance.Methods A total of 126 cases of NPC biopsy specimens in our hospital from 2011 to 2014 were collected，including 77 initial cases and 49 recurrent cases.Immunohistochemical methods were used to detect the expression of LASS2 protein and Ki67 in 126 patients with NPC.The difference between the expression of LASS2 and Ki67 in the two groups and their correlation were analyzed.Results The positive rate of LASS2 in recurrent cases was 61.2%，which was lower than 88.3% of the initial cases，with significant difference （P<0.001）.Ki67 had no significant correlation with the recurrence of NPC （P>0.05），however，there is a negative correlation between LASS2 expression and Ki67 （P<0.05）.Conclusion LASS2 was low-expressed in the recurrence of NPC.Detection of LASS2 protein may help to prompt tumor recurrence.LASS2 may be a clinically significant biological indicator for predicting the recurrence of NPC.LASS2 is negatively correlated with Ki67.It is suggested that LASS2 may inhibit the proliferation of NPC tumor cells.

[Key words]Nasopharyngealcarcinoma；LASS2；Ki67；Recurrence

鼻咽癌是原發(fā)于鼻咽黏膜被覆上皮的惡性腫瘤，是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，在廣東、廣西、福建、湖南等地多發(fā)。鼻咽癌起病隱匿，早期不易被發(fā)現(xiàn)，但容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。鼻咽癌發(fā)病機(jī)制不明，治療效果不理想，5年生存率約50%。放射治療是鼻咽癌最主要的治療手段，但首程放療后仍有8.2%～22.0%的復(fù)發(fā)率[1]。復(fù)發(fā)鼻咽癌預(yù)后較差，其再程放療的5年生存率為18.7%～36%[2]。鼻咽癌的發(fā)生與相關(guān)的基因變異有關(guān)，文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了多種基因變異促進(jìn)了鼻咽癌的發(fā)生[3-7]，但目前尚缺乏與鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)的基因研究。

LASS2是一種抑癌基因，廣泛存在于人體的多種組織中[8]，近年來(lái)的研究證實(shí)其可能成為一種腫瘤標(biāo)志物，具有廣泛的發(fā)展前景。Ki67是一類(lèi)與細(xì)胞周期相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原，臨床研究顯示，Ki67與腫瘤的增殖及預(yù)后有密切的關(guān)系。本文通過(guò)檢測(cè)LASS2蛋白及Ki67在鼻咽癌首發(fā)及復(fù)發(fā)病例中的表達(dá)情況，分析LASS2及Ki67在鼻咽癌復(fù)發(fā)中的作用以及兩者之間的相關(guān)性，旨在探討其作為評(píng)估鼻咽癌復(fù)發(fā)指標(biāo)的可能性。endprint

1材料與方法

1.1病例標(biāo)本

收集2011年～2014年我院的126例鼻咽癌活檢標(biāo)本，其中首發(fā)病例77例，復(fù)發(fā)病例49例；男性94例，女性32例；年齡20～78歲，平均（49.67±11.22）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首發(fā)病例活檢前均未進(jìn)行任何鼻咽癌相關(guān)治療；②復(fù)發(fā)病例復(fù)發(fā)前均進(jìn)行規(guī)范化治療，并隨訪(fǎng)2年以上。

1.2試劑

LASS2多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司（按1∶100稀釋?zhuān)?；Ki67濃縮型鼠抗人單克隆抗體（按1∶1000稀釋?zhuān)┘癝P通用型免疫組化試劑盒均購(gòu)于福州邁新公司。

1.3方法

標(biāo)本經(jīng)常規(guī)處理后，制作成蠟塊。采用免疫組化SP法檢測(cè)標(biāo)本中LASS2及Ki67表達(dá)的情況，具體操作如下。①組織石蠟切片脫蠟，水化；②自來(lái)水沖洗后，以檸檬酸浸泡進(jìn)行抗原修復(fù)，40℃微波修復(fù)15 min；③PBS沖洗3次，每次3 min（3×3 min）；④滴加3%雙氧水于切片上，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；⑤PBS沖洗（3×3 min）；滴加一抗，室溫下孵育60 min或4℃過(guò)夜；⑥PBS沖洗（3×3 min）；⑦滴加二抗，室溫下孵育15 min；⑧PBS沖洗（3×3 min）；⑨除去PBS，滴加新鮮配制的DAB顯色劑顯色，約1 min；⑩自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染、在1%鹽酸乙醇分化，PBS返藍(lán)，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。LASS2結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[9]，以鼻咽癌腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)及（或）胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，30%以上的腫瘤細(xì)胞著色才視為陽(yáng)性。Ki67結(jié)果以鼻咽癌腫瘤細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例，按比例劃分三個(gè)等級(jí)，<10%為1級(jí)，10～30%為2級(jí)，>30%為3級(jí)。免疫組化染色時(shí)所有標(biāo)本均有設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。免疫組化染色結(jié)果由2～3位有經(jīng)驗(yàn)的臨床病理醫(yī)師獨(dú)立閱片判斷。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 LASS2蛋白在鼻咽癌中表達(dá)比較

77例首發(fā)病例中，LASS2陽(yáng)性68例，陰性9例，陽(yáng)性率為88.3%；49例復(fù)發(fā)病例中，LASS2陽(yáng)性30例，陰性19例，陽(yáng)性率為61.2%。復(fù)發(fā)病例組的LASS2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于首發(fā)病例組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.712，P=0.000）（表1）。

2.2 Ki67與鼻咽癌復(fù)發(fā)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Ki67與鼻咽癌的復(fù)發(fā)無(wú)顯著相關(guān)性（r=0.086，P=0.341）（表2）。

2.3 LASS2蛋白表達(dá)與Ki67的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LASS2蛋白表達(dá)與增殖指數(shù)Ki67呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=-0.208，P<0.05）（表3）。

3討論

鼻咽癌是發(fā)病率最高的頭頸部惡性腫瘤，治療效果欠佳，復(fù)發(fā)率高。即使經(jīng)過(guò)合理及規(guī)范的綜合治療，部分患者仍難以避免地出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。臨床資料顯示，經(jīng)過(guò)規(guī)范化的綜合及放射治療后，仍有10%～36%的鼻咽癌患者會(huì)出現(xiàn)鼻咽局部復(fù)發(fā)，其中半數(shù)以上發(fā)生在治療后的前3年內(nèi)[10]。目前，對(duì)鼻咽癌復(fù)發(fā)機(jī)制的研究相對(duì)不足，因此，臨床工作中尚缺乏有意義的生物學(xué)指標(biāo)預(yù)測(cè)鼻咽癌的復(fù)發(fā)。

LASS2基因是近年來(lái)研究的一種人類(lèi)新的基因，屬于腫瘤抑制基因。LASS2基因編碼的蛋白參與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的調(diào)控。該蛋白通過(guò)結(jié)構(gòu)相似性的原理，通過(guò)結(jié)合V-ATPase質(zhì)子泵的亞基ATP6L，發(fā)揮抑制V-ATPase質(zhì)子泵跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)H+功能的作用，使細(xì)胞內(nèi)H+濃度升高，進(jìn)而激活線(xiàn)粒體凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[11-12]。此外，由于抑制了V-ATPase質(zhì)子泵跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)H+的功能，導(dǎo)致細(xì)胞外H+濃度降低，使得對(duì)H+高度敏感的蛋白水解酶類(lèi)的活性被抑制，引起細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解減少，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示，LASS2蛋白在鼻咽癌復(fù)發(fā)病例中的表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于首發(fā)病例組，提示LASS2蛋白表達(dá)陰性的鼻咽癌患者因失去了LASS2蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控作用，從而更容易復(fù)發(fā)。

Ki67是臨床病理檢查中常用的抗體，與PCNA一樣，主要用于判斷細(xì)胞的增殖活性。該蛋白最初被發(fā)現(xiàn)確定為鼠源的核單克隆抗體，是1983年Gerdes等[13]用鼠源單克隆抗體檢測(cè)一種來(lái)自霍奇金淋巴瘤系細(xì)胞核抗原時(shí)首次發(fā)現(xiàn)。Ki67表達(dá)在所有活動(dòng)的細(xì)胞周期（G1、S、G2和有絲分裂期）中，而在G0期不表達(dá)。臨床資料顯示，Ki67增殖指數(shù)高低與許多腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)，因此，也是惡性腫瘤預(yù)后的重要參考指標(biāo)之一[14-15]。

本研究結(jié)果顯示，Ki67與鼻咽癌復(fù)發(fā)無(wú)顯著相關(guān)性，提示鼻咽癌復(fù)發(fā)似乎與腫瘤細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯關(guān)系，但Ki67與LASS2蛋白之間存在負(fù)相關(guān)，這可能與LASS2抑癌基因的作用有關(guān)。LASS2通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此LASS2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)相對(duì)較低。

綜上所述，LASS2蛋白參與了對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而抑制腫瘤的復(fù)發(fā)，因此，檢測(cè)LASS2蛋白可能有助于提示腫瘤是否容易復(fù)發(fā)，LASS2在預(yù)測(cè)鼻咽癌復(fù)發(fā)中可能具有重要的臨床意義。

[參考文獻(xiàn)]

[1]盧泰祥，韓非，李嘉欣，等.復(fù)發(fā)鼻咽癌臨床研究進(jìn)展[J].中國(guó)癌癥雜志，2008，18（9）：661-666.

[2]韓非，盧泰祥.復(fù)發(fā)鼻咽癌的挽救治療[J].腫瘤學(xué)雜志，2009，15（7）：606-608.endprint

[3]Wang S，F(xiàn)ang W.Increased expression of hepatoma-derived growth factor correlates with poor prognosis in human nasopharyngeal carcinoma[J].Histopathology，2011，58（2）：217-24.

[4]Liu Z，Li X，He X，et al.Decreased expression of updated NESG1 in nasopharyngeal carcinoma：its potential role and preliminarily functional mechanism[J].Int J Cancer，2011，128（11）：2562-2571.

[5]Liu Z，Luo W，Zhou Y，et al.Potential tumor suppressor NESG1 as an unfavorable prognosis factor in nasopharyngeal carcinoma[J].PLoS One，2011，6（11）：278-287.

[6]Liu Z，Li L，Yang Z，et al.Increased expression of MMP9 is correlated with poor prognosis of nasopharyngeal carcinoma[J].BMC Cancer，2010，10（10）：270.

[7]Tu L，Liu Z，He X，et al.Over-expression of eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1 correlates with tumor progression and poorprognosis in nasopharyngeal carcinoma[J].Mol Cancer，2010，9（9）：78.

[8]Pan H，Qin WX，Huo KK，et al.Cloning，mapping，and characterization of a human homologue of the yeast longevity assurance gene LAG1[J].Genomics，2001，77（1）：58-64.

[9]裴斐，由江峰，寧鈞宇，等.人腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因TMSG-1單克隆抗體的制備、鑒定及在腫瘤檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].中華病理學(xué)雜志，2005，34（1），15-21.

[10]劉奕龍，曹卡加，馬國(guó)勝，等.廣州市鼻咽癌發(fā)病率和死亡率分析[J].中國(guó)腫瘤.2008，17（7）：563-564.

[11]唐寧，金潔，鄧云，等.人源性長(zhǎng)壽保障基因2通過(guò)與V-ATPase作用抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[J].生理學(xué)報(bào)，2010， 62（3）：196-202.

[12]You H，Jin J，Shu H，et al.Small interfering RNA targeting the subunit ATP6L of proton pump V-ATPase overcomes chemoresistance of breast cancer ceils[J].Cancer Lett，2009， 280（1）：110-119.

[13]Gerdes J，Schwab U，Lemke H，et al.Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation[J].Int J Cancer，1983，31（1）：13-20.

[14]Romero Q，Bendahl PO，Klintman M，et al.Ki67 proliferation in core biopsies versus surgical samples-a model for neo-adjuvant breast cance studies[J].BMC Cancer，2011，11（1）：341.

[15]Yerushalmi R，Woods R，Ravdin PM，et al.Ki67 in breast cancer：prognostic and predictive potential[J].Lancet Oncol，2010，11（2）：174-183.

（收稿日期：2017-08-01 本文編輯：祁海文）endprint