顧蓓蓓 盧勁曄 馬 卉 盧 煒 周偉偉

（1.泰州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇泰州 225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

中性粒細(xì)胞在大腸桿菌感染大鼠乳腺損傷中的作用機(jī)制

顧蓓蓓1盧勁曄2*馬 卉1盧 煒2周偉偉1

（1.泰州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇泰州 225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

36只清潔級(jí)SD懷孕大鼠于產(chǎn)后72h經(jīng)乳頭管灌注2×1012CFU/ml大腸桿菌懸液100μL/側(cè)到第四對(duì)乳腺（兩側(cè)）內(nèi)。分別于灌注前（定義為0h）及灌注后12、24、48和72h（n=6）頸靜脈放血處死動(dòng)物，采集樣品。結(jié)果顯示大腸桿菌誘發(fā)乳腺炎引起細(xì)胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和中性粒細(xì)胞趨化因子（cytokineinduced neutrophil chemoattractant-1，CINC-1）表達(dá)顯著升高，從而促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞（neutrophil，PMN）遷徙及活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的釋放，同時(shí)伴隨著乳腺組織丙二醛（MDA）含量的顯著升高。結(jié)果表明活化的PMN向乳腺組織遷徙是大腸桿菌乳腺炎的主要特征，PMN遷徙至感染部位通過釋放ROS消滅病原菌，同時(shí)也是引起組織損傷的重要原因。

中性粒細(xì)胞；大腸桿菌；乳腺炎；大鼠

乳腺炎在各種乳用家畜甚至是人類普遍存在，奶牛乳腺炎更是頻繁發(fā)生。據(jù)報(bào)道，全世界約有1/3的奶牛罹患有各種類型的乳腺炎，是危害奶牛產(chǎn)業(yè)的一種重要疾病之一。乳腺炎誘發(fā)因素眾多，其中以病原菌感染最為重要，根據(jù)病原來源和傳播方式可分為傳染性病原和環(huán)境性病原兩大類。大腸桿菌是環(huán)境性病原的代表，感染大腸桿菌后常引起急性乳腺炎，并伴隨局部和全身癥狀[1]。近年來大腸桿菌乳腺炎發(fā)病率有升高的趨勢(shì)，特別是在一些飼養(yǎng)管理水平較高的發(fā)達(dá)國(guó)家，接觸性乳腺炎有所控制，而大腸桿菌乳腺炎在臨床型乳腺炎中的發(fā)病率有所增加。大腸桿菌多在干乳期感染乳腺（干乳后兩周到產(chǎn)前兩周是最易感期），而在分娩后兩周內(nèi)表現(xiàn)出臨床癥狀，圍產(chǎn)期乳腺感染的易感性（IMI）明顯升高，可能與圍產(chǎn)期先天免疫防御系統(tǒng)受到抑制密切相關(guān)[2]。治療和預(yù)防圍產(chǎn)期的大腸桿菌乳腺炎已成為目前奶牛業(yè)面臨的主要挑戰(zhàn)之一。

機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)有非特異性和特異性兩套防御機(jī)制，非特異性防御機(jī)制的發(fā)揮依賴和病原微生物持續(xù)性作用，并且其殺傷效果取決于微生物的種類[2]。在乳腺防御體系中，組成型的防御機(jī)制主要有物理屏障（乳腺上皮屏障）、乳腺內(nèi)的防御細(xì)胞（包括各種粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞）和體液中的抗菌酶、溶菌酶等?，F(xiàn)有的研究證實(shí)活化的中性粒細(xì)胞（PMN）作為非特異性細(xì)胞免疫系統(tǒng)的成分之一，在乳腺炎的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用。致病菌入侵乳腺后在趨化因子的作用下血液中大量的PMN激活并向乳腺組織遷移，通過釋放大量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）殺滅病原微生物，ROS是分子氧在還原過程中的一系列代謝中間產(chǎn)物，主要包括O2-、H2O2、HOCl、·OH等[3]。在對(duì)一些胞內(nèi)感染菌的研究中發(fā)現(xiàn)，ROS的產(chǎn)生對(duì)清除胞內(nèi)微生物是必需的，但持續(xù)過度激活，產(chǎn)生過量氧化劑超過局部抗氧化劑的防御反應(yīng)時(shí)，能降解蛋白多糖，減少細(xì)胞外基質(zhì)與乳腺上皮的粘附性，引起乳腺上皮細(xì)胞死亡、脫落和泌乳功能的損傷[4]。因此深入了解PMN在宿主抗乳腺感染過程中的作用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌

乳腺炎致病菌大腸桿菌（Escherichial coli）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院泌乳生化教研室提供。大腸桿菌經(jīng)肉湯培養(yǎng)基復(fù)壯后在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板分離成單個(gè)菌落，實(shí)驗(yàn)前挑取單個(gè)菌落于肉湯培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h，無菌取100μL均勻涂抹在瓊脂糖平板上，37℃培養(yǎng)24h后刮取菌苔，溶解于滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中，3000rpm離心10min，連續(xù)3次，用平板稀釋計(jì)數(shù)法調(diào)整濃度至2×1012CFU/ml。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只清潔級(jí)懷孕SD大鼠，購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。產(chǎn)后72h誘發(fā)試驗(yàn)性乳腺炎，經(jīng)乳頭管注入2×1012CFU/ml大腸桿菌懸液100μL/側(cè)到大鼠第四對(duì)乳腺（兩側(cè)）內(nèi)。分別于灌注前（定義為0h）及灌注后12、24、48、72h（n=6）頸靜脈放血處死動(dòng)物，收集血清、肝素抗凝血及乳腺組織用于后續(xù)分析。

1.3 主要試劑及儀器

TRIzol購自Invitrogen公司；RNA酶抑制劑、隨機(jī)引物、M-MLV、dNTPs購自Promega公司、SYBR? Green PCR Master Mix購自Toyobo公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購于南京建成生物工程研究所；乙酸肉豆蔻佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、雙氫羅丹明（dihydrorhodamin，DHR 123）購自Sigma公司。

UV755B型分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯BH2），組織勻漿器（瑞士Kinematica AG），核酸濃度測(cè)定儀（德國(guó)Eppendorf Biophotometer），熒光定量PCR儀（ABI Prism 7300），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences）。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 熒光定量PCR檢測(cè)乳腺組織細(xì)胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、中性粒細(xì)胞趨化因子（cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1，CINC-1）mRNA表達(dá)TRIzol試劑盒提取總RNA，用隨機(jī)引物同時(shí)對(duì)所有樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建立各樣品的cDNA。用所有待測(cè)RT產(chǎn)物的混合樣對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)條件為95℃ 1min預(yù)變性；95℃20s，62℃30s，72℃20s，重復(fù)45個(gè)循環(huán)?；蛞飬⒖家寻l(fā)表的文獻(xiàn)。數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct法。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.4.2 乳腺組織與血清中MPO、MDA的測(cè)定

乳腺組織：準(zhǔn)確稱取1g乳腺組織加入生理鹽水6ml，冰浴勻漿后于3000rpm 4℃離心30 min，吸取上清液，分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

血清：大鼠采集血液后4℃過夜，待完全凝固后，3000rpm離心10min，吸取上清液，分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

MDA活性按試劑盒說明書操作。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血PMN活性氧釋放

100μL全血加入終濃度為100ng/ml PMA刺激PMN，同時(shí)設(shè)無PMA刺激對(duì)照（等量PBS代替PMA）；37℃ 15min后加入DHR123工作液，終濃度為5μmol/L，37℃孵育10min；裂解紅細(xì)胞，0.01mol/L、pH7.2 PBS洗滌兩次并重懸于PBS中，混勻后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，依次檢測(cè)無刺激對(duì)照和PMA刺激樣品，每個(gè)樣品獲取10000個(gè)細(xì)胞，重復(fù)三次，結(jié)果以平均熒光強(qiáng)度給出。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0方差分析程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺組織ICAM-1和CINC-1 mRNA表達(dá)的變化

圖2-1 乳腺組織ICAM-1和CINC-1 mRNA表達(dá)的變化

試驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺組織中ICAM-1和CINC-1 mRNA相對(duì)表達(dá)在乳腺灌注大腸桿菌后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著升高（P ＜0.05）。ICAM-1 mRNA表達(dá)第72h盡管仍顯著高于0h，但與48h相比明顯下降。CINC-1 mRNA表達(dá)趨勢(shì)相同，灌注后第48h已開始急劇下降。

2.2 外周血中性粒細(xì)胞活性氧釋放的動(dòng)態(tài)變化

圖2-2 外周血中性粒細(xì)胞活性氧釋放的動(dòng)態(tài)變化

大腸桿菌灌注乳腺后12、24、48h外周血PMN活性氧釋放均顯著升高（P ＜0.05），峰值出現(xiàn)在第24h，第72h已恢復(fù)至正常水平。

2.3 乳腺組織和血清中MDA水平

圖2-3 大鼠血清和乳腺組織中MPO活性的變化

誘導(dǎo)乳腺炎后12、24和48h，乳腺組織中MDA水平顯著升高，峰值出現(xiàn)在第24h，到72h基本恢復(fù)至正常水平。血清中MDA水平在第24h顯著升高，其他時(shí)間點(diǎn)與0h相比差異不顯著。

3 討論

作為機(jī)體最大的外分泌腺，乳腺在進(jìn)化、發(fā)育和泌乳再構(gòu)建的過程中時(shí)刻面臨著病原微生物的侵襲。乳腺感染在各種乳用家畜甚至是人類（尤其是發(fā)展中國(guó)家）普遍存在，奶牛乳腺炎更是頻繁發(fā)生，是制約奶牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要疾病之一，每年因乳腺炎造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)350億美元。

大量循環(huán)血液中的PMN在病原微生物或其他活性分子的作用下向乳腺組織遷徙，是乳腺炎發(fā)生時(shí)的重要特征。已有研究表明，細(xì)菌入侵后通過激活NF-κB/AP-1刺激單核、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種趨化因子促進(jìn)吞噬細(xì)胞如PMN的趨化[5]。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族的成員，廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞表面，在細(xì)胞間的相互作用以及白細(xì)胞粘附聚集中起著重要作用[6]。CINC-1則是炎癥發(fā)生時(shí)一種重要的趨化因子，能促進(jìn)吞噬細(xì)胞遷徙，對(duì)PMN有激活作用，可以誘導(dǎo)其變形、趨化、脫顆粒、合成生物活性脂類、整合素上調(diào)以及呼吸爆發(fā)等[7]。試驗(yàn)結(jié)果表明大腸桿菌誘導(dǎo)試驗(yàn)性乳腺炎后乳腺組織中的ICAM-1和CINC-1表達(dá)顯著升高，表明細(xì)菌入侵后通過表達(dá)促炎因子和趨化因子，誘導(dǎo)PMN趨化進(jìn)入病灶發(fā)揮吞噬活性。

PMN是機(jī)體抵抗感染的主要非特異性防御細(xì)胞，PMN進(jìn)入病灶通過釋放ROS清除病原微生物，在對(duì)一些胞內(nèi)感染菌的研究中發(fā)現(xiàn)，ROS的產(chǎn)生對(duì)清除胞內(nèi)微生物是必需的[8]，本研究結(jié)果顯示，大腸桿菌灌注乳腺后ROS顯著升高，表明ROS是宿主抵御乳腺感染的主要效應(yīng)分子。但是過度釋放的高毒性ROS在殺滅病原微生物的同時(shí)會(huì)損傷組織細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示ROS釋放的峰值伴隨著MDA的顯著增加，MDA作為脂質(zhì)過氧化代謝的產(chǎn)物，其水平高低間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。大腸桿菌灌注后第12、24、48h乳腺組織中MDA含量急劇升高，第24h達(dá)到峰值，第72h恢復(fù)至正常水平。

4 小結(jié)

病原微生物或其他活性分子刺激乳腺組織后，在趨化因子的作用下，循環(huán)血液中的PMN向乳腺組織遷徙，釋放活性氧消滅病原微生物，但亦是引起乳腺組織的損傷的主要原因。因此如何迅速的啟動(dòng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，促進(jìn)PMN等效應(yīng)細(xì)胞第一時(shí)間遷徙至病灶組織發(fā)揮吞噬效應(yīng)，并迅速從乳腺腺泡清除是乳腺炎防控的根本所在。本研究深入探討了宿主識(shí)別和清除乳房致病因子感染的天然免疫機(jī)制，為臨床上乳腺炎的免疫調(diào)控及防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

[1]Shlomo E.B.，Elimelech D.H.，Gabriel L.Long term effects of Escherichia coli mastitis[J].Vet J，2014，（201）：72-77.

[2]Steven M.G.H.，Spiegeleer B.D.，Peelman L，Boulougouris X.J.A.，et al.Compromised neutrophil function and bovine E. coli mastitis：is C5a the missing link?[J].Vet Immunol Immunop，2012，（149）：151-156.

[3]Gu BB，Zhu YM，Zhu W，et al.Retinoid protects rats against neutrophil-induced oxidative stress in acute experimental mastitis[J].Int Immunopharmacol，2009，（9）：223-229.

[4]Zhao X，Lacasse P.Mammary tissue damage during bovine mastitis：cause and control[J].J Anim Sci，2008，（86）：57-65.

[5]Fonseca I，Silva P V，Lange C C，et al.Expression profile of genes associated with mastitis in dairy cattle[J].Genet Mol Biol，2009，32（4）：776-781.

[6]Li R J，Meng Z Q，Xie J F.Effects of sulfyr dioxide on the expressions of MUC5AC and ICAM-1 in airway of asthmatic rats[J].Regul Toxicol Pharm，2007，（48）：284-291.

[7]Stillie R，F(xiàn)arooq S M，Gordon J R，et al.The functional significance behind expressing two IL-8 receptor types on PMN[J].J Leukocyte Biol，2009，（86）：529-543.

[8]Lauzon K，Zhao X，Bouetard A，et al.Antioxidants to prevent bovine neutrophil-induced mammary epithelial cell damage[J].J Dairy Sci，2005，（88）：4295-4303.

江蘇省自然科學(xué)基金面上研究項(xiàng)目（編號(hào)：BK20151354）；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院科研課題（編號(hào)：NSF201609）；江蘇省現(xiàn)代畜牧與新獸藥工程技術(shù)中心開放課題（編號(hào)：TGC2XKF1402）；江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程項(xiàng)目（PPZY2015C230）。

顧蓓蓓（1983—），江蘇興化人，博士，研究方向：乳腺炎的營(yíng)養(yǎng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究。

盧勁曄（1983—），江蘇邗江人，博士。