張?zhí)炀?，?奇，宋 莉*

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省油菜研究所，貴州 貴陽(yáng) 550008)

*通訊作者：宋 莉(1971-)，女，博士，副教授，主要研究方向：植物基因工程研究；Email：lpsssl@126.com。

紫蘇密碼子偏好性分析及fad3基因的異源表達(dá)預(yù)測(cè)

張?zhí)炀?，沈 奇2，宋 莉1*

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省油菜研究所，貴州 貴陽(yáng) 550008)

紫蘇α-亞麻酸(ALA)含量極高，其合成相關(guān)基因偏好性及異源表達(dá)宿主的闡明，是揭示紫蘇不飽和脂肪酸調(diào)控機(jī)制及表達(dá)生產(chǎn)的重要前提。本研究從密碼子特性、有效密碼子數(shù)、相對(duì)使用度、最優(yōu)密碼子、堿基相關(guān)性、奇偶偏好性及異源表達(dá)特性等方面，對(duì)不同形成時(shí)期的紫蘇種子轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行密碼子偏好性分析，并對(duì)篩選出的pfFAD3s基因進(jìn)行三種微生物異源表達(dá)預(yù)測(cè)分析比較。結(jié)果表明：紫蘇轉(zhuǎn)錄核酸序列中的GC含量為45.85%，大部分基因密碼子偏好性相對(duì)較弱，其蛋白編碼基因密碼子偏好以A/T結(jié)尾；pfFAD3s基因異源表達(dá)的適宜微生物宿主為釀酒酵母。分析結(jié)果為進(jìn)一步研究紫蘇ALA合成的分子調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，并為其微生物基因工程生產(chǎn)提供了一定依據(jù)。

紫蘇；密碼子偏好性；異源表達(dá)

不同生物的蛋白質(zhì)編碼基因?qū)?jiǎn)并密碼子使用頻率不相同，構(gòu)成了物種特異的密碼子偏好性[1]。密碼子偏好性除了受自然選擇[2]和壓力突變[3]影響之外，還受mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、基因長(zhǎng)度、G+C含量、蛋白結(jié)構(gòu)[4-7]等因素影響。密碼子偏好性是影響基因異源表達(dá)的重要因素。在合成生物學(xué)及基因工程研究中，對(duì)密碼子偏好性的優(yōu)化可以大幅提高基因表達(dá)水平，增加目標(biāo)物質(zhì)的調(diào)控及產(chǎn)量[8-11]。伴隨著測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，草菇、擬南芥、川母貝、菠蘿[12-15]等多個(gè)物種的密碼子偏好性得到了很好研究。

紫蘇PerillafrutescensL.，是我國(guó)衛(wèi)生部首批公布的60種藥用型植物之一[16]?！吨袊?guó)藥典》2015年版本收錄其三個(gè)藥用部位，分別為紫蘇葉、紫蘇梗、紫蘇子[17]。紫蘇種子中α-亞麻酸含量可達(dá)65%，是陸生植物α-亞麻酸含量最高的物種之一，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。目前，紫蘇α-亞麻酸的合成及調(diào)控途徑研究已受到廣泛關(guān)注，利用該合成途徑重要基因進(jìn)行異源表達(dá)生產(chǎn)是紫蘇利用的一個(gè)主要方向。研究表明，通過(guò)密碼子優(yōu)化后的oAiFADS17表達(dá)量大幅提高[11]，F(xiàn)AD7基因在雙子葉植物異源表達(dá)也能獲得理想的效果[18]。本研究通過(guò)對(duì)紫蘇種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)密碼子進(jìn)行分析研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用紫蘇和異源表達(dá)其基因產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)材料為貴州省油菜研究所自育新品種“M40”開(kāi)花至種子完熟后2、6、10、14、18、22、26 d的紫蘇種子。紫蘇種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為課題組測(cè)序獲得。使用天根試劑盒提取總RNA，進(jìn)行Illumina測(cè)序。獲得數(shù)據(jù)使用Trinity軟件組裝形成unigene庫(kù)，并過(guò)濾除去長(zhǎng)度低于300 bp的序列用于本研究的數(shù)據(jù)來(lái)源。大腸桿菌(Escherichiacoli)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、畢赤酵母(Pichiapastoris)密碼子偏好性數(shù)據(jù)來(lái)源于Codon Usage Database數(shù)據(jù)庫(kù)中。

1.2分析方法

1.2.1紫蘇種子蛋白質(zhì)編碼基因密碼子特性分析 使用Codon W1.4.2軟件(http：//codonw. sourceforge. net/)對(duì)紫蘇種子蛋白質(zhì)編碼基因密碼子特性的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析，得到鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶總量(G+C)、密碼子第3位堿基成分(A3、G3、C3、T3)、密碼子第3位的C+G含量(GC3)。密碼子第1、2位的G+C含量(GC12)等數(shù)據(jù)。

1.2.2紫蘇種子表達(dá)基因有效密碼子數(shù)分析 參照Fuglsang[19]的方法，使用有效密碼子數(shù)(effective number of codons，ENC)來(lái)評(píng)估單個(gè)密碼子使用頻率的偏好程度。數(shù)據(jù)區(qū)間為20～61。數(shù)值越接近20，密碼子使用偏好性越強(qiáng)。

1.2.3同義密碼子相對(duì)使用度分析 參照Sharp[20]的方法，應(yīng)用同義密碼子相對(duì)使用度(relative synonymous codon usage，RSCU)的數(shù)據(jù)來(lái)衡量密碼子使用偏好性。如果RSCU=1則說(shuō)明密碼子使用無(wú)偏好性；如果RSCU>1則表明該密碼子使用頻率較高；反之RSCU<1。

1.2.4最優(yōu)密碼子分析 采用高表達(dá)優(yōu)越密碼子分析方法[21]進(jìn)行最優(yōu)密碼子分析，統(tǒng)計(jì)所有基因的ENC值，有序數(shù)據(jù)集的上下10%區(qū)間形成高RSCU集合和低RSCU集合。根據(jù)兩個(gè)子集的△RSCU值及卡方檢驗(yàn)確定最優(yōu)密碼子。

1.2.5中性繪圖分析 采用中性繪圖用來(lái)研究影響密碼子偏好性的因素，以密碼子第一、二個(gè)堿基的G+C平均含量為縱坐標(biāo)，以密碼子第三個(gè)堿基的G+C含量為橫坐標(biāo)繪圖，分析密碼子第一、二位與第三位堿基組成的相關(guān)性[22]。

1.2.6PR2分析 采用PR2(parity rule 2，PR2)進(jìn)行奇偶偏好分析[22]，計(jì)算每個(gè)基因A3/(A3+T3)和G3/(G3+C3)，分別作縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，以平面圖顯示各基因堿基組成。為了避免由第三位堿基對(duì)A/T或T/A和G/C或C/G的突變不均衡，分析時(shí)僅選擇以下氨基酸密碼子：絲氨酸(TCA、TCC、TCG、TCT)、亮氨酸(CTA、CTC、CTG、CTT)、脯氨酸、精氨酸(CGA、CGC、CGG、CGT)、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸。

1.2.7關(guān)鍵基因異源表達(dá)分析 統(tǒng)計(jì)大腸桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母密碼子偏好性，并與紫蘇的密碼子使用情況進(jìn)行比較。通過(guò)注釋和近源比對(duì)得到α亞麻酸合成相關(guān)的關(guān)鍵基因，分析關(guān)鍵基因所含有的密碼子與異源宿主的稀有堿基的異同，預(yù)測(cè)異源表達(dá)最適宿主。

2 結(jié)果與分析

2.1蛋白質(zhì)編碼基因密碼子特性分析

經(jīng)過(guò)濾獲得紫蘇種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共包括13825條完整開(kāi)放閱讀框序列。使用Codon W對(duì)完整開(kāi)放閱讀框序列進(jìn)行密碼子使用模式分析。結(jié)果顯示，所有完整開(kāi)放閱讀框序列總長(zhǎng)度為16 417 617 bp，N50=1 503 bp，平均GC含量為45.85%，GC含量在30.4～68.3%之間。紫蘇GC含量平均值比大腸桿菌基因組GC含量平均值52.35%要低，但高于畢赤酵母平均GC含量42.73%及釀酒酵母平均GC含量39.77%要稍稍略高。第一二位堿基的GC含量變幅在30.9～83.3%之間，其平均GC含量為47.62%。第三位堿基的GC含量變幅在15.3～91.3%之間，平均GC含量是44.00%。第三位堿基A和T的使用頻率(30.70和38.39%)略高于C和G使用頻率(26.29和39.09%)，表明紫蘇種子發(fā)育過(guò)程對(duì)A和T結(jié)尾的密碼子使用的偏好程度大于G和C密碼子。第三位堿基平均GC含量略高于畢赤酵母密碼子第三位堿基平均含量42.16%，比釀酒酵母密碼子第三位堿基平均GC含量38.10%略高，但比大腸桿菌密碼子第三位堿基平均GC含量55.62%要低很多，研究表明紫蘇種子密碼子使用并無(wú)對(duì)堿基使用的特殊偏好，其密碼子使用特點(diǎn)與大腸桿菌的差別最大，與釀酒酵母和畢赤酵母的差別略小。

表1 不同物種密碼子平均GC含量Tab.1 Average GC content of different species Codon

2.2紫蘇種子表達(dá)基因有效密碼子數(shù)分析

紫蘇種子有效密碼子數(shù)ENC分布范圍是26.22～61，平均值ENC為53.39。通常將ENC為35作為區(qū)分密碼子偏好性強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)[23]。紫蘇種子基因有23條基因的ENC小于35，表明紫蘇種子表達(dá)基因整體水平密碼子偏好性較低，只有少數(shù)基因有密碼子偏好性。顯示只有少數(shù)密碼子偏好性受到選擇影響的基因應(yīng)該落在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)下方較遠(yuǎn)的位置(圖1)。相關(guān)性分析表明(表2)，GC和GC3及GC12均達(dá)到極顯著水平，但是GC3和GC12存在很弱的相關(guān)性，密碼子成分明顯不同。ENC值與密碼子數(shù)也沒(méi)有達(dá)到顯著水平，表明密碼子數(shù)對(duì)ENC影響很弱，排除了基因長(zhǎng)度過(guò)短對(duì)密碼子偏好性的影響。

2.3同義密碼子相對(duì)使用度分析

紫蘇種子編碼基因密碼子RSCU值大于1的有25個(gè)，表明紫蘇偏好使用這些密碼子(表3)。除了只由一種密碼子編碼的Trp和Met外，編碼Cys的UGU和UGC以及編碼Leu的CUG也都均無(wú)偏好性。RSCU>1的密碼子主要是以U和A結(jié)尾，說(shuō)明這兩個(gè)密碼子是編碼基因最偏愛(ài)的密碼子，GC使用頻率較低。

圖1 ENC繪圖分析Fig.1 Analysis of ENC and GC3 relationship

注：“**”在0.01水平上顯著相關(guān)。

2.4最優(yōu)密碼子分析

最優(yōu)密碼子統(tǒng)計(jì)分析表明，有31個(gè)密碼子是紫蘇種子發(fā)育時(shí)期所需的最優(yōu)密碼子，它們分別是UUU，UUA，UUG，CUU，CUA，AUU，AUA，GUU，GUA，UAU，CAU，CAA，AAU，AAA，GAU，GAA，UCU，UCA，CCU，CCA，ACU，ACA，GCU，GCA，UGU，CGU，CGA，AGU，AGA，GGU，GGA(表4)，分別編碼Phe，Leu，Ile，Val，Tyr，His，Gln，Asn，Lys，Asp，Glu，Ser，Pro，Thr，Ala，Cys，Arg和Gly 18個(gè)氨基酸。其中Leu、Ser、Arg包含3個(gè)最優(yōu)密碼子。除了UUG外，所有的最優(yōu)密碼子都是A或T結(jié)尾，說(shuō)明紫蘇偏愛(ài)使用A/T結(jié)尾的密碼子。

表3 同義密碼子使用度Tab.3 RSCU analysis

注：“*”表示RSCU大于1。

表4 最優(yōu)密碼子分析Tab.4 Uasge bais analysis

注：“*”代表最優(yōu)密碼子。

2.5中性繪圖分析

權(quán)衡選擇對(duì)密碼子使用模式的影響運(yùn)用中性繪圖分析(neutrality plot)。結(jié)果表明(圖2A)，GC12的取值范圍是0.309～0.833，GC3的取值范圍是0.153～0.913，兩者相關(guān)系數(shù)為0.233，回歸系數(shù)為0.43。紫蘇種子中GC3及GC12的相關(guān)性較低，說(shuō)明紫蘇的密碼子的使用易受突變的影響。

2.6PR2分析

注：A. 中性繪圖，B.PR2繪圖

圖2 紫蘇密碼子使用模式圖
Fig.2 Codon usage pattern plot of Perilla

通過(guò)PR2(圖2B)分析了基因部分氨基酸的嘌呤含量和嘧啶的關(guān)系，圖中結(jié)果表明紫蘇中堿基T使用頻率大于堿基A；堿基G使用頻率大于堿基C。正常情況下突變應(yīng)該均衡，但紫蘇種子發(fā)育并不均衡，說(shuō)明紫蘇種子密碼子使用模式不只受到突變的影響，還可能受到其他因素影響。

2.7關(guān)鍵基因異源表達(dá)預(yù)測(cè)

根據(jù)紫蘇轉(zhuǎn)錄組注釋信息及與近源比對(duì)，預(yù)測(cè)其pfFAD3s基因在不同宿主表達(dá)情況。首先比較了紫蘇和畢赤酵母、釀酒酵母、大腸桿菌的密碼子偏好性情況。統(tǒng)計(jì)分析表明，畢赤酵母5個(gè)最稀有的密碼子是CGG，CGC，GCG，CCG，CGA，不存在紫蘇偏好的密碼子。釀酒酵母中5個(gè)最稀有的密碼子分別為：CGG，CGC，CGA，UGC，CCG，也不存在紫蘇偏好的密碼子。大腸桿菌中5個(gè)最稀有的密碼子分別為： AGA，AGG，AUA，CGA，CGG，有2個(gè)是紫蘇使用的密碼子(AGG和AGA)。如果表達(dá)基因中含有較多的AGG和AGA密碼子，很可能難以在大腸桿菌中表達(dá)。綜上分析表明，紫蘇密碼子偏好性與大腸桿菌的差異巨大。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)這3條基因中存在三種宿主稀有密碼子的比例，結(jié)果表明畢赤酵母稀有密碼子在這三條基因中所占的比例是3.42～11.74%，釀酒酵母稀有密碼子所占的比例為3.65～9.69%，大腸桿菌稀有密碼子所占的比例最寬，范圍在3.19～21.17%之間，可見(jiàn)釀酒酵母和畢赤酵母稀有堿基所占比例比大腸桿菌稀有堿基所占比例整體水平偏低。DN26137基因和DN23844基因含有釀酒酵母稀有堿基的比例最少(表5)，推測(cè)釀酒酵母更利于這兩條基因表達(dá)；而DN35418基因含量大腸桿菌和畢赤酵母稀有密碼子的數(shù)目少于釀酒酵母，但差別不大，推測(cè)這三種宿主均適合該基因異源表達(dá)。對(duì)基因進(jìn)行異源表達(dá)時(shí)，如果基因存在宿主的稀有密碼子的比例很高，我們可以根據(jù)宿主偏好的密碼子來(lái)對(duì)基因進(jìn)行優(yōu)化，多使用優(yōu)勢(shì)密碼子，以提高表達(dá)水平。

3 結(jié)論與討論

編碼基因密碼子存在冗余性，自然界中61組編碼堿基只能編碼20種氨基酸，每種氨基酸利用1～6個(gè)同義密碼子編碼。異源基因表達(dá)活性與密碼子偏好性具有密切關(guān)系，通過(guò)密碼子改造后進(jìn)行酵母表達(dá)生產(chǎn)青蒿酸可實(shí)現(xiàn)青蒿素的工業(yè)化生產(chǎn)[24]，并大幅度提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。張琦等[25]對(duì)FAD4的ATG上游+4位基因進(jìn)行改造，將A變成G進(jìn)行釀酒酵母轉(zhuǎn)化研究，獲得FAD4高效表達(dá)。目前，研究密碼子偏好性，并根據(jù)最優(yōu)密碼子設(shè)計(jì)構(gòu)建基因異源表達(dá)已成為合成生物學(xué)及基因工程研究中的重要內(nèi)容。

表5 紫蘇pfFAD3s基因中不同宿主的稀有密碼子數(shù)Tab.5 Number of rare different hosts codon in perilla pfFAD3s

中草藥中廣泛含有重要次生代謝產(chǎn)物，其調(diào)控基因的異源表達(dá)及密碼子偏好性分析具有重要意義。本研究對(duì)紫蘇種子密碼子偏好性進(jìn)行全面分析，發(fā)現(xiàn)紫蘇主要偏好A或T結(jié)尾的密碼子，而G和C使用頻率略低，符合雙子葉植物密碼子偏好的特點(diǎn)[26]。紫蘇密碼子偏好的確定對(duì)于未來(lái)在轉(zhuǎn)基因工程中對(duì)載體和宿主的選擇有重要的指導(dǎo)意義，針對(duì)紫蘇偏好的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，從而提高翻譯效率和表達(dá)能力，也為異源表達(dá)選擇合適的宿主提供參考。紫蘇密碼子使用特點(diǎn)與大腸桿菌的差異較大，與畢赤酵母和釀酒酵母的差異略小。參與其α-亞麻酸合成途徑的fad3分析表明，釀酒酵母可能是適合紫蘇a-亞麻酸基因異源表達(dá)的理想宿主。隨著大量編碼油脂代謝通路的關(guān)鍵基因已被克隆，改造這些基因來(lái)提高受體細(xì)胞的油脂已經(jīng)成為一個(gè)油脂生產(chǎn)的主要研究方向，本研究從生物信息學(xué)角度初步探明了紫蘇密碼子偏好性和異源表達(dá)宿主，這對(duì)紫蘇基因工程開(kāi)展具有重要的意義。

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AnalysisofCodonBiasandpfFAD3sHeterologousExpressioninPerillafrutescens(L.)TranscriptionalGeneSequence

ZHANGTian-yuan1，SHENQi2，SONGLi1*

(1.CollegeofLifeSciences/InstituteofAgro-Bioengineering，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China；2.GuizhouRapeseedInstitute，Guiyang，Guizhou550008，China)

Perilla is one of the best oil crops with high level of α-linolenic acid (ALA). It is important to reveal the regulatory mechanisms of ALA biosynthesis for its industrial production， based on the codon usage bias and appropriate heterologous host of perilla genes. In this study， codon characteristics， codon numbers， relative synonymous codon usage， optimal codon， base correlation， parity rule and microbial heterologous expression ofpfFAD3swere respectively analysed for gene using， according to the RNA sequence from seven development period of perilla seeds. Results showed that GC content was 45.85% in transcribed perilla sequences. Most gene codon bias were not obvious and tend to end with A/T base.Saccharomycescerevisiaemay be a more suitable host forpfFAD3sexpression. This research provides a foundation for the synthesis regulation mechanism of perilla ALA and its large-scale production by microbial gene engineering.

perilla；coden usage；heterologous protein expression

2017-03-27；

2017-05-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360067)；貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合NY字[2016]3052號(hào))；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字[2014]2020號(hào))。

Q755

A

1008-0457(2017)05-0014-08國(guó)際DOI編碼10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.05.003