李明潔，楊波，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

長(zhǎng)雙歧桿菌是在人體腸道微生物群中最廣泛存在的一種雙歧桿菌[1]，具有防治便秘[2]、抑制腸道致病菌[3]、調(diào)節(jié)腸道平衡、降低膽固醇[4]、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、延緩衰老[5]和增強(qiáng)機(jī)體免疫活性[6-7]等生理功能。長(zhǎng)雙歧桿菌可分為3個(gè)亞種，即長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種、長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種和長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種[8]，這3個(gè)亞種在生理生化特性以及遺傳進(jìn)化方面十分相近，常用的16S rRNA菌種鑒定的方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)這3個(gè)亞種的區(qū)分[9-10]。目前多使用全基因組測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[11-13]、PCR-RFLP[14]、PCR-DGGE[15]、多位點(diǎn)序列分析(MLSA)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(AFLP)[16]、多位點(diǎn)測(cè)序分型(MLST)[17]等方法來(lái)區(qū)分不同亞種，但這些方法過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高。《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中記錄了長(zhǎng)雙歧桿菌的不同亞種對(duì)碳水化合物利用能力存在顯著差異，這或許可作為區(qū)分不同亞種的依據(jù)。此外，利用基因型差異來(lái)區(qū)分亞種的方法也更加可靠，已有研究者嘗試采用特異性基因擴(kuò)增的方法進(jìn)行一些細(xì)菌的亞種區(qū)分，該方法過(guò)程簡(jiǎn)單、快速，但需要找到能夠可靠區(qū)分不同亞種的特異性基因[18-21]。

因此，本研究擬利用碳水化合物利用譜測(cè)定、特異性基因擴(kuò)增等手段，確認(rèn)一種有效、快速、低成本的區(qū)分方法，以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)雙歧桿菌的亞種區(qū)分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

本文所用54株長(zhǎng)雙歧桿菌,均保存于江南大學(xué)食品生物技術(shù)研究中心菌種庫(kù)(表1)。其中ATCC15697為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種，13株已測(cè)定了基因組但亞種未知，其余40株亞種未知且無(wú)基因組序列。

表1 本文所用長(zhǎng)雙歧桿菌Table 1Bifidobacterium longum in this study

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

不同碳水化合物替代葡萄糖的培養(yǎng)基：用不同的碳水化合物(終質(zhì)量濃度為10 g/L)替代mMRS培養(yǎng)基中的葡萄糖，并添加0.5%溴甲酚紫母液15 mL/L；

作為陰性對(duì)照培養(yǎng)基：mMRS培養(yǎng)基添加0.5%溴甲酚紫母液15 mL/L；

2×Taq Plus MasterMix,康為世紀(jì)生物科技有限公司；GeneRuler DNA Ladder Mix,英濰捷基；HGV-Ⅱ核酸染液,北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；瓊脂糖,生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AW500SG型Electrotek厭氧工作站，英國(guó)依萊泰科；GR60DA立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，致微(廈門(mén))儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；C1000 TouchTM型基因擴(kuò)增儀，美國(guó)Bio-Rad公司；DYCP-31DN/DYCP-32B水平電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Gel DocTMEZ imager凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

采用orthomclV2.0.9軟件對(duì)不同菌株的直系同源基因進(jìn)行分析[22-23]，根據(jù)同源基因分析結(jié)果，提取所有菌株的直系同源基因序列，利用mafft-7.313軟件對(duì)不同菌株的直系同源基因進(jìn)行序列比對(duì)[22,24]，基于序列比對(duì)結(jié)果，進(jìn)行進(jìn)化分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.2 菌株的活化

將保藏于甘油中的菌株劃線至mMRS固體培養(yǎng)基37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，后挑取單菌落接種至5 mL mMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，液體連續(xù)活化2代。

通過(guò)實(shí)地調(diào)查研究表明，寧德市蕉城區(qū)水利風(fēng)景區(qū)解說(shuō)系統(tǒng)還處于初步原始階段，游客中心都尚未建成，入口標(biāo)志，區(qū)域地圖，指示牌，警示牌等解說(shuō)牌示缺乏，并且存在一定問(wèn)題，可歸納如下：

1.3.3 碳水化合物利用能力比較

將200 μL不同碳水化合物替代葡萄糖的培養(yǎng)基和陰性對(duì)照的培養(yǎng)基分裝于無(wú)菌96孔板中，分別接種2次活化后的2 μL菌液至96孔中，每個(gè)菌每種碳水化合物測(cè)2個(gè)平行孔，培養(yǎng)48 h后觀察孔板中培養(yǎng)基顏色變化及菌株生長(zhǎng)情況。碳水化合物利用能力比較實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍測(cè)定。

1.3.4 不同亞種的特異性基因分析

本文所有引物信息如表2所示。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Taq MasterMix 10 μL，ddH2O 8 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性35 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，從變性到延伸需要重復(fù)30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃補(bǔ)充延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像分析儀中觀察條帶情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次確保引物具有良好的重復(fù)性。

表2 PCR引物Table 2 PCR primers

1.3.5 長(zhǎng)雙歧桿菌菌株的亞種確認(rèn)

利用亞種特異性引物對(duì)40株亞種未知的長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后條帶情況區(qū)分長(zhǎng)雙歧桿菌的不同亞種。并選擇擴(kuò)增結(jié)果為嬰兒亞種的菌株送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行基因組草圖掃描，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以驗(yàn)證其為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種。

2 結(jié)果與分析

2.1 13株已測(cè)基因組菌株的亞種確認(rèn)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取已確認(rèn)亞種的長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種、長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種、長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種菌株的基因組序列(各10個(gè))，與本團(tuán)隊(duì)前期已測(cè)全基因組但尚未確認(rèn)亞種的13株長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行直系同源基因分析，共獲得核心基因941個(gè)，基于這些核心基因，構(gòu)建了43株菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。

圖1 基于43株長(zhǎng)雙歧桿菌核心基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of 43 Bifidobacterium longumbased on core genes注：“■”為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種；“▲”為長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種；“●”為長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種；“★”為已測(cè)定全基因組但尚未確認(rèn)亞種的長(zhǎng)雙歧桿菌。

結(jié)果顯示，30株長(zhǎng)雙歧桿菌不同亞種分別位于不同分支上，而本團(tuán)隊(duì)前期已測(cè)基因組的13株菌分別屬于3個(gè)不同亞種，其中7株是長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種、5株為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種、1株為長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種。

2.2 不同長(zhǎng)雙歧桿菌碳水化合物利用能力比較

根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[25-26]選擇了長(zhǎng)雙歧桿菌不同亞種利用能力存在顯著差異的6種碳水化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，包括阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖醛酸鈉、甘露糖和巖藻糖，以進(jìn)一步確認(rèn)長(zhǎng)雙歧桿菌不同亞種碳水化合物利用譜差異。

結(jié)果顯示，所測(cè)定的長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種、長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種、長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種共14株菌利用不同碳水化合物產(chǎn)酸能力存在差異(表3)。3個(gè)亞種均可利用核糖和巖藻糖；長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種和長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種不能利用葡萄糖醛酸鈉，而長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種FHeNJZ44M8、M2-03-F02-27和ATCC15697三株菌可利用葡萄糖醛酸鈉，其余3株卻不能利用；長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種中除FGZ16I1M5外，均可利用阿拉伯糖和木糖產(chǎn)酸。同一亞種的菌株利用同一種碳水化合物的能力存在差異，故根據(jù)不同碳水化合物利用能力的差異難以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)雙歧桿菌不同亞種的區(qū)分。

表3 長(zhǎng)雙歧桿菌不同亞種的碳水化合物利用比較Table 3 Carbohydrate utilization capacity of differentBifidobacterium longum strains

注：“+”代表菌株利用該碳水化合物產(chǎn)酸；“-”代表菌株未利用該碳水化合物產(chǎn)酸。

2.3 不同亞種的特異性基因分析

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道選擇了9個(gè)亞種特異性基因(表2)，對(duì)14株亞種確認(rèn)的長(zhǎng)雙歧桿菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以評(píng)價(jià)這個(gè)特異性基因的有效性。MarR基因是長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種的特異性基因，理論擴(kuò)增條帶為168 bp，但7株長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種的擴(kuò)增結(jié)果顯示，僅CCFM762(圖2-b)、CCFM756(圖2-g)可成功擴(kuò)增出168 bp的條帶，其余長(zhǎng)亞種菌株無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物；TerB基因的擴(kuò)增結(jié)果也類似，僅CCFM685(圖2-c)、CCFM686(圖2-d)和FGZ16I1M5(圖2-f)可擴(kuò)增出正確大小的條帶(156 bp)，其余長(zhǎng)亞種菌株均沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，因此，這2個(gè)基因無(wú)法用于長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種的區(qū)分。盡管所有長(zhǎng)亞種菌株可擴(kuò)增出Sugarkinase基因(圖2)，嬰兒亞種菌株也不能擴(kuò)增出該基因(圖3)，但豬亞種同樣擴(kuò)增出該基因(圖4)，因此，該基因也無(wú)法區(qū)分長(zhǎng)亞種和豬亞種，但可用于長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種的確認(rèn)。所有長(zhǎng)亞種菌株(圖2)和豬亞種菌株(圖4)可擴(kuò)增出長(zhǎng)亞種Tuf基因，而嬰兒亞種菌株(圖3)也可擴(kuò)增出條帶，該基因無(wú)法快速區(qū)分不同亞種。

a～g- FGZ6I1M6、CCFM762、CCFM685、CCFM686、CCFM752、FGZ16I1M5、CCFM756圖2 長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種菌株P(guān)CR電泳結(jié)果Fig.2 PCR electrophoresis results of B. longumsubsp. longum注：M- DNA Marker；1～9表示分別用MarR、TerB、lon、Blo、Glyoxalase、ABC、inf、Binf、Serine引物擴(kuò)增。下同。

a～f- M2-03-F02-27、FHeNJZ44M8、ATCC15697、GZ17I1M1、GZ19I1M3、GZ23I1M2圖3 長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種菌株P(guān)CR電泳結(jié)果Fig.3 PCR electrophoresis results of B. longumsubsp. infantis

圖4 長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種菌株P(guān)CR電泳結(jié)果Fig.4 PCR electrophoresis results of B. longum subsp. suis

Glyoxalase基因是長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種的特異性基因，理論擴(kuò)增條帶為168 bp，但6株長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種的擴(kuò)增結(jié)果顯示，只有ATCC15697(圖3-c)可擴(kuò)增出168 bp的條帶，其余嬰兒亞種菌株沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物；ABC基因的結(jié)果也類似，M2-03-F02-27(圖3-a)沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，因此，這2個(gè)基因無(wú)法用于長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種的區(qū)分。Sialidase基因的擴(kuò)增結(jié)果顯示，僅長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種菌株可成功擴(kuò)增得到正確大小的條帶(圖3)，而長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種(圖2)和長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種(圖4)均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，因此，Sialidase基因可用于長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種的快速區(qū)分。嬰兒亞種Tuf基因是長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種的特異性基因，該基因理論擴(kuò)增條帶為123 bp，但所用14株菌的擴(kuò)增結(jié)果顯示，長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種FGZ6I1M6(圖2-a)、CCFM685(圖2-c)、CCFM756(圖2-g)和長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種菌株(圖3)均可以擴(kuò)增出100 bp左右的條帶，因此，該基因的區(qū)分效果同樣不佳。而豬亞種的特異性基因Serine，理論擴(kuò)增條帶為166 bp，但擴(kuò)增結(jié)果顯示，CCFM688(圖4)沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒于菌株數(shù)量太少，還需進(jìn)一步確認(rèn)。

為了解析不同基因擴(kuò)增效果的差異，進(jìn)一步利用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)來(lái)分析引物的特異性(表4)。結(jié)果顯示，MarR和TerB的引物只能擴(kuò)增出長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種菌株，但擴(kuò)增出的菌株數(shù)較少，說(shuō)明基因的特異性過(guò)強(qiáng)，可能不能廣泛區(qū)分長(zhǎng)亞種；Sugarkinase和長(zhǎng)亞種Tuf基因的引物可擴(kuò)增出長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種和豬亞種，也就解釋了這兩個(gè)基因均無(wú)法實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)亞種和豬亞種的區(qū)分的原因，且長(zhǎng)亞種Tuf基因可擴(kuò)增出多個(gè)不同大小的片段；基因Glyoxalase和基因ABC Primer-BLAST只能擴(kuò)增出部分長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種，基因的特異性較強(qiáng)，不能廣泛用于區(qū)分嬰兒亞種；Sialidase基因可擴(kuò)增出全部長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種，基因的特異性較好；嬰兒亞種Tuf基因可擴(kuò)增出全部長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種，但可擴(kuò)增出多個(gè)不同大小的片段；基因SerinePrimer-BLAST只能擴(kuò)增出部分長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種，無(wú)法實(shí)現(xiàn)豬亞種的區(qū)分。

表4 特異性基因Primer-BLAST結(jié)果Table 4 The Primer-BLAST results of specific genes

注：表中數(shù)字為引物擴(kuò)增出的菌株數(shù)占該亞種菌株總數(shù)的比例；“-”表示引物未擴(kuò)增出該亞種菌株。

綜上可知，長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種糖激酶基因和長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種唾液酸酶基因可有效實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種與其他兩亞種的區(qū)分，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后條帶的有無(wú)及大小初步實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種的區(qū)分。若嬰兒亞種唾液酸酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后產(chǎn)生234 bp左右的條帶且長(zhǎng)亞種糖激酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后無(wú)條帶產(chǎn)生，則該菌株可初步確認(rèn)為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種。

2.4 長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種的確認(rèn)

采用上述區(qū)分效果較好的長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種糖激酶基因和長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種唾液酸酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)40株亞種未知的長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，電泳后的條帶結(jié)果顯示，HeNJZ8M1、FJND16M4、JSSZ7M7、FHuNCS6M8和JSYC2M1共5株菌為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種，其余35株菌均為長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種或豬亞種(圖5)。

圖5 40株長(zhǎng)雙歧桿菌PCR電泳結(jié)果Fig.5 PCR electrophoresis results of40 Bifidobacterium longum

為進(jìn)一步驗(yàn)證目前所確認(rèn)亞種的準(zhǔn)確性，從5株新確認(rèn)的長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種中隨機(jī)選擇了4株，即HeNJZ8M1、FHuNCS6M8、FJND16M4、JSSZ7M7寄送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行基因組草圖測(cè)序。并將上述4株菌與圖1中43株菌合并進(jìn)行同源基因分析，共獲得938個(gè)核心基因?；谶@些核心基因，構(gòu)建了該47株菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6)。結(jié)果顯示，經(jīng)特異性基因擴(kuò)增確認(rèn)為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種的4株菌(HeNJZ8M1、FHuNCS6M8、FJND16M4和JSSZ7M7)確為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種，進(jìn)一步證實(shí)了基于長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種糖激酶基因和長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種唾液酸酶基因的特異性擴(kuò)增可有效實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種的快速區(qū)分。

圖6 基于47株長(zhǎng)雙歧桿菌核心基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of 47 Bifidobacteriumlongum based on core genes注：“■”長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種；“▲”長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種；“●”長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種；“★”新確認(rèn)的長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種。

3 結(jié)論

本研究對(duì)13株已測(cè)定基因組的長(zhǎng)雙歧桿菌經(jīng)生物信息學(xué)分析確認(rèn)了亞種，其中7株為長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種，5株為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種，1株為長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種。對(duì)亞種確認(rèn)的長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行了碳水化合物利用譜比較，但碳水化合物利用譜難以實(shí)現(xiàn)不同亞種的區(qū)分。后采用特異性基因擴(kuò)增的方法確認(rèn)了長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種糖激酶基因和長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種唾液酸酶基因可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種的快速區(qū)分，并采用這對(duì)特異性基因從40株長(zhǎng)雙歧桿菌中成功確認(rèn)了5株長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種，其余35株菌均為長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種或豬亞種，隨機(jī)選擇4株進(jìn)行全基因組草圖測(cè)序，進(jìn)一步分析證實(shí)確為長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種。遺憾的是，因長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種可用菌株數(shù)量極少，長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種和長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種的快速區(qū)分仍有待進(jìn)一步完善。