丁澤紅+付莉莉+黃猛+顏彥+鐵韋韋+張家明+胡偉

摘要：對(duì)從木薯Ku50葉片中克隆的1個(gè)P5CS基因MeP5CS1進(jìn)行聚乙二醇（PEG）、脫落酸（ABA）、鹽脅迫下的表達(dá)分析，結(jié)果表明，基因MeP5CS1具有1個(gè)2 220 bp的開放閱讀框，編碼739個(gè)氨基酸，且含有P5CS保守結(jié)構(gòu)域；MeP5CS1與楊樹、杞柳的P5CS基因親緣關(guān)系相對(duì)較近，序列相似性分別達(dá)到88.61%、88.95%；MeP5CS1基因在第1張完全展開葉、老葉中的表達(dá)量受到PEG處理誘導(dǎo)，且與葉片中脯氨酸的含量變化趨勢(shì)一致；MeP5CS1基因的表達(dá)還受到脫落酸（ABA）、鹽脅迫處理的誘導(dǎo)。在此基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建MeP5CS1基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA 2300-MeP5CS1，為進(jìn)一步解析MeP5CS1在木薯抗旱中的作用機(jī)制提供參考。

關(guān)鍵詞：木薯；MeP5CS1；非生物脅迫；克??；基因表達(dá)；載體構(gòu)建

中圖分類號(hào)： S533.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）18-0040-03

收稿日期：2016-05-09

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金（編號(hào)：20163120、20153048）。

作者簡(jiǎn)介：丁澤紅（1982—），男，湖南岳陽(yáng)人，博士，助理研究員，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：dingzehong@itbb.org.cn。

通信作者：胡 偉，博士，副研究員，主要從事植物分子生物學(xué)研究。Tel：（0898）66989380；E-mail：huwei2010916@126.com。 干旱是世界農(nóng)業(yè)面臨的最嚴(yán)重問(wèn)題之一。隨著全球發(fā)生周期性降水分布不均、水資源受到污染等現(xiàn)象，植物面臨干旱脅迫的程度日益加劇，不但導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量嚴(yán)重減少，而且還使得旱地面積持續(xù)擴(kuò)大，制約著農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。在漫長(zhǎng)的環(huán)境適應(yīng)和馴化過(guò)程中，植物形成了多種生理生化策略以應(yīng)對(duì)干旱脅迫，如當(dāng)植物遭受長(zhǎng)時(shí)間和較為嚴(yán)重的干旱時(shí)，植物冠層的光合作用將顯著減少；為盡快適應(yīng)缺水的情況，植物通過(guò)老葉的脫落來(lái)減少水分消耗，或增加根長(zhǎng)來(lái)吸收更深層的地下水[2]，脯氨酸等各種小分子化合物將被合成并迅速積累以保持細(xì)胞中的含水量[3]等等。

脯氨酸是植物面對(duì)水分、高鹽等逆境脅迫最為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，提高植物中脯氨酸的積累對(duì)提升植物抗?jié)B透脅迫能力具有重要的意義。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是植物脯氨酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，決定著植物體內(nèi)脯氨酸的積累速度[4]。目前，對(duì)很多植物中的P5CS基因研究較為深入[5-7]，并發(fā)現(xiàn)P5CS轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性表型增強(qiáng)[8-9]。木薯是重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，雖具有一定的抗旱特性，但同大多數(shù)作物一樣，干旱脅迫仍嚴(yán)重地影響木薯的生長(zhǎng)和發(fā)育，導(dǎo)致木薯塊根產(chǎn)量減少[2]，而與模式植物相比，木薯的重要經(jīng)濟(jì)性狀基礎(chǔ)理論研究還相對(duì)薄弱，與抗旱相關(guān)的分子機(jī)制尚不明確。本研究在克隆木薯P5CS基因MeP5CS1的基礎(chǔ)上，分析MeP5CS1基因在聚乙二醇（PEG）、脫落酸（ABA）和鹽脅迫條件下的表達(dá)量變化，并構(gòu)建相關(guān)的植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步解析木薯的抗旱機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備

試驗(yàn)材料為木薯栽培品種Ku50，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供，在木薯種植季節(jié)，將Ku50種莖切成長(zhǎng)度約15 cm的莖段，挑選含3～4個(gè)芽眼/莖段、粗細(xì)均勻一致的莖段，扦插于高為18.8 cm，上、下直徑分別為18.5、14.8 cm的塑料盆中，1莖段/盆?；|(zhì)采用營(yíng)養(yǎng)土與蛭石以 1 ∶ 1 的體積比進(jìn)行混合。木薯種植約10 d進(jìn)行間苗，保留1苗/盆。

1.2 試驗(yàn)處理

木薯盆栽種植60 d，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株用20% PEG6000溶液模擬干旱脅迫，以澆灌自來(lái)水為對(duì)照，分別在處理0、3、6、12、24 h時(shí)，按照Bates等的方法[10]測(cè)定葉片脯氨酸含量，同時(shí)，分別在處理0、3、24 h時(shí)采集未展開葉、第1張完全展開葉、老葉、根。此外，對(duì)種植60 d的木薯幼苗用100 μmol/L ABA噴施，在處理0、2、6、10、24、48、72 h時(shí)采集未展開葉、第1張完全展開葉、老葉；另用200 mmol/L NaCl進(jìn)行灌根，在處理0、2、6 h及3、14、18、24 d同樣采集葉片。根、葉樣品液氮冷凍、-80 ℃保存，待測(cè)。

1.3 RNA提取與cDNA合成

按照天根生化科技有限公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取木薯的總RNA；利用Fermentas公司生產(chǎn)的第一鏈cDNA合成試劑盒（revert aid first strand cDNA synthesis kit）將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃儲(chǔ)存，備用。

1.4 引物設(shè)計(jì)與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）

用Primer 6.0設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。MeP5CS1基因全長(zhǎng)擴(kuò)增正向、反向引物分別為L(zhǎng)1：5′-GGGGTACCCTGCTCATGGCTGCAAACTG-3′、R1：5′ -GCGTCGACATGAAGCAACGGTGGGAGAT-3′（下劃線為酶切位點(diǎn)），分別帶有KpnⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，可用于植物表達(dá)載體的構(gòu)建。qRT-PCR引物包括MeP5CS1基因特異性引物L(fēng)2：5′-GCTTATGCTGGTGTCC CTGT-3′、R2：5′-CACGCGCACCAAAGTGTTTA-3′及actin基因引物L(fēng)3：5′-GATGAGTCTGGTCCATCCA-3′、R3：5′-CTCCTACGACCCAATCTCA-3′[11]。qRT-PCR采用TaKaRa公司生產(chǎn)的R GreenⅠ試劑盒，按照說(shuō)明在Stratagene公司生產(chǎn)的3005P熒光定量PCR儀上進(jìn)行操作，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，表達(dá)量按照ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算[12]。endprint

1.5 生物信息學(xué)分析

采用Clustal X軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)；采用CDD數(shù)據(jù)庫(kù) （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域；采用ORF Finder、GenScan軟件預(yù)測(cè)開放閱讀框；采用ExPASy ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)；采用Mega 5.2軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.6 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、SalⅠ分別對(duì)含有目的基因MeP5CS1的重組質(zhì)粒和植物表達(dá)載體pCAMBIA2300進(jìn)行雙酶切。酶切體系20.0 μL：d2H2O 7.0 μL，質(zhì)粒10.0 μL，10 × FastDigest Buffer 2.0 μL，KpnⅠ和SalⅠ各0.5 μL，37 ℃反應(yīng)4 h。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，分別回收MeP5CS1目的片段和pCAMBIA 2300載體片段；用T4連接酶將目的基因片段和植物表達(dá)載體片段進(jìn)行連接，16 ℃過(guò)夜反應(yīng)；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過(guò)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克?。贿M(jìn)行PCR及雙酶切驗(yàn)證，測(cè)序，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA 2300-MeP5CS1。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因MeP5CS1的克隆

以木薯Ku50葉片cDNA為模板，用基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得1條2 600 bp左右的單一條帶。回收PCR產(chǎn)物連接pMD19-T simple載體，測(cè)序得到1條2 627 bp的序列，包括343 bp的5′非翻譯區(qū)（5′UTR）、2 220 bp的開放閱讀框、64 bp的非翻譯區(qū)3′ 非翻譯區(qū)（3′ UTR），該序列編碼739個(gè)氨基酸。Blast結(jié)果表明，MeP5CS1與木薯數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的P5CS基因（Manes.10G024800.1）只有4個(gè)堿基的差異，同源性高達(dá)99%。與基因組信息比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MeP5CS1基因含有20個(gè)外顯子。預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量為 80 139.4 ku，理論等電點(diǎn)（pI）為6.18。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示（圖1），MeP5CS1編碼的蛋白含有P5CS保守結(jié)構(gòu)域PLN02418，這進(jìn)一步表明克隆到的基因?yàn)镻5CS基因。

2.2 基因MeP5CS1進(jìn)化樹分析

經(jīng)序列比對(duì)，獲得與MeP5CS1同源性較高的其他物種序列，由圖2可見(jiàn)，P5CS基因大致可聚為3類；第Ⅰ類以C4物種為代表，包括谷子、狗尾草、柳枝稷、玉米和高粱；第Ⅱ類包括擬南芥、薺菜花和白菜型油菜；木薯MeP5CS1被聚類到第Ⅲ類，與楊樹、杞柳的親緣關(guān)系相對(duì)較近，序列相似性分別達(dá)到88.61%、88.95%。

2.3 脯氨酸含量與MeP5CS1表達(dá)分析

2.3.1 PEG脅迫對(duì)木薯葉片脯氨酸含量的影響 用20% PEG6000溶液模擬干旱脅迫，測(cè)定PEG處理對(duì)木薯葉片中脯氨酸含量的影響。由圖3可見(jiàn)，對(duì)照處理（澆灌自來(lái)水）的木薯葉片脯氨酸含量相對(duì)比較穩(wěn)定，維持在22 μg/g左右；隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，PEG處理的木薯葉片脯氨酸含量迅速累積，呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，24 h達(dá)到最大值。

2.3.2 PEG脅迫處理對(duì)基因MeP5CS1表達(dá)量的影響 由圖4可見(jiàn)，處理0 h時(shí)，MeP5CS1在未展開葉、根中的表達(dá)量相對(duì)比較接近，明顯高于在第1張完全展開葉、老葉中的表達(dá)量；與0 h相比，處理3 h時(shí)各組織中的MeP5CS1表達(dá)量基本沒(méi)有變化， 處理24 h時(shí)， MeP5CS1在第1張完全展開葉中的表達(dá)量增加約2倍， 老葉中增加約5倍， 未展開葉、根中的變

化仍然不大，這說(shuō)明MeP5CS1主要在第1張完全展開葉和老葉中發(fā)揮功能。

2.3.3 ABA、 NaCl處理對(duì)基因MeP5CS1表達(dá)量的影響 由

圖5、圖6可見(jiàn)，ABA處理2～6 h，葉片中MeP5CS1的表達(dá)量有明顯上升；與對(duì)照（處理0 h）相比，ABA處理10 h的MeP5CS1表達(dá)量沒(méi)有明顯變化，但在處理24～72 h時(shí)，葉片中MeP5CS1的表達(dá)量維持在明顯誘導(dǎo)水平；NaCl處理3、24 d時(shí)，葉片中MeP5CS1表達(dá)量被明顯誘導(dǎo)，其他處理時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照相比沒(méi)有太大變化。因此，ABA、NaCl處理能夠明顯誘導(dǎo)MeP5CS1的表達(dá)。

2.4 木薯MeP5CS1表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、SalⅠ分別對(duì)含有目的基因MeP5CS1的重組質(zhì)粒和植物表達(dá)載體pCAMBIA 2300進(jìn)行雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR檢測(cè)，電泳獲得1條約2 600 bp的條帶；同時(shí)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，分別獲得約9 500 bp的載體和約2 600 bp的條帶（圖7），2種驗(yàn)證方法都獲得與目的基因片段大小一致的條帶。經(jīng)進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證，明確為MeP5CS1基因，這表明已成功構(gòu)建pCAMBIA 2300-MeP5CS1植物表達(dá)載體。

3 結(jié)論與討論

P5CS是植物細(xì)胞脯氨酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶，目前，

已經(jīng)從許多植物中分離得到，并從分子角度證明該基因是一個(gè)重要的植物抗逆相關(guān)基因[6-9]，而木薯中有關(guān)P5CS基因的研究相對(duì)很少。本研究從木薯Ku50中克隆了MeP5CS1基因，該基因具有1個(gè)2 220 bp的開放閱讀框，編碼739個(gè)氨基酸，與其他物種中的P5CS大小基本一致[7-9]，序列分析表明，MeP5CS1與楊樹、杞柳中P5CS基因的親緣關(guān)系相對(duì)較近。

脯氨酸是植物細(xì)胞中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在干旱、高鹽等逆境脅迫條件下，脯氨酸含量會(huì)迅速積累以減輕脅迫傷害[8]。P5CS作為脯氨酸合成途徑的限速酶，其表達(dá)量也相應(yīng)地被快速誘導(dǎo)，且具有不同的組織表達(dá)特異性[13]。木薯作為一種典型的抗旱作物，有關(guān)其P5CS基因?qū)Ψ巧锬婢趁{迫的響應(yīng)尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，PEG6000脅迫處理能誘導(dǎo)木薯葉片中脯氨酸含量快速積累，PEG脅迫處理24 h，MeP5CS1在第1張完全展開葉和老葉中的表達(dá)量增加2～5倍，與脯氨酸含量的變化相對(duì)一致，暗示MeP5CS1主要負(fù)責(zé)脅迫木薯第1張完全展開葉、老葉中脯氨酸的積累；正常條件下，MeP5CS1傾向于在幼嫩的組織和根中的表達(dá)，與周精華等研究結(jié)論[14]相對(duì)一致。此外，MeP5CS1表達(dá)還受到ABA、鹽脅迫處理的誘導(dǎo)。endprint

構(gòu)建表達(dá)載體是基因功能驗(yàn)證的主要手段之一。張霞等將2個(gè)水稻P5CS基因在煙草中進(jìn)行過(guò)表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸含量有顯著增加[9]；Ehsanpour等研究也表明，干旱條件下P5CS轉(zhuǎn)基因在煙草葉片、根中的脯氨酸含量有顯著增加[15]。本研究成功構(gòu)建了木薯MeP5CS1基因表達(dá)載體pCAMBIA 2300-MeP5CS1，為進(jìn)一步研究該基因在木薯干旱等非生物脅迫中的功能奠定了基礎(chǔ)。

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