于鐵峰，劉曉靜，張曉玲，郝 鳳(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

氮素對紫花苜蓿根莖葉氮含量及硝酸還原酶活性的影響

于鐵峰，劉曉靜，張曉玲，郝 鳳
(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

采用營養(yǎng)液砂培方法進(jìn)行室內(nèi)盆栽試驗，以紫花苜蓿品種甘農(nóng)3號(Medicagosativacv.Gannong No.3)和隴東苜蓿(Medicagosativacv.Longdong)為材料，比較研究了2種氮素形態(tài)(銨態(tài)氮、硝態(tài)氮)和5個氮素水平(0、105、210、315、420 mg/L)對現(xiàn)蕾期紫花苜蓿各部位氮含量及硝酸還原酶活性(NR)的影響。結(jié)果表明：2種氮素形態(tài)均能顯著提高紫花苜蓿根莖葉中硝態(tài)氮含量，銨態(tài)氮含量、全氮含量及硝酸還原酶活性，且隨著氮水平的提高呈先增大后減小的趨勢，在210 mg/L處理達(dá)峰值。從氮素形態(tài)分析，銨態(tài)氮肥有利于銨態(tài)氮含量的增加，且根莖葉中銨態(tài)氮含量、全氮含量在銨態(tài)氮210 mg/L處理達(dá)到最大值，且顯著高于其他處理；硝態(tài)氮肥有利于硝態(tài)氮含量的增加，且根莖葉中硝態(tài)氮含量、硝酸還原酶活性(NR)在硝態(tài)氮210 mg/L處理達(dá)到最大值，且顯著高于其他處理。各部位中，相同氮素形態(tài)下，根莖葉中銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量、全氮含量及NR活性均表現(xiàn)為葉片>根部>莖部，且甘農(nóng)3號表現(xiàn)優(yōu)于隴東苜蓿?；诮?jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益考慮，銨態(tài)氮210 mg/L是培養(yǎng)紫花苜蓿較好的形態(tài)和水平。

銨態(tài)氮；硝態(tài)氮；紫花苜蓿；硝酸還原酶活性

氮素是作物生長必不可少的營養(yǎng)元素之一，既是作物最重要的結(jié)構(gòu)性元素，又是作物生命代謝中必需的、最活躍的元素，同時也是作物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的重要保障。近年來，人們?yōu)樽非笞魑锏母弋a(chǎn)，氮素的施用量逐年增加，氮素利用率卻沒有隨之提高，在玉米[1]、水稻[2]、小麥[4]、大豆[5]、黃瓜[6]、菠菜[6]等作物上的研究均表明，過量的氮素供應(yīng)并不利于產(chǎn)量的提高及品質(zhì)的提升，這不僅增加成本導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)收益下滑，而且還會污染環(huán)境給生態(tài)效益增加負(fù)擔(dān)，因此，氮素的適宜施用是解決各種問題的根本途徑。植物根系吸收的氮素形態(tài)主要是硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，其對植物的生長及生理特性影響不同，植物吸收、轉(zhuǎn)化、利用不同形態(tài)氮素的能力也不同[7-8]。如水田作物水稻偏愛銨態(tài)氮，而旱地作物甜菜、大豆等則喜好硝態(tài)氮。已研究報道銨態(tài)氮可明顯促進(jìn)水稻的生長，表現(xiàn)在株高、地上部干重的顯著增加[9]。硝態(tài)氮則能明顯促進(jìn)大豆生長及大豆幼苗及籽粒氮含量的提高，改善甜菜的營養(yǎng)品質(zhì)，提高甜菜產(chǎn)糖量[10]。因此，研究氮素形態(tài)對植物的影響，對提高植物產(chǎn)量、改善品質(zhì)有重要作用。硝酸還原酶(NR)是植物體內(nèi)NO3--N同化步驟中的第1個酶，也是整個同化過程的限速酶，在植物氮代謝中起關(guān)鍵作用[11]。因此，NR是反映植物氮代謝能力的重要指標(biāo)。

紫花苜蓿是主要的牧草飼料作物，是現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中重要的植物性蛋白飼料資源，由于營養(yǎng)價值豐富，具有很高的經(jīng)濟(jì)效益，被冠以“牧草之王”的美譽(yù)[12-13]。隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)及奶制品產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，其種植面積逐年增大[14]。紫花苜蓿作為豆科牧草雖可通過共生固氮固定大氣中的無機(jī)氮用于自身生長發(fā)育，但根瘤固定的氮素僅占其一生需氮量的50%～60%[15]，并不能滿足其生長所需，在土壤氮貧瘠的西北地區(qū)，尤其在干旱荒漠化地區(qū)[16]，補(bǔ)充外源氮是生產(chǎn)的必要保證[17]。在以高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)為目的的生產(chǎn)中，要求外源氮既要滿足生產(chǎn)需要又不對共生固氮產(chǎn)生抑制。因此，了解紫花苜蓿對不同形態(tài)、不同水平氮素的吸收、轉(zhuǎn)化響應(yīng)是提高氮肥利用率的有效途徑，同時為紫花苜蓿合理施肥，減少環(huán)境污染提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗品種及菌株

供試品種甘農(nóng)3號(Medicagosativacv.Gannong No.3)，簡寫為G3；隴東苜蓿(Medicagosativacv.Longdong)，簡寫為LD；均來源于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院。

供試菌株中華根瘤菌(12531)菌液，來源于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院。

1.2營養(yǎng)液配置

(1)Fahraeus無氮植物營養(yǎng)液：Na2HPO4·12H2O 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，EDTA-Fe 0.007 5 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KH2PO40.1 g，Gibson 微量元素1 mL，H2O 1 000 mL，pH 6.5～7.0。

(2)Gibson微量元素液：H3BO32.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，CuSO4·5H2O 0.08 g，MnSO4·H2O 1.54 g，Na2MoO4·H2O 1.17 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0[18]。

1.3試驗設(shè)計

試驗于2014年4月11日播種，采用營養(yǎng)液砂培法在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)室外防雨網(wǎng)室進(jìn)行。選用長寬高為20 cm×12 cm×15 cm的花盆，花盆經(jīng)75%酒精消毒后，裝入經(jīng)自來水反復(fù)沖洗多次，在用蒸餾水清洗3次并高壓滅菌的粗砂。種子播種前進(jìn)行滅菌處理，每盆均勻點播50粒滅菌種子，出苗7 d后間苗，每盆保證壯苗25株，然后澆入營養(yǎng)液。根據(jù)前期試驗結(jié)果[19]，試驗設(shè)計包括2個紫花苜蓿品種，2種氮素形態(tài)即：銨態(tài)氮、硝態(tài)氮 ，以不施氮處理為對照(CK)，2種氮素形態(tài)各設(shè)置5個氮素水平(0、105、210、315、420 mg/L)，共9個處理分別表示為，CK、硝態(tài)105、硝態(tài)210、硝態(tài)315、硝態(tài)420、銨態(tài)105、銨態(tài)210、銨態(tài)315、銨態(tài)420，每處理重復(fù)10次，共2×9×10=180 盆，完全隨機(jī)排列。以Fahraeus無氮植物營養(yǎng)液為基本營養(yǎng)液，分別加入Ca(NO3)2和(NH4)2SO4配制所需氮素濃度，并調(diào)節(jié)pH為7，結(jié)合無氮營養(yǎng)液一同施入。

紫花苜蓿出苗7 d后開始澆灌，每次澆灌營養(yǎng)液前用500 mL蒸餾水淋洗花盆2次，以沖走砂基質(zhì)中積累的鹽分，而后澆入各處理營養(yǎng)液250 mL。苜蓿生長至3片復(fù)葉時，每盆均勻接種苜蓿根瘤菌液25 mL?，F(xiàn)蕾期取樣測定各指標(biāo)。

1.4測定指標(biāo)及方法

硝態(tài)氮含量：參照文獻(xiàn)[20]水楊酸法測定；銨態(tài)氮含量參照文獻(xiàn)[21]茚三酮顯色法測定；全氮含量參照文獻(xiàn)[23]用濃H2SO4-H2O2法測定；硝酸還原酶(NR)參照文獻(xiàn)[23]方法測定。

1.5數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理，應(yīng)用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1氮素對苜蓿各器官硝態(tài)氮含量的影響

試驗各施肥處理硝態(tài)氮含量大于CK(P<0.05)，各處理不同器官硝態(tài)氮含量均不同，總體表現(xiàn)為葉片中硝態(tài)氮含量最大，根次之，莖中含量最小。2種氮素形態(tài)下，相同氮水平處理間硝態(tài)氮培養(yǎng)各器官的硝態(tài)氮含量高于銨態(tài)氮培養(yǎng)的，說明適當(dāng)增加營養(yǎng)液中硝態(tài)氮的比例可增加植株體中硝態(tài)氮含量。同一品種中，不同氮形態(tài)，隨供氮水平的增高呈先增加后降低的趨勢，并且均在硝態(tài)氮210 mg/L達(dá)到峰值，除了在甘農(nóng)3號根中，硝態(tài)氮210 mg/L與硝態(tài)氮315 mg/L表現(xiàn)為差異不顯著(P>0.05)外，其他各處理間均表現(xiàn)為硝態(tài)氮210 mg/L顯著高于其他各處理(P<0.05)。2個品種間，最優(yōu)處理硝態(tài)氮210 mg/L下，甘農(nóng)3號紫花苜蓿葉片中硝態(tài)氮含量達(dá)到1 043 μg/g，較對照提高了57%，較隴東苜蓿葉片硝態(tài)氮含量提高了33.9%，說明合理的硝態(tài)氮供應(yīng)能明顯提高葉片硝態(tài)氮含量，不同品種間存在差異(圖1)。

2.2氮素對苜蓿各器官銨態(tài)氮含量的影響

各器官氮含量供氮處理均顯著高于CK(P<0.05)，各器官中，葉片銨態(tài)氮含量最高，表現(xiàn)為葉片>根部>莖部。2個品種均隨不同氮素水平的增加呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，2種氮素形態(tài)表現(xiàn)為銨態(tài)氮素添加更有利于苜蓿葉、莖、根中銨態(tài)氮含量的積累，且在銨態(tài)氮210 mg/L時，2個品種的銨態(tài)氮含量均達(dá)最大值，并顯著高于其他處理(P<0.05)。甘農(nóng)3號苜蓿銨態(tài)氮210 mg/L處理下葉、莖、根銨態(tài)氮含量分別為486，388和424 μg/g，較CK分別增加98.4%，139.5%和122.0%；較隴東苜蓿銨態(tài)氮210 mg/L處理下分別增加了5.0%、9.9%、5.0%(圖2)。說明銨態(tài)氮較硝態(tài)氮更利于苜蓿銨態(tài)氮含量的積累，合理的銨態(tài)氮供應(yīng)能提高苜蓿葉、莖、根中銨態(tài)氮含量，不同品種間存在差異。

圖1 氮素形態(tài)及水平處理下苜蓿各器官硝態(tài)氮含量Fig.1 Effects of nitrogen forms and levels on NO3--N content in various organs of alfalfa

圖2 氮素形態(tài)及水平處理下苜蓿各器官的銨態(tài)氮含量Fig.2 Effects of nitrogen forms and levels on NH4+-N content in various organs of alfalfa

2.3氮素對苜蓿各器官全氮含量的影響

各施氮處理均顯著高于CK(P<0.05)，說明氮素添加可以顯著提高苜蓿全氮含量。2個品種的根、莖、葉中氮素含量不同，均表現(xiàn)為葉片中氮素含量最高，總體表現(xiàn)為葉片>根部>莖部。同水平氮素添加比較，甘農(nóng)3號苜蓿全氮積累量好于隴東苜蓿，2種氮形態(tài)，相同氮水平相比較，除了甘農(nóng)3號葉、根硝態(tài)氮315略高于銨態(tài)氮315外，其他處理均表現(xiàn)為銨態(tài)氮同水平高于硝態(tài)氮同水平。供試品種各硝態(tài)氮與銨態(tài)氮處理隨著氮水平的增加均呈拋物線變化。全氮最高峰值均出現(xiàn)在氮水平為210 mg/L處，并且銨態(tài)氮210 mg/L明顯好于硝態(tài)氮210 mg/L處理，且顯著好于其他各處理(P<0.05)。甘農(nóng)3號苜蓿銨態(tài)氮210 mg/L處理， 其葉、莖、根全氮含量分別為4.34%，2.24%和3.83%，較CK分別增加48.1%，64.7%和77.3%。較隴東苜蓿銨態(tài)氮210 mg/L處理下葉、莖、根增加了3.6%，11.4%和15.0%。說明銨態(tài)氮210 mg/L處理最利于苜蓿全氮積累(圖3)。

圖3 氮素形態(tài)及水平處理下2個紫花苜蓿品種不同部位的全氮含量Fig.3 Effects of nitrogen forms and levels on total nitrogen content in various organs of alfalfa

2.4氮素形態(tài)及水平對苜蓿各器官NR活性的影響

各處理NR活性在供氮處理下均顯著高于CK(P<0.05)，葉片的NR活性高于根、莖器官，其活性順序表現(xiàn)為：葉>根>莖(圖4)。說明供氮能促使苜蓿各器官NR活性提升，且葉片硝酸還原反應(yīng)最強(qiáng)，是最主要的氮同化器官。2品種紫花苜蓿各部位NR活性均隨供氮水平的增高呈先增加后降低的趨勢，甘農(nóng)3號紫花苜蓿NR活性強(qiáng)于隴東苜蓿。2種氮素形態(tài)下，NR活性峰值均在210 mg/L出現(xiàn)。2氮素形態(tài)相比，硝態(tài)氮210 mg/L培養(yǎng)高于銨態(tài)氮210 mg/L，且顯著高于其他處理(P<0.05)。最優(yōu)硝態(tài)氮210 mg/L下，甘農(nóng)3號苜蓿葉、莖、根中NR活性分別為37.4，31.2和36.5 μg/(g·h)，較隴東苜蓿分別增加7.5，11.4和7.7 μg/(g·h)。說明硝態(tài)氮對NR活性影響明顯大于銨態(tài)氮，NR活性除受2種氮素形態(tài)的影響不同外，品種間也存在差異。

圖4 氮素形態(tài)及水平處理下苜蓿各器官的硝酸還原酶活性Fig.4 Effects of nitrogen forms and levels on nitrate reductase activity in various organs of alfalfa

3 討論

氮素是苜蓿生長發(fā)育過程中必須營養(yǎng)元素之一，銨態(tài)氮與硝態(tài)氮是作物吸收利用的主要的氮素形式，不同形態(tài)氮素在各器官的含量可反映作物氮素營養(yǎng)狀況和生理功能的強(qiáng)弱，并不同程度的影響作物品質(zhì)形成[24]。黃展飛等[25]研究表明，施肥對生長期梨葉片銨態(tài)氮變化的影響大于硝態(tài)氮。研究表明，紫花苜蓿各器官硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量在210 mg/L下達(dá)到峰值，且銨態(tài)氮肥利于銨態(tài)氮含量的增加，硝態(tài)氮肥利于硝態(tài)氮含量的增加。從各器官氮含量分析，均表現(xiàn)為葉片>根部>莖部。說明在營養(yǎng)生長階段，紫花苜蓿的葉片是氮累積的中心，根次之。分析原因多是由于各器官對氮素的吸收、轉(zhuǎn)運和利用不同，進(jìn)而造成氮積累的差異。張英鵬等[26]利用水培法研究了不同供氮水平對菠菜硝酸鹽及各器官含量的影響，試驗結(jié)果為葉片氮含量>葉柄氮含量，氮素4～8 mmol/L，葉片硝酸鹽含量呈降低趨勢，與試驗研究基本一致。

紫花苜蓿作為一種重要的植物蛋白飼料，其全氮含量能直接反應(yīng)自身的營養(yǎng)價值，甚至經(jīng)濟(jì)價值，施肥是提升苜蓿營養(yǎng)價值的一項重要技術(shù)[27-28]。研究表明，2種形態(tài)的氮素添加均能增加現(xiàn)蕾期苜蓿根、莖、葉等器官的氮含量，且在210 mg/L下達(dá)最大值。胡華鋒等[29]對黃河灘區(qū)紫花苜蓿的研究也表明，適當(dāng)?shù)牡靥砑涌娠@著提高苜蓿氮含量，尤其是葉、莖器官的氮含量，且隨施氮量增加，苜蓿地上部氮含量呈先增加后降低的趨勢。在試驗中各器官呈現(xiàn)葉片>根部>莖部的規(guī)律；相同的氮水平下，銨態(tài)氮培養(yǎng)要優(yōu)于硝態(tài)氮培養(yǎng)。李燦東等[30]對大豆的研究結(jié)果與此次試驗結(jié)果基本一致。葉片和莖作為家畜采食的主要部位，其氮含量越高，營養(yǎng)價值越高。此次研究中在銨態(tài)氮210 mg/L處理下莖中的全氮含量最高，而葉和根中則在銨態(tài)氮315 mg/L處理最好，但過多的氮素添加會給經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益帶來負(fù)擔(dān)，因此，基于這兩方面考慮，銨態(tài)氮210 mg/L是培養(yǎng)紫花苜蓿較好的形態(tài)和水平。

硝酸還原酶是植物氮代謝的關(guān)鍵酶[31]，其活性對調(diào)節(jié)植物體內(nèi)硝態(tài)氮同化水平和蛋白質(zhì)合成具有重要意義[32-33]。氮素水平是影響NR活性的主要原因之一，杜永成等[34]研究了4個硝態(tài)氮添加水平(N0、60、120、180 kg/hm2)對甜菜NR活性的影響，結(jié)果表明硝態(tài)氮120 kg/hm2可顯著提高甜菜NR活性。張智猛等[2]研究表明，施氮水平明顯影響花生的蛋白含量及NR活性，適量施氮(45～90 kg/hm2)可使花生各營養(yǎng)器官中NR活性提高，尤其氮素水平對花生葉片NR影響較大，對莖和根中活性大小的影響則較小。研究表明，不同氮水平下現(xiàn)蕾期苜蓿各器官NR活性均表現(xiàn)為葉>根>莖，在硝態(tài)氮210 mg/L處理下，NR活性達(dá)到峰值，并顯著高于其他處理(P<0.05)。NR活性與氮素形態(tài)關(guān)系也很密切，試驗表明，紫花苜?，F(xiàn)蕾期，硝態(tài)氮對NR活性影響明顯大于銨態(tài)氮。陳煜等[35]對大豆利用硝態(tài)氮、銨態(tài)氮及混合態(tài)氮對4個大豆品種進(jìn)行氮素誘導(dǎo)處理，結(jié)果表明硝態(tài)氮對提高4個品種NR活性效果最好，銨態(tài)氮的效果較差，與本文研究結(jié)果一致。究其原因可能與NO3-是NR的底物和誘導(dǎo)劑有關(guān)，而NH4+的誘導(dǎo)效果不如NO3-，可能是NH4+作為NO3-兩步還原反應(yīng)的終產(chǎn)物所產(chǎn)生的反饋抑制作用所致[36-37]。

4 結(jié)論

2種氮素形態(tài)顯著提高紫花苜蓿根莖葉中硝態(tài)氮，銨態(tài)氮、全氮含量及硝酸還原酶活性(P<0.05)，而且，隨氮水平的提高呈單峰曲線的變化趨勢，在210 mg/L處理達(dá)峰值。從氮素形態(tài)分析，銨態(tài)氮肥有利于銨態(tài)氮含量的增加，且在210 mg/L處理下，根，莖和葉中銨態(tài)氮、全氮含量達(dá)最大值，顯著高于其他處理(P<0.05)；硝態(tài)氮肥有利于硝態(tài)氮含量的增加，且在210 mg/L處理下，根莖葉中硝態(tài)氮含量、硝酸還原酶活性(NR)達(dá)到最大值，顯著高于其他處理(P<0.05)。從各部位分析，相同氮素形態(tài)下，根莖葉中銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量、全氮含量及NR活性均表現(xiàn)為葉片>根部>莖部，且甘農(nóng)3號表現(xiàn)優(yōu)于隴東苜蓿。基于經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益考慮，銨態(tài)氮210 mg/L是培養(yǎng)紫花苜蓿較好的形態(tài)和水平。

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Effectsofnitrogenonnitrogencontentandnitratereductaseactivityinrootstemandleafofalfalfa

YU Tie-feng,LIU Xiao-jing,ZHANG Xiao-ling,HAO Feng

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofPrataculturalEcosystem,MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-USCenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

The nitrogen content and nitrate reductase activity (NR) in alfalfa organs were studied based on 2 nitrogen forms (nitrate nitrogen and ammonium nitrogen) and 5 nitrogen levels (0,105,210,315,420 mg/L).Two cultivars,Medicagosativacv.Gannong No.3 andMedicagosativacv.Longdong,were selected as materials at squaring stage,and the experiment was conducted outdoors(in flashing net room) using sand culture method.The results showed that the content of NO3--N,the content of NH4+-N and total nitrogen content in root and stem and leaf of alfalfa under two nitrogen treatments were significantly higher (P<0.05),and showed a trend of increased first and then decreased with the increase of nitrogen level,peaked at 210 mg/L.The content of NO3--N,the content of NH4+-N and total nitrogen content in root,stem and leaf of alfalfa under 2 nitrogen treatments were significantly higher (P<0.05),and showed a trend of increased first and then decreased with the increase of nitrogen level,peaked at 210 mg/L.NH4+-N was beneficial to content of NH4+-N,The content of NH4+-N and total nitrogen content reached peak and significantly higher than other treatments (P<0.05) at the NH4+-210;The content of NO3--N and the nitrate reductase activity reached peak and significantly higher than other treatments (P<0.05) at the NO3--210;Analysis of organ,the maximum of the contents of ammonium nitrogen,nitrate nitrogen,total nitrogen and NR were found at leaves,minimum in stem under the same nitrogen form,and Gannong No.3 was better than that of Longdong.Based on the economic benefit and ecological benefit,the NH4+-210 was better.

NH4+-N；NO3--N；alfalfa；nitrate reductase activity

S 541.9

A

1009-5500(2017)05-0014-07

2017-03-08；

2017-03-21

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201403048-8)；國家自然科學(xué)基金項目(31460622)；甘肅省科技支撐項目(1504NKCA003)資助

于鐵峰(1983-)，男，黑龍江省寶清縣人，在讀博士研究生。

E-mail：yutiefeng520@163.com

劉曉靜為通訊作者。