楊夢瑞+李鵬+王敏+周劍+劉芳+張麗媛

摘 要 考察了介孔沸石材料負(fù)載傳統(tǒng)有機基質(zhì)α氰基4羥基桂皮酸（CHCA）用于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOFMS）分析多肽Substance P和氟喹諾酮類藥物等小分子的效果。在相同的MALDITOFMS質(zhì)譜條件下，與傳統(tǒng)CHCA進行了比較，同時分別考察了不同硅鋁比（SiO2/Al2O3）的ZSM5以及不同介孔大小的Beta與ZSM5沸石載體對Substance P的檢測效果。結(jié)果表明，沸石負(fù)載CHCA新型復(fù)合基質(zhì)具有抑制堿金屬離子峰、消除干擾碎片離子、簡化與改善質(zhì)譜圖、提高離子化效率等優(yōu)點。 實驗結(jié)果表明，沸石表面酸性越強，有力介孔能夠充分包裹CHCA分子，則復(fù)合基質(zhì)抑制干擾碎片和提高離子化效率的能力越高。復(fù)合基質(zhì)成功應(yīng)用于復(fù)雜樣品中恩諾沙星與諾氟沙星藥物小分子的MALDITOFMS檢測。

1 引 言

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOFMS）具有高靈敏、高通量、不影響分子結(jié)構(gòu)完整性等諸多優(yōu)點[1]，在分析小分子物質(zhì)的研究中應(yīng)用廣泛[2，3]。然而，由于傳統(tǒng)的有機基質(zhì)，如2，4，6三羥基苯乙酮（THAP）、α氰基4羥基桂皮酸（CHCA）等，分子量都約為200 Da，在激光的輻照下，將在小質(zhì)量數(shù)的范圍（< 500 Da）內(nèi)產(chǎn)生大量的基質(zhì)碎片，從而干擾小分子物質(zhì)的檢測[4]。為克服這一缺點，一些新型的無機材料[3， 5]、石墨烯[6]、金屬有機化合物[7]、介孔材料[8]、納米顆粒[9]等，被用于修飾或取代傳統(tǒng)的有機基質(zhì)，以達(dá)到抑制碎片、簡化譜圖等效果，實現(xiàn)了對小分子物質(zhì)的檢測。例如傳統(tǒng)有機基質(zhì)2，5二羥基苯甲酸（DHBA）在修飾的介孔硅材料輔助下，不但實現(xiàn)了基質(zhì)碎片的充分抑制，而且能夠有效提高待測氨基酸、代謝物等小分子化合物的MALDITOFMS質(zhì)譜峰信號強度。

沸石是一種具有介孔結(jié)構(gòu)的鋁酸鹽材料，作為催化劑和吸附劑廣泛用于工業(yè)催化等領(lǐng)域[10]。在沸石的晶體結(jié)構(gòu)中，由于Si4+被Al3+同晶置換，具有電負(fù)性的SiOAl橋鍵會被H+、NH+4、K+、Na+等離子平衡，如圖1所示，

而且這些離子可以相互交換在沸石表面[11， 12]。沸石的種類非常多，結(jié)構(gòu)也不同，常見的有Y型沸石、絲光沸石、Beta沸石、ZSM5沸石等。沸石結(jié)構(gòu)中硅鋁比（SiO2/Al2O3）的不同，其沸石的酸性、孔徑大小、穩(wěn)定性以及親水性等都會隨之變化，從而影響沸石催化活性等[13]。近年來，沸石材料在MALDI基質(zhì)研究與應(yīng)用方面，取得了一些新的進展。Komori等[14]將傳統(tǒng)有機基質(zhì)THAP嵌入質(zhì)子化絲光沸石（HM20）介孔中，能夠有效抑制THAP的質(zhì)譜碎片，消除堿金屬干擾的影響，提高目標(biāo)分析物的信號強度。此外，銀納米顆粒負(fù)載介孔沸石作為無機MALDI基質(zhì)，具有保護納米顆粒在激光輻照下的完整性、消除納米顆粒團聚效應(yīng)、提高離子化效率、選擇性離子化等優(yōu)點[15]。

本研究重點考察介孔沸石材料負(fù)載傳統(tǒng)基質(zhì)CHCA用于MALDITOFMS分析小分子物質(zhì)的效果。比較了不同硅鋁比、不同介孔大小的沸石材料，分析與探討沸石表面酸性大小及介孔結(jié)構(gòu)對于檢測的影響，并利用沸石修飾基質(zhì)成功實現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中藥物小分子的MALDITOFMS檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Shimadzu Biotech Axima Performance MALDITOFMS質(zhì)譜儀（日本島津公司）， 配置N2激光源，激光波長337 nm，激光能量參數(shù)設(shè)定為30。

α氰基羥基肉桂酸（CHCA）、恩諾沙星D5同位素標(biāo)記物、環(huán)丙沙星D8同位素標(biāo)記物（美國Sigma公司）；恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星鹽酸鹽、培氟沙星、諾氟沙星等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及雞蛋樣品，均來自農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心；介孔沸石材料，包括Beta沸石及不同硅鋁比（SiO2/Al2O3）的ZSM5沸石等， 購自先豐納米材料科技有限公司（南京）；乙腈、甲醇等試劑均購于Merck公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 溶液配制 按照4∶2的質(zhì)量比，分別稱取傳統(tǒng)基質(zhì)CHCA和沸石（ZEO）顆粒，置于研缽中反復(fù)研磨混合15 min后，轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，加乙腈水（1∶1，V/V）混合溶劑1 mL， 配制成濃度 4 mg/mL CHCA2 mg/mL ZEO的懸濁液。采用以上方法，分別配制CHCA與不同沸石材料的混合基質(zhì)溶液：CHCA+Beta（40）、CHCA+ZSM5（38）、CHCA+ZSM5（170）、CHCA+ZSM5（500）（括號中的數(shù)字表示SiO2/Al2O3的比值）。采用相同的溶劑，配制4 mg/mL的CHCA基質(zhì)溶液用于比較。

模型肽Substance P溶于乙腈水（1∶1，V/V），濃度為0.5 mg/mL；待測物恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星鹽酸鹽、培氟沙星、諾氟沙星等氟喹諾酮類藥物小分子混合標(biāo)準(zhǔn)液用0.2%甲酸甲醇溶液配制，濃度分別為0.01 mg/mL。

2.2.2 樣品前處理 在雞蛋樣品中加入適量恩諾沙星D5、環(huán)丙沙星D8同位素標(biāo)記物，旋混、靜置，待平衡后加入1%甲酸乙腈溶液（V/V）4 mL沉淀蛋白，渦旋2 min后，4℃下8000 r/min離心10 min，重復(fù)上述步驟，合并兩次上清液。上清液中加入10 mL正己烷除脂，取下清液40℃氮吹干，復(fù)溶后過0.22 μm濾膜，待測。

2.2.3 質(zhì)譜分析 分別取1.0 μL配制好的基質(zhì)與待測樣品于樣品靶上混合，重復(fù)以上步驟后，待溶劑揮發(fā)完全，形成結(jié)晶后，利用MALDITOFMS儀器分析。待儀器狀態(tài)穩(wěn)定后， 連續(xù)采集100張質(zhì)譜圖的累加譜圖作為最終結(jié)果，數(shù)據(jù)采用Igor Pro軟件處理并分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 CHCA負(fù)載沸石用于MALDITOFMS分析的考察endprint

選擇模型肽Substance P（Sub P）為待測物，與傳統(tǒng)有機基質(zhì)CHCA直接混合于樣品靶上，在正離子模式下進行MALDITOFMS分析，結(jié)果見圖2A?？蓹z測到待測物質(zhì)譜峰[Sub P+H]+（m/z 1347）、[Sub P+Na]+（m/z 1369）， 同時也能明顯觀察到基質(zhì)CHCA相關(guān)的質(zhì)譜峰 [CHCA+H]+（m/z 190）、[CHCA+Na]+（m/z 212）和[2CHCA+H]+ （m/z 379），但是在200～400 Da質(zhì)量范圍內(nèi)，有很多碎片離子。為抑制基質(zhì)碎片，通過物理混合的方式，將CHCA負(fù)載于選擇質(zhì)子交換、SiO2/Al2O3比值為38的ZSM5沸石上。在相同的質(zhì)譜條件下，利用此復(fù)合基質(zhì)分析Sub P，如圖2B所示。通過比較發(fā)現(xiàn)，采用ZSM5沸石復(fù)合基質(zhì)，不但能有效抑制堿金屬相關(guān)的質(zhì)譜峰 [CHCA+Na]+、[SubP+Na]+以及離子碎片，簡化譜圖，而且可以極大提高Sub P的質(zhì)子化峰[Sub P+H]+的強度。因此，ZSM5沸石的介孔結(jié)構(gòu)對于CHCA的包裹作用，可有效保護CHCA分子的完整性，同時介孔結(jié)構(gòu)的均勻分布又能夠使CHCA很好地分散，提高MALDITOFMS測量的重復(fù)性。另一方面表明，沸石表面的質(zhì)子發(fā)生了轉(zhuǎn)移，并參與了Sub P離子化的過程，進而提高了其質(zhì)子化峰強度。這與Yamamoto等揭示的沸石能夠有效傳遞激光能量以及沸石表面質(zhì)子有助于提高目標(biāo)分析物質(zhì)子化峰強度的作用機理一致[16]。

3.2 沸石表面酸性大小的影響

由于沸石表面酸性大小與其結(jié)構(gòu)中SiO2/Al2O3比成反比，因此，為了進一步驗證沸石表面質(zhì)子對抑制碎片、提高樣品離子化效率等的作用機理，選擇相同結(jié)構(gòu)類型、但硅鋁比不同的ZSM5沸石進行比較。分別按照相同的比例與方法，將CHCA基質(zhì)負(fù)載于SiO2/Al2O3比值分別為170和500的ZSM5（170）和ZSM5（500）沸石材料上，在相同的條件下對Sub P進行MALDITOFMS分析。從圖3可見，與圖2B比較，當(dāng)表面質(zhì)子減少后，基質(zhì)與樣品的碎片又明顯增加，對堿金屬相關(guān)碎片的抑制能力減弱，而且[SubP+H]+的峰強度也有降低。由此可見，沸石表面布朗氏酸位多少或酸性大小，對于抑制碎片、提高待測物峰強度有直接關(guān)系。在3種不同硅鋁比的沸石中，ZSM5（38）沸石負(fù)載CHCA 的效果更好。

3.3 沸石結(jié)構(gòu)的影響

沸石作為介孔材料，由于其基本單元不同，介孔的大小也不完全相同，因此，介孔對于CHCA分子的包裹能力也可能不同。為了考察介孔結(jié)構(gòu)對于MALDITOFMS分析結(jié)果的影響，選擇SiO2/Al2O3比值接近ZSM5（38）的Beta（40）沸石。結(jié)果如圖4所示，采用Beta（40）沸石作為載體，對碎片的抑制作用更有效。通過與圖2B比較發(fā)現(xiàn)，質(zhì)譜峰[CHCA+H]+，[2CHCA+H]+明顯降低，因此推測Beta（40）沸石介孔對CHCA的包裹能力更強。根據(jù)范德瓦爾斯分子體積公式[17]計算可知，CHCA分子的理論直徑為0.68 nm，而所使用的的沸石材料ZSM5（38）與Beta（40）的表征結(jié)果顯示，其介孔大小分別為0.53～0.55 nm和0.55～0.70 nm，結(jié)果與我們推測的一致。Beta（40）具有較大的介孔孔徑，大于CHCA分子理論直徑，對負(fù)載的CHCA包裹與保護能力更強，因此，對基質(zhì)碎片的抑制作用也明顯。

3.4 沸石基質(zhì)用于藥物小分子的MALDITOFMS分析

本研究選擇了6種常見氟喹諾酮類藥物小分子作為被分析物，包括恩諾沙星（ENR）、環(huán)丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFX）、洛美沙星（LOM）、培氟沙星（PEF）和諾氟沙星（NOR），考察了Beta（40）沸石負(fù)載的CHCA在藥物小分子分析中的效果，同時與不負(fù)載的CHCA進行比較，如圖5所示。圖5A中， 6種氟喹諾酮類藥物質(zhì)譜峰分別為[ENR+H]+（m/z 360.67），[CIP+H]+（m/z 332.57），[OFX+H]+（m/z 362.66），[LOM+H]+（m/z 352.63），[NOR+H]+（m/z 320.54），[PEF+H]+（m/z 334.59），而且在質(zhì)量數(shù)300～400 Da 范圍內(nèi)有大量的碎片。為了實現(xiàn)抑制干擾碎片的目的，實驗選擇了Beta（40）沸石負(fù)載的CHCA復(fù)合基質(zhì)，在相同的實驗條件下分析藥物小分子，如圖5B所示，6種氟喹諾酮類藥物的質(zhì)子峰明顯，而且干擾的離子碎片被充分抑制，譜圖簡化。

為了考察沸石復(fù)合基質(zhì)在實際復(fù)雜樣品分析中應(yīng)用的可行性，選擇含有恩諾沙星和環(huán)丙沙星的陽性雞蛋樣品，在樣品前處理前添加適量D8環(huán)丙沙星（D8CIP）和D5恩諾沙星（D5ENR）同位素標(biāo)記物，待平衡后完成樣品前處理后檢測。如圖6所示，恩諾沙星、環(huán)丙沙星及其同位素標(biāo)記物的質(zhì)譜峰[ENR+H]+（m/z 360.67）、[CIP+H]+（m/z 332.57）、[D5ENR+H]+（m/z 365.67）和[D8CIP+H]+（m/z 340.57）被成功檢出，這為利用同位素內(nèi)標(biāo)實現(xiàn)MALDITOFMS定量分析提供了參考。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，介孔沸石材料負(fù)載傳統(tǒng)有機基質(zhì)作為一種新型的復(fù)合MALDI基質(zhì)，具有抑制干擾碎片、簡化質(zhì)譜圖、提高質(zhì)子化效率等優(yōu)點，可應(yīng)用于恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星和諾氟沙星等氟喹諾酮類小分子以及復(fù)雜基質(zhì)樣品中此類小分子物質(zhì)的MALDITOFMS分析。endprint