王向林

（內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古赤峰 024000）

胎兒彎桿菌的幾種檢測(cè)方法

王向林

（內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古赤峰 024000）

胎兒彎桿菌屬于彎桿菌屬的成員，包括胎兒彎桿菌胎兒亞種和性病亞種。自McFadyean等（1913）從流產(chǎn)綿羊的陰道分泌物中分離到弧菌樣微生物以來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者己對(duì)胎兒彎桿菌進(jìn)行大量研究，發(fā)現(xiàn)胎兒彎桿菌呈世界性分布，是危害人或動(dòng)物健康的重要病原微生物之一。胎兒彎桿菌胎兒亞種致綿羊流產(chǎn)和牛的散發(fā)性流產(chǎn)，性病亞種可致牛流產(chǎn)和不育. 也可感染人引致流產(chǎn)、早產(chǎn)、敗血癥以及類似布魯菌病的癥狀，尤其是患有免疫缺陷癥的人，感染胎兒彎桿菌后能引起腦膜炎、菌血癥、關(guān)節(jié)炎、腹瀉等疾病。胎兒彎桿菌嚴(yán)重威脅著人類的健康并給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)于該菌的檢測(cè)鑒定就尤為重要。

胎兒彎桿菌；鑒定；檢測(cè)

之前，國(guó)內(nèi)對(duì)于胎兒彎桿菌病的診斷方法主要依賴于生化實(shí)驗(yàn)，例如硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)以及1%甘氨酸生長(zhǎng)試驗(yàn)等。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，目前主要采用PCR方法，DNA指紋印跡，脈沖場(chǎng)凝膠電泳，ELISA等方法對(duì)胎兒彎桿菌進(jìn)行鑒定。本文將對(duì)胎兒彎桿菌現(xiàn)有的幾種檢測(cè)方法進(jìn)行闡述說明。

1 胎兒彎桿菌鑒定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

（1）篩選鑒定：將典型或可疑純培養(yǎng)物做革蘭氏染色，濕涂片動(dòng)力觀察、氧化酶試驗(yàn)及過氧化氫酶試驗(yàn)。胎兒彎桿菌為革蘭氏陰性，呈螺旋狀或“S’狀，一些老齡培養(yǎng)物可出現(xiàn)球狀或球桿狀，不形成芽孢和夾膜，在菌體的一端或兩端有鞭毛，呈特征性快速螺旋狀穿梭運(yùn)動(dòng)。氧化酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性。

（2）生化試驗(yàn)：將上述篩選鑒定出的純培養(yǎng)物按表1進(jìn)行生化試驗(yàn)，所有生化試驗(yàn)管均于混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)3d。

（3）結(jié)果判定：根據(jù)上述兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。凡符合胎兒彎桿菌一般特征的細(xì)菌，按表1的生化反應(yīng)特征進(jìn)一步判定是否為“胎兒彎桿菌胎兒亞種”或“胎兒彎桿菌性病亞種”，在判定亞種時(shí)，在表1的生化反應(yīng)中，有一項(xiàng)不符合均判定為非胎兒彎桿菌。

2 PCR方法檢測(cè)鑒定胎兒彎桿菌

Masaki Fujita等用內(nèi)切酶SalI和SmaI分別酶切21株胎兒彎桿菌的基因組DNA，利用脈沖電場(chǎng)凝膠電泳獲得它們的指紋圖譜，然后分析各菌株間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為研究胎兒彎桿菌的流行病學(xué)研究提供了方便。I.V.Wesley等利用胎兒彎桿菌的16SRNA的基因序列的高變區(qū)，設(shè)計(jì)了2個(gè)寡核昔酸探針（5'-CTC AAC TTTCTA GCA AGCT AGC ACT CTC T-3'和5'-CTCA ACT TTC TAC CAA G-3'），用于檢測(cè)57株胎兒彎桿菌，并用Southem雜交法證明這兩個(gè)探針具有檢測(cè)胎兒彎桿菌的特異性。和傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，核酸探針檢測(cè)胎兒彎桿菌具有快速、特異、敏感的特點(diǎn)。

3 ELISA方法檢測(cè)胎兒彎桿菌

3.1 國(guó)外的ELISA檢測(cè)方法

Brooks等在2004年以單克隆抗體為基礎(chǔ)利用ELISA方法用來檢測(cè)胎兒彎桿菌牛包皮清洗物和陰道分泌物樣本，以此作為檢測(cè)胎兒彎桿菌的推定篩選試驗(yàn)。他們總共檢測(cè)了725份是從各地收集的診斷樣品通過增菌運(yùn)輸培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用分離培養(yǎng)的胎兒彎桿菌作為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)樣品在增菌運(yùn)輸培養(yǎng)基上通過4～5d的培養(yǎng)后用作ELISA檢測(cè)。以?shī)A心ELISA方法作為檢測(cè)的主要方法，其主要抗原為胎兒彎桿菌脂多糖。以兔抗胎兒彎桿菌的血清作為捕獲抗體，利用抗胎兒彎桿菌脂多糖核心蛋白B及O和毒素A的單抗與標(biāo)記的山羊抗鼠辣根過氧化物酶作為診斷抗體。ELISA結(jié)果顯示有708份樣品為胎兒彎桿菌陰性，有17份樣品為陽(yáng)性，這與增菌運(yùn)輸培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定的結(jié)果完全一致。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ELISA方法在胎兒彎桿菌臨床樣品的檢測(cè)中起到非常重要的作用，單克隆抗體用于檢測(cè)胎兒彎桿菌時(shí)具有很高的特異性，可作為鑒定胎兒彎桿菌的潛在性免疫診斷試劑。

3.2 國(guó)內(nèi)的ELISA檢測(cè)方法

趙海玲等對(duì)胎兒彎桿菌的毒力起重要作用的表面蛋白基因SapA為研究對(duì)象，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出基因片段SapA-N（1398bp）和SapA-C（1422bp），在大腸桿菌中表達(dá)并對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化和抗原活性的比較研究。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用胎兒彎桿菌表面蛋白SapA-N作為抗原建立一種能快速有效地檢測(cè)胎兒彎桿菌病的間接ELISA方法，為監(jiān)測(cè)疫情和研究該病病原的特性提供良好方法。在上述研究基礎(chǔ)上以重組表達(dá)的胎兒彎桿菌桿菌表面蛋白rSapA-N免疫小鼠，利用細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體，經(jīng)過亞克隆后得到了2株雜交瘤細(xì)胞。利用獲得的單克隆抗體鑒定胎兒彎桿菌毒力因子表面蛋白，為建立胎兒彎桿菌快速鑒定方法奠定了基礎(chǔ)。

表 1 胎兒彎桿菌生化反應(yīng)

[1]靖吉強(qiáng).胎兒彎桿菌PCR檢測(cè)方法的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2000.