徐艷明++++++楊柳++++++付巍+++++++李建民++++++王雪

[摘要]目的 探討水飛薊賓對中波紫外線（UVB）誘導(dǎo)的色素沉著豚鼠模型的影響。方法 采用紫外線光療儀照射棕黃色豚鼠，建立豚鼠皮膚色素沉著模型，將豚鼠分為空白對照組、模型組、基質(zhì)組、治療組、陽性對照組，每組8只共40只。其中模型組、治療組和陽性對照組分別給與UVB照射15 min，連續(xù)照射20 d，分別給基質(zhì)組、治療組、陽性對照組基質(zhì)、水飛薊賓和玉蘭油30 d后，對豚鼠皮膚組織中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸相關(guān)蛋白酶-2（TRP-2）的含量進(jìn)行檢測。結(jié)果 與模型組比較，治療組豚鼠皮膚色素明顯變淺，組織勻漿液中SOD、CAT活力明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），TYR、TRP-2含量明顯降低（P<0.05）。結(jié)論 水飛薊賓具有抑制色素沉著的作用，作用機(jī)制可能與其能夠清除自由基防止組織過氧化損傷，抑制酪氨酸酶分泌有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]色素沉著；中波紫外線；水飛薊賓

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）10（b）-0007-04

[Abstract]Objective To explore the influence of Silybin on guinea pigs model induced pigmentation by UVB.Methods Brown yellow guinea pigs were irradiated by ultraviolet ray phototherapy apparatus，the skin pigmentation of guinea pigs model was established，the guinea pigs were divided into blank control group，model group，matrix group，treatment group，and positive control group，there were 40 guinea pigs，each group 8 guinea pigs.Model group，treatment group and positive control group were irradiated by 1 min for 20 days continually，matrix group，treatment group and positive control group were used matrix，silybin and Olay for 30 days，the SOD，CAT，TYR and TRP-2 content in guinea pigs were tested.Results Compared with model group，guinea pigs′skin pigment becomes shadow distinctively，SOD，CAT activity in tissue homogenizing fluid becomes high distinctively，the differences were statistically significant （P<0.05），TYR，TRP-2 contents decrease distinctively（P<0.05）.Conclusion Slybin can inhibit skin pigmentation，the mechanism function may be related to the ability of removal free radicals from oxidative damage and inhabitation of tyrosine′s activity

[Key words]Pigmentation；UVB；Silybin

色素沉著性疾病是由于大量黑色素非正常聚集于皮膚的不同部位形成，常見疾病如黃褐斑、炎癥后色素沉著、黑變病等，嚴(yán)重者損美給患者帶來極大心理負(fù)擔(dān)，影響生活質(zhì)量。目前市場上治療色素沉著的方法層出不窮，但缺乏有效率高、不良反應(yīng)小、復(fù)發(fā)率低的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)[1]水飛薊賓在整體、組織和細(xì)胞形態(tài)、氧化損傷和ROS水平、MAPK/NF-κB信號通路的激活以及自噬的調(diào)節(jié)等方面對UVB引起的損傷均發(fā)揮了明顯的對抗作用。本研究選擇水飛薊賓應(yīng)用于UVB誘導(dǎo)的皮膚色素沉著動物模型，綜合評價水飛薊賓對色素沉著的治療作用并探討其可能作用機(jī)制，為祛斑美白功效型化妝品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1動物 普通級健康棕黃色豚鼠40只，6周齡，體質(zhì)量240～260 g，由長春市億斯試驗動物技術(shù)責(zé)任有限公司提供（合格證號：SCXK-（吉）2014-0002）。

1.1.2藥物 水飛薊賓乳霜（自制，批號：20150601）；薇婷脫毛膏（深圳市先靈葆雅生物科技有限公司，批號：20141107）；玉蘭油新生塑顏金純面霜（廣東寶來實業(yè)有限公司，批號：20151115）；豚鼠酪氨酸酶（TYR）、豚鼠酪氨酸相關(guān)蛋白酶-2（TRP-2）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20151115）；WST-1法超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20150921）；考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20151021）。

1.1.3儀器 紫外光療儀（Sigma公司），紫外線輻照計（北京師范大學(xué)光電儀器廠），TL-2010S中通量組織勻漿機(jī)（北京鼎昊源科技有限公司），YB1201DW型電子天平（上海海康電子儀器廠），8-5K離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），Rsearch UV UF型超純水制備系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司），半自動生化分析儀（四川美生科技有限公司），酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）。endprint

1.2方法

1.2.1藥物的制備 水飛薊賓乳霜的制備：將16醇和十六烷基糖苷、單硬脂酸甘油酯、橄欖油、角鯊?fù)椤⑹?十八醇混合后升溫至80℃溶解制得油相；將甘油加入去離子水中，升溫至80℃，加入對羥基苯甲酸甲酯，攪拌至全部溶解，制得水相；然后，將水相加入油相中，均質(zhì)8 min，攪拌降溫至40℃，加入用丙二醇分散的水飛薊賓，攪拌至分散均勻，制成含1.0%杜仲提取物的乳霜?？瞻谆|(zhì)乳霜的制備：將16醇和十六烷基糖苷、單硬脂酸甘油酯、橄欖油、角鯊?fù)椤⑹?十八醇混合后升溫至80℃溶解制得油相；將甘油加入去離子水中，升溫至80℃，加入對羥基苯甲酸甲酯，攪拌至全部溶解，制得水相；然后，將水相加入油相中，均質(zhì)8 min，攪拌降溫至40℃，加入與水飛薊賓乳霜等量的丙二醇，攪拌至分散均勻即得空白基質(zhì)乳霜。

1.2.2豚鼠色素沉著模型建立 使用SS-04B型紫外線光療儀。照光前電動剃毛刀將豚鼠背部棕黃色長毛剃除，再以女用脫毛膏脫去短毛以充分裸露背部皮膚。將豚鼠置于紫外光療儀燈具下照射，照射距離40 cm。每天照射15 min，出現(xiàn)水皰、紅腫等，光照暫停至癥狀緩解，照射20 d，達(dá)到累計照射劑量UVB為1.8 mJ/cm2，豚鼠背部皮膚形成穩(wěn)定而均勻的色素沉著造模完成[2-3]。紫外線的照射劑量按公式1[4]計算，照射強(qiáng)度通過紫外線輻照計測量來測定。

照射劑量（J/cm2）=照射強(qiáng)度（W/cm2）×照射時間（s）。

1.2.3測量方法 應(yīng)用FeSO4染色法，觀察水飛薊賓對黑素細(xì)胞的影響，采用抗氧化試劑盒及ELISA試劑盒檢測水飛薊賓的抗氧化活性及其抑制酪氨酸酶的活力。

1.2.4動物分組和給藥 豚鼠40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，分為空白對照組、基質(zhì)組、治療組、陽性對照組?？瞻捉M：正常飼養(yǎng)；基質(zhì)組：造模2周后每天涂乳霜基質(zhì)0.1 g；治療組：造模2周后按每天涂水飛薊賓乳霜0.1 g；陽性對照組：造模2周后每日外涂玉蘭油0.1 g。

1.2.5取材 第31天，處死豚鼠，剃毛，常規(guī)手術(shù)取下實驗暴露部位皮膚，一部分浸入10%福爾馬林中固定，做好標(biāo)記并制成病理切片。另一部分皮膚組織制成10%組織勻漿液待測。

1.3指標(biāo)觀測

1.3.1組織病理觀察 豚鼠皮膚常規(guī)石蠟切片，F(xiàn)eSO4染色，顯微鏡下觀察黑色素含量的變化。

1.3.2動物組織樣本的前處理 取皮膚組織塊（0.1～0.2 g）最少可到2～5 mg在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱重，放入5 ml的勻漿管中。按重量（g）：體積（ml）=1∶9的比例加入9倍體積PBS于勻漿管中，冰水浴條件下用眼科小剪剪碎組織塊。用中通量組織勻漿機(jī)勻漿，勻漿時間10 s/次，間隙30 s，連續(xù)10次，在冰水中進(jìn)行，離心20 min左右（2000～3000 r/min）。仔細(xì)收集上清，即得10%組織勻漿。

1.3.3實驗豚鼠皮膚組織超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活力測定 考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量測試盒測定總蛋白含量。按SOD、CAT測定試劑盒說明檢測。

1.3.4實驗豚鼠皮膚組織酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸相關(guān)蛋白酶-2（TRP-2）含量測定 按TYR、TRP-2 ELISA試劑盒說明進(jìn)行檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間采用t檢驗進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1皮膚顏色變化

經(jīng)高能紫外線（總量2500 mJ/cm2）照射豚鼠背部皮膚，1～2 d后照射部位出現(xiàn)紅斑，4～5 d肉眼所見紅斑消退，6～7 d后開始出現(xiàn)色素沉著，10 d左右色素沉著穩(wěn)定，開始用藥。用藥30 d后，基質(zhì)組豚鼠皮膚脫屑、發(fā)紅、色素沉著嚴(yán)重。給藥組、對照組色素明顯變淡，發(fā)紅、脫屑較輕。

2.2組織病理學(xué)觀察

空白組豚鼠表皮基底層幾乎看不到黑素顆粒；模型組豚鼠表皮基底層可見大量黑素顆呈粒帶狀分布，棘層黑素顆粒帽狀分布；基質(zhì)組豚鼠表皮基底層可見較多黑素顆粒；給藥組豚鼠表皮基底層黑素顆粒明顯減少；對照組豚鼠表皮基底層黑素顆粒顯著減少（圖1）。

2.3各組實驗動物皮膚組織中SOD、CAT活力

與空白相比，模型組豚鼠皮膚組織中SOD、CAT活力顯著降低（P<0.01），說明模型建立成功；與模型組比較，基質(zhì)組豚鼠皮膚中SOD、CAT活力無明顯變化；治療組豚鼠皮膚組織中SOD、CAT活力明顯升高（P<0.05）；對照組豚鼠皮膚組織中SOD、CAT活力明顯升高（P<0.05）。結(jié)果提示，水飛薊賓能夠清除自由基防止組織過氧化損傷（表1）。

2.4各組實驗動物皮膚組織中TYR、TRP-2分泌含量

與空白組比較，模型組豚鼠皮膚組織中TYR、TRP-2含量顯著升高（P<0.01），說明模型建立成功；與模型組比較，基質(zhì)組豚鼠皮膚中TYR、TRP-2含量無明顯變化；治療組豚鼠皮膚組織中TYR、TRP-2含量明顯升高（P<0.05）；對照組豚鼠皮膚組織中TYR、TRP-2含量顯著升高（P<0.01）。結(jié)果提示，水飛薊賓能夠抑制酪氨酸酶及酪氨酸相關(guān)蛋白酶的分泌（表2）。

3討論

現(xiàn)研究表明色素沉著性疾病與日曬密切相關(guān)，紫外線作為一種外源性刺激，能使維生素D原轉(zhuǎn)化成維生素D3，使色斑發(fā)病的主要物質(zhì)-酪氨酸的含量增加，從而調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)黑色素的合成[5-6]。UVB作為紫外線的一種，波長280～320 nm，是紫外線生物學(xué)效應(yīng)最活躍部分，紅斑反應(yīng)作用強(qiáng)。因此，本實驗采用UVB誘導(dǎo)豚鼠皮膚色素沉著建立模型，色素沉著均勻、穩(wěn)定。

黑素的合成主要由酪氨酸酶來調(diào)控，可以通過抑制此酶的活性，來減少黑素的合成，從而達(dá)到美白的效果[7-9]。本實驗采用ELISA法測定豚鼠皮膚組織中TYR、TRP-2含量[10-12]，結(jié)果提示水飛薊賓能夠明顯抑制UVB誘導(dǎo)的豚鼠色素沉著皮膚中TYR、TRP-2的分泌。推測水飛薊賓可以和L-多巴競爭結(jié)合酪氨酸受體位點，從而抑制黑素生成。endprint

研究證實，氧自由基與色素沉著有關(guān)[13]。人體內(nèi)氧自由基的形成與消除在基因調(diào)控的保護(hù)機(jī)制作用下始終處于動態(tài)平衡狀態(tài)，CAT、SOD等氧自由基清除劑不能隨脂質(zhì)過氧化（LPO）增多而增強(qiáng)清除能力，導(dǎo)致LPO的蓄積，LPO可作為啟動因素使酪氨酸酶系列氧化反應(yīng)加速，致黑素細(xì)胞產(chǎn)生黑素顆粒增多。本實驗采用抗氧化試劑盒檢測豚鼠皮膚組織中CAT、SOD活力[14-15]。結(jié)果提示，水飛薊賓能夠顯著增強(qiáng)CAT、SOD活力。推測水飛薊賓可以通過抑制自由基生產(chǎn)降低酪氨酸酶活性抑制黑色素生成。

綜上所述，水飛薊賓具有抑制色素沉著的作用，作用機(jī)制可能與其能夠清除自由基防止組織過氧化損傷，抑制酪氨酸酶分泌等有關(guān)。

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