任海+呂小紅+杜萌

摘要：以抵御病蟲害、提高水稻產(chǎn)量的綠色研究領(lǐng)域?yàn)楸尘?，提出一種基于分子標(biāo)記的多抗水稻輔助育種方法。采取分子標(biāo)記輔助育種方法，能夠完成擁有理想基因型或基因型組合的個(gè)體選擇，并能夠采取常規(guī)育種手段完成優(yōu)良品種的培育。在此方法中，需要利用分子標(biāo)記對(duì)目的基因進(jìn)行跟蹤，選擇具有白葉枯病、稻瘟病、螟蟲抗性基因的親本，并從中選擇優(yōu)良恢復(fù)系和保持系，通過對(duì)目標(biāo)基因相鄰兩側(cè)的基因進(jìn)行分子標(biāo)記，結(jié)合雜交、回交、自交相結(jié)合的育種方法，并輔助于分子檢測(cè)和分子標(biāo)記的手段，在較短的培育周期內(nèi)獲得了多抗性征的優(yōu)質(zhì)稻種，最終通過遺傳鑒定得到育種結(jié)果。同時(shí)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)稱ELISA）檢測(cè)和6個(gè)感病指數(shù)檢測(cè)的結(jié)果表明，培育出的新稻種對(duì)于稻瘟病、螟蟲等病蟲害具有明顯的抗性，從而證實(shí)了基于分子標(biāo)記的輔助育種方法可成功地培植出具有多抗性征的優(yōu)質(zhì)稻種。

關(guān)鍵詞：水稻育種；分子標(biāo)記；ELISA檢測(cè)；稻瘟病

中圖分類號(hào)： S511.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）19-0154-04

收稿日期：2016-12-31

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2013BAD05B07）；耐鹽高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻高效栽培技術(shù)示范推廣（編號(hào)：GCNT-LN-16）；遼寧省博士科研啟動(dòng)基金（編號(hào)：20141169）；遼寧省水稻產(chǎn)業(yè)重大農(nóng)技推廣服務(wù)試點(diǎn)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：任 海（1984—），男，遼寧盤錦人，助理研究員，主要從事水稻栽培及鹽堿地改良研究。E-mail：61657137@qq.com。 在人類社會(huì)的各種糧食作物中，水稻占有極其重要的地位[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)以水稻為主食的人口比例超過40%，世界以水稻為主食的人口比例接近50%[2]。可見，水稻的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)對(duì)于國(guó)計(jì)民生有至關(guān)重要的作用。

長(zhǎng)期以來，水稻產(chǎn)量一直受到病害和蟲害的困擾。其中，水稻病害中比較突出的有白葉枯病、稻瘟病，水稻蟲害中比較突出的有螟蟲、褐飛虱[3-6]。抵制病蟲害的困擾、提高水稻產(chǎn)量，一直是水稻種植領(lǐng)域關(guān)心的重要問題。以農(nóng)藥為主的化學(xué)方法曾一度被廣泛應(yīng)用于水稻種植過程中，但最終被培育具有抗害基因稻種的綠色方法所取代。學(xué)者們不斷挖掘抗病基因和抗蟲基因，并結(jié)合植株表型進(jìn)行雜交和回交以獲得具有多抗基因的優(yōu)質(zhì)稻種[7]。但受到水稻培植周期的限制，這種方法獲得優(yōu)質(zhì)稻種的時(shí)間過長(zhǎng)[8]。但就目前來看，病蟲害防治方面依然存在很多問題，因此在今后的科研工作中要進(jìn)一步加大對(duì)病蟲害研究的力度。本研究借助分子標(biāo)記的方法，完成具有多抗基因的稻種培育，為縮短優(yōu)質(zhì)多抗稻種的育種周期提供借鑒。

1 研究原理、優(yōu)勢(shì)及現(xiàn)狀

1.1 研究原理

分子標(biāo)記輔助育種是結(jié)合目標(biāo)基因型鑒定技術(shù)和傳統(tǒng)育種技術(shù)的一種作物育種技術(shù)，該技術(shù)的運(yùn)用，須要借助有性雜交使改良親本中出現(xiàn)目的基因，能夠使育種材料的篩選效率及育種目標(biāo)的定向性得到提高[9]。在這一過程中，須要利用分子標(biāo)記對(duì)目的基因進(jìn)行跟蹤，且該分子標(biāo)記能夠與目的基因緊密連鎖或共分離，所以能夠從目標(biāo)區(qū)域和全基因組中篩選出育種分離群體中期望獲得的個(gè)體，從而有效縮短育種進(jìn)程。該方法的使用，須要完成前景選擇和背景選擇。前景選擇即直接選擇目標(biāo)基因，目標(biāo)基因與分子標(biāo)記間的連鎖程度將對(duì)方法的可靠性產(chǎn)生至關(guān)重要的影響。在選擇的過程中，如果目標(biāo)基因只有一個(gè)分子標(biāo)記，就要確保二者緊密連鎖，才能達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。因此，通過對(duì)目標(biāo)基因相鄰兩側(cè)的基因進(jìn)行分子標(biāo)記，能夠使選擇的正確率得到有效提高。背景選擇除了進(jìn)行目標(biāo)基因的選擇，還要選擇基因組中其他性狀。采取該選擇方式，能夠使遺傳背景盡快恢復(fù)為輪回親本基因組，從而使育種年限得到有效縮短。此外，采用該選擇方法也能減少連鎖累贅。目前，人類已經(jīng)完成水稻高密度分子標(biāo)記連鎖圖譜的創(chuàng)建，因此能夠從選育群體中的各單株全基因組進(jìn)行選擇。表1為常用分子標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)比較，在實(shí)際采用分子標(biāo)記法時(shí)還應(yīng)結(jié)合試驗(yàn)條件及目的，選用適宜的標(biāo)記類型。

1.2 研究?jī)?yōu)勢(shì)

采取分子標(biāo)記輔助育種方法，能夠完成具有理想基因型或基因型組合的個(gè)體選擇，并采取常規(guī)育種手段完成優(yōu)良品種的培育。該方法能夠在篩選材料時(shí)以多個(gè)基因?yàn)槟繕?biāo)，并在一個(gè)育種材料中實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的聚合，因此能夠有效改良品種品質(zhì)。相較于普通篩選方法，可以完成目標(biāo)性狀的提前篩選。比如在育性恢復(fù)鑒定方面，如果能夠提前1代，就可以在苗期完成后期性狀的鑒定。此外，采用該育種方法也能使目標(biāo)性狀的鑒定得到延遲。例如，在鑒定多種病蟲害的抗性時(shí)，植物很可能因?yàn)樵馐苣撤N病蟲害脅迫而出現(xiàn)死亡或絕種現(xiàn)象。一旦出現(xiàn)這種情況，就難以進(jìn)行多種病蟲害抗性的同時(shí)鑒定，并使植株在其他性狀上的優(yōu)異表現(xiàn)材料遭到喪失。但如果采用分子標(biāo)記方法，就能完成多性狀目標(biāo)基因的鑒定，并在收種后實(shí)現(xiàn)分類驗(yàn)證。從總體上來看，采用分子標(biāo)記輔助育種方法能夠體現(xiàn)DNA水平上的選擇差異，并對(duì)遺傳變異進(jìn)行反映，所以能夠通過在不同時(shí)期的選擇避免植株受周圍環(huán)境影響，從而使水稻的育種效率和準(zhǔn)確性得到有效提高。

1.3 研究現(xiàn)狀

在抗性水稻品種培育方面，分子標(biāo)記輔助育種方法已經(jīng)取得了一定的應(yīng)用進(jìn)展。從原理上來看，該方法可以通過實(shí)現(xiàn)有利性狀基因的轉(zhuǎn)移和多個(gè)抗病基因的聚合來增強(qiáng)品種的抗性和抗譜差異，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗性水稻品種的培育。基因聚合是在一個(gè)基因組中實(shí)現(xiàn)分散在不同品種中目標(biāo)基因的聚合，能夠用相對(duì)短的時(shí)間完成高產(chǎn)、多抗和優(yōu)質(zhì)雜交稻親本或品種的培育[10]。通過在一個(gè)作物品種中聚合不同抗病蟲基因，能夠使該作物抗病蟲能力的持久性得到增強(qiáng)，以避免在后續(xù)種植中進(jìn)行殺蟲劑和各種農(nóng)藥的噴灑。

白葉枯病為水稻的三大病害之一，感染該病的水稻產(chǎn)量會(huì)損失20%～30%，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)霈F(xiàn)顆粒無收的現(xiàn)象，因此其病害研究得到了諸多國(guó)家的重視。在抗白葉枯病水稻育種工作中，中國(guó)水稻研究所采取該方法完成了Xa21的轉(zhuǎn)育，并完成了中恢218等具有強(qiáng)抗性和高產(chǎn)特點(diǎn)的水稻品種培育，其中Xa21是白葉枯病抗性基因，且具有廣譜抗性[10]。隨后，白葉枯病抗性基因Xa23也被李進(jìn)波等利用分子標(biāo)記選擇方法轉(zhuǎn)育出來[10]。經(jīng)國(guó)際注冊(cè)確認(rèn)的水稻白葉枯病抗性基因接近40個(gè)，其中包含26個(gè)顯性基因和38個(gè)隱性基因[11]。相較于其他基因，Xa23是在水稻育種中容易實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇的基因，因此具有一定的導(dǎo)入價(jià)值[12]。endprint

稻瘟病為真菌性病害，在世界范圍內(nèi)都屬于危害最嚴(yán)重的水稻病害，具有危害大、分布廣和發(fā)病率高等特點(diǎn)，并且一旦染病就難以進(jìn)行控制，每年都會(huì)導(dǎo)致我國(guó)損失約10億kg的稻谷。在水稻的整個(gè)生育期內(nèi)，都有可能發(fā)生稻瘟病。實(shí)踐研究證明，想要進(jìn)行稻瘟病的防治，還要通過加強(qiáng)抗病品種的培育和種植來實(shí)現(xiàn)。而稻瘟病病菌群體中的毒性小種會(huì)因大面積單一品種的種植取得傳播優(yōu)勢(shì)，容易造成病害流行，因此還要進(jìn)行持久抗病品種的選育。在水稻抗稻瘟病育種方面，官華忠等則利用SRM22作為分子標(biāo)記，完成了Pi-9抗病基因的轉(zhuǎn)育[9]，陳學(xué)偉等采取分子標(biāo)記方法完成了Pi-d（t）抗病基因的轉(zhuǎn)育[13]。目前，人類已經(jīng)得到了近70多個(gè)主效抗性基因，可用于水稻抗稻瘟病育種。

在水稻蟲害方面，螟蟲為危害性較大的蟲害。目前，在浙江等地區(qū)，主要用于進(jìn)行螟蟲害防治的化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)品效果普遍較差。在這一背景下，轉(zhuǎn)Bt基因或sck基因的抗螟蟲水稻育種問題引起了人們的關(guān)注。在該方面，朱禎等使用潮霉素對(duì)雙價(jià)cry1Ac（Bt）/sck抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行了培育[14]。而李冬虎等通過研究發(fā)現(xiàn)，cry1Ac/sck能夠較好地抵抗二化螟和三化螟等螟蟲[12]。

從總體上來看，運(yùn)用分子標(biāo)記輔助育種方法進(jìn)行的抗性水稻品種培育，在水稻品種質(zhì)量性狀選擇方面取得了一定的成效。但是，含有單一抗病蟲基因的水稻材料存在一定的局限性，即如果進(jìn)行大面積推廣和長(zhǎng)時(shí)間種植就會(huì)出現(xiàn)抗性逐漸降低的問題。因此越來越多的學(xué)者開始對(duì)水稻多種病蟲害抗性基因的聚合問題展開研究，以便通過將多抗性基因聚合到同一材料中而增強(qiáng)材料對(duì)病蟲害的抗性。在雜交水稻品種研究方面，陽海寧等利用分子標(biāo)記法分別完成了Xa23與Bph3的導(dǎo)入，從而獲得了144份雙抗性基因聚合系[15]。但從接種測(cè)試結(jié)果來看，與單一抗性基因的株系相比，具有雙抗性基因聚合系的抗性水平并未得到明顯提高[15]。而毛鐘警等通過MAS技術(shù)，在同一材料中實(shí)現(xiàn)了抗褐飛虱基因與抗白葉枯病基因的聚合，并完成了個(gè)體的培育[16]。通過在3個(gè)新育成的水稻恢復(fù)系中進(jìn)行Pi9和Xa23的導(dǎo)入，田大剛等完成了具有更高稻瘟病與白葉枯病抗性的恢復(fù)系培育，但得到的品種在材料和農(nóng)藝性狀方面與原有恢復(fù)系無明顯差別[17]。在3種及以上多抗性基因聚合方面，分子標(biāo)記方法也得到了應(yīng)用。為對(duì)水稻品種的抗病蟲高效性與持久性展開深入研究，一些育種專家開始采用分子標(biāo)記輔助選擇方法和回交轉(zhuǎn)育法進(jìn)行抗白葉枯病、抗稻瘟病等多個(gè)基因的聚合，并獲得了雜交育種的中間材料。陳圣等采取該方法，將抗水稻螟蟲、抗白葉枯病和抗稻瘟病的3種基因聚合到一起，并獲得了純合株系；該方法不僅能夠使水稻抗譜得到擴(kuò)寬，還能使抗性品種的使用年限得到延長(zhǎng)[18]。目前，有關(guān)水稻病蟲抗性基因的抗譜資源依然較少，須要進(jìn)行持續(xù)不斷的開發(fā)和挖掘。而在野生材料中，則蘊(yùn)含較多抗性較好的資源，但這些材料多含有不利基因，一些基因或與目標(biāo)抗性基因連鎖，采用連續(xù)回交等方式容易丟失目標(biāo)抗性基因。因此，目前還須要對(duì)現(xiàn)有發(fā)掘的抗性基因進(jìn)行精確定位，以便完成更多水稻SSR標(biāo)記的開發(fā)，進(jìn)而有效提高分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

在多抗水稻輔助育種的過程中，選擇了以下3種主要的試驗(yàn)材料：CBB23水稻品種，攜帶有Xa23基因，該基因?qū)τ谒景兹~枯病具有顯著抗性；Q1347水稻品種，攜帶有pi9基因，該基因?qū)τ诘疚敛【哂酗@著抗性；科豐6號(hào)水稻品種，攜帶有cry1Ac/sck雙組基因，該基因?qū)τ谒久x具有顯著抗性。

在水稻幼苗期摘取葉尖3～4 cm的新鮮葉片，置于 1.5 mL 離心管中，并于-20 ℃的條件下貯存，以供運(yùn)用CTAB法進(jìn)行少量DNA提取使用。

2.2 育種過程

為實(shí)現(xiàn)多抗水稻稻種的培育，本研究選擇優(yōu)良恢復(fù)系和保持系作為試驗(yàn)材料，結(jié)合雜交、回交、自交等育種方法，并輔助以分子檢測(cè)和分子標(biāo)記，最終通過遺傳鑒定得到育種結(jié)果。詳細(xì)的育種過程如下：（1）從試驗(yàn)材料中選擇育種親本，并分析親本之間的多態(tài)性征；（2）確定親本中的受體和供體，并執(zhí)行受體和供體之間的雜交；（3）將（2）收獲的雜交種和受體再次進(jìn)行雜交，并結(jié)合田間性狀和分子標(biāo)記的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步篩選；（4）將（3）篩選出的材料和受體再次進(jìn)行雜交，并結(jié)合田間性狀和分子標(biāo)記的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步篩選；（5）將（4）篩選出的材料和受體再次進(jìn)行雜交，并以此雜交種和（4）的雜交種進(jìn)行回交；（6）在（5）的雜交種中，結(jié)合田間性狀和分子標(biāo)記，選擇優(yōu)良單株進(jìn)行2次自交，以獲得育種結(jié)果。

目前，這種方法是常用的改良品種性狀的方法，可以將目的性狀基因的另一品系與供體進(jìn)行多次回交，以便將供體親本中的目的基因轉(zhuǎn)移至受體親本，以獲得更優(yōu)良的輪回親本基因型。但是，在回交育種的過程中，有利基因?qū)氲耐瑫r(shí)，與之連鎖的不利基因也被導(dǎo)入。采用分子標(biāo)記目的基因，在回交時(shí)則可以直接在目的基因附近進(jìn)行個(gè)體重組，進(jìn)而提升選擇效率，避免“連鎖累贅”的發(fā)生。水稻本身擁有較多的抗病基因，通過回交轉(zhuǎn)育能夠確保得到的抗性品種安全、有效。

育種的具體實(shí)施過程為：（1）選擇具有聚合基因Xa23、pi9的優(yōu)良稻系作為母本，將具有雙組合基因cry1Ac/sck的優(yōu)良稻系作為父本，于2014年3月在海南試驗(yàn)地進(jìn)行雜交，獲得S1。（2）將S1樣本，于2014年6月在福建試驗(yàn)地進(jìn)行種植，苗期輔助以分子標(biāo)記。選擇其中12株優(yōu)良單株進(jìn)行自交，于2014年9月收獲S2。（3）于2014年11月將S2種植于海南試驗(yàn)地，苗期輔助以分子標(biāo)記，篩選512株優(yōu)良單株進(jìn)行自交，于2015年4月收獲S3。

2.3 分子標(biāo)記方法

輔助分子標(biāo)記，可以縮短育種周期，提高育種效率。因此，須要了解Xa23、pi9、cry1Ac/sck等3個(gè)基因的分子檢測(cè)方法。

基因Xa23和表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，簡(jiǎn)稱EST）標(biāo)記符合共顯特征，兩者的遺傳距離為0.8 cm，預(yù)期條帶800 bp?？刹捎脻舛葹?%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，分子檢測(cè)引物如下：Xa23F，5′-TAAGTTGTACTACGACCCCA-3′；Xa23R，5′-CACATGAAGAGCTGGAAACG-3′。endprint

基因pi9可檢測(cè)自身，預(yù)期條帶2 000 bp?？刹捎脻舛葹?%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，分子檢測(cè)引物如下：pi9F，5′-ATGGTCCTTTATCTTTATTG-3′；pi9R，5′-TTGCTCCATC TCCTCTGTT-3′。

基因cry1Ac/sck可檢測(cè)自身，預(yù)期條帶分別為800、400 bp。可采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，分子檢測(cè)引物如下：crylAcF，5′-TGCAGAGAGCTTCAGAGAGTG-3′；crylAcR，5′-ACACCCTGACCTAGTTGAGC-3′；sckF，5′-AAAATGAAGAGCACCATCTTC-3′；sckR，5′-TCTAGAGTT CATCTTTCTCATC-3′。

2.4 抗性檢測(cè)方法

為了證實(shí)本研究培育的S3純合株系所具有的多抗性特征，需進(jìn)行進(jìn)一步抗性檢測(cè)。

首先，采用ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)S3純合株系中cry1Ac的表達(dá)量。株系的cry1Ac表達(dá)量反映了稻種對(duì)螟蟲的抑制效果，主要通過檢測(cè)蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）含量來確定cry1Ac的表達(dá)量。在檢測(cè)的過程中，使用雙抗體夾心法進(jìn)行水稻Bt含量的檢測(cè)，即對(duì)其中一個(gè)夾板進(jìn)行90 min的紫外線照射處理，然后分別用處理和未處理夾板進(jìn)行Bt梯度的測(cè)定。在測(cè)定過程中，須要使用碳酸鹽緩沖溶液（carbonate buffer solution，簡(jiǎn)稱CBS）進(jìn)行IgG溶液的稀釋，直至溶液濃度達(dá)到1 μg/mL。夾板上共100個(gè)孔，每孔加 100 μL，并在4 ℃條件下包被過夜。在封閉孔時(shí)，需要每孔添加濃度為2%的牛血清白蛋白135 μL，并在37 ℃條件下封閉1 h。

其次，采用6個(gè)感病指數(shù)來檢驗(yàn)S3純合株系的稻瘟病及其他常見稻病的抗病性征。在測(cè)試前，需要將在濾紙片上保存的菌株轉(zhuǎn)移至酵母淀粉培養(yǎng)基上，在28 ℃的暗箱中培養(yǎng) 4～5 d后，將其轉(zhuǎn)移至米糠培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～8 d，然后將培養(yǎng)皿上的菌絲刮去，并在25～28 ℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。約3 d后，利用蒸餾水將孢子清洗下來，然后利用擦鏡紙進(jìn)行過濾，并完成孢子懸液的培養(yǎng)，以供接種使用。在育苗時(shí)，將長(zhǎng)至3葉1心的水稻幼苗移至發(fā)病室內(nèi)，利用空壓機(jī)連接頭進(jìn)行噴霧接種。每盤苗須要噴灑50 mL孢子懸液，并在保濕筒內(nèi)持續(xù)保濕24 h，然后移到筒外，進(jìn)行定時(shí)噴霧。在接種后6～7 d，植株病情已經(jīng)基本穩(wěn)定，可以進(jìn)行發(fā)病情況的調(diào)查。在秧齡達(dá)到25 d后，進(jìn)行秧苗移栽，并且在之后1個(gè)月內(nèi)不使用任何殺蟲劑。在進(jìn)行蟲害鑒定時(shí)，在定圃四周種植8行感蟲品種作為對(duì)照，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)縱卷葉螟蟲的誘集和增加。以自然誘集稻縱卷葉螟產(chǎn)卵為蟲源進(jìn)行鑒定，并利用細(xì)目紗網(wǎng)對(duì)需要鑒定的水稻進(jìn)行籠罩。完成鑒定后，噴施5%氟蟲腈懸浮劑，以免蟲源向外圍擴(kuò)散。在接種時(shí)，仍然采用表1中的3個(gè)樣本。

3 結(jié)果與分析

3.1 分子標(biāo)記

多抗稻種培育成功后，對(duì)各純合株系進(jìn)行分子檢測(cè)，其中一個(gè)樣本的分子檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，該樣本同時(shí)具備了抑制白葉枯病的基因Xa23、抑制稻瘟病的基因pi9、抑制螟蟲的雙組合基因cry1Ac/sck。從分子檢測(cè)的角度證明了多抗稻種的成功培育。

3.2 抗性檢測(cè)

從表3可以看出，S3的3個(gè)樣本的Bt相對(duì)含量分別達(dá)到了0.121 1%、0.122 7%、0.121 2%，均超過了0.100 0%，說明3個(gè)樣本對(duì)螟蟲存在明顯抗性。

從表4可以看出，S3等3個(gè)樣本的6個(gè)感病指數(shù)均低于

5%，充分說明3個(gè)樣本對(duì)稻瘟病及其他稻病具有明顯抗性。而在螟蟲防治方面，S3的3個(gè)樣本表現(xiàn)出了良好的縱卷葉螟抗性，很少有卷葉出現(xiàn)，并且卷葉程度較低，多數(shù)葉肉并未受到損傷，而對(duì)照組的卷葉率則達(dá)到了90%以上，并且葉肉受到了嚴(yán)重蠶食。

綜合以上2組抗性檢測(cè)結(jié)果，證實(shí)了基于分子標(biāo)記的輔助育種方法成功地培育出了具有多抗性征的優(yōu)質(zhì)稻種，可以防治主要病蟲害對(duì)稻種的危害。

根據(jù)水稻育種領(lǐng)域的已有文獻(xiàn)可知，基因Xa23對(duì)于白葉枯病的抑制效果非常優(yōu)異，基因pi9對(duì)于稻瘟病的抑制效果非常優(yōu)異，雙組合基因cry1Ac/sck對(duì)于螟蟲的抑制效果非常優(yōu)異。本研究在分子檢測(cè)標(biāo)記的技術(shù)手段輔助下，將這3種優(yōu)秀基因進(jìn)行聚合，培育出具有多抗屬性的水稻優(yōu)良恢復(fù)系。利用與抗白葉枯病與抗稻瘟病基因連鎖的分子標(biāo)記與抗螟蟲基因的直接相關(guān)引物對(duì)基因供體親本展開多態(tài)性分析可以發(fā)現(xiàn)，采取的分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，EST標(biāo)記在供體親本中擴(kuò)增出800 bp的特征條帶，基因pi9在供體親本中擴(kuò)增出2 000 bp特征條帶，基因cry1Ac、sck在供體親本中分別擴(kuò)增出800、400 bp特征條帶。在親本之間，各連鎖標(biāo)記具有多態(tài)性，能夠在分子標(biāo)記輔助選擇中得到應(yīng)用。利用標(biāo)記與檢測(cè)的基因進(jìn)行分離世代選擇，最終完成3種基因純合株系的聚合。

4 討論

水稻是中國(guó)乃至世界范圍內(nèi)最重要的糧食作物，其產(chǎn)量關(guān)乎人類的生存和發(fā)展。如何有效抑制病害和蟲害、提高水稻產(chǎn)量，是水稻種植領(lǐng)域需要持續(xù)關(guān)注的焦點(diǎn)問題。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界上危害水稻的侵染性病害達(dá)300多種，其中有些病害分布在全世界范圍內(nèi)，有些則存在于部分地區(qū)。在我國(guó)白葉枯病、稻瘟病、螟蟲都是重要的水稻病蟲害，因此選育能夠抵抗這3種水稻病蟲害的多抗水稻可帶來明顯的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。在過去一段時(shí)間內(nèi)，多利用抗病親本的主效抗病基因進(jìn)行水稻育種。受病原菌致病小種變化因素的影響，在進(jìn)行單一抗病品種大面積種植時(shí)容易出現(xiàn)水稻大面積感病問題，繼而導(dǎo)致水稻生產(chǎn)承受更多損失。因此，須要進(jìn)行多個(gè)抗病基因的聚合，從而實(shí)現(xiàn)多抗水稻品種的培育，更好地預(yù)防水稻生產(chǎn)病害。此外，抗病害基因育種的綠色方法，是取代以農(nóng)藥為主的化學(xué)方法的必然選擇，也是今后水稻育種領(lǐng)域的主要發(fā)展趨勢(shì)。但在過去較長(zhǎng)的時(shí)間里，基因聚合法一直因?yàn)闊o法實(shí)現(xiàn)抗性基因的有效檢測(cè)而無法得到實(shí)踐應(yīng)用，以致于持久抗性水稻品種的培育問題無法得到有效解決。分子標(biāo)記輔助選擇育種方法，能夠利用建立在DNA多態(tài)性上的分子標(biāo)記技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)抗性基因的標(biāo)記，從而有效進(jìn)行聚合體抗性基因的檢測(cè)。endprint

本研究表明，含有單一基因Xa23、pi9、cry1Ac/sck的單株，可以通過雜交、回交、自交等手段，獲得具有多抗性征的優(yōu)良稻種。由此可見，采用基因聚合方法能夠完成多抗水稻品種的有效培育。分子檢測(cè)、分子標(biāo)記等手段的使用，可以縮短育種周期、簡(jiǎn)化培育過程，是多抗水稻品種培育的有效方法。本研究結(jié)果為多抗優(yōu)質(zhì)水稻品種的培育提供了一種可以借鑒的思路和方法。另外，除了常規(guī)育種工作，還應(yīng)在工作實(shí)用化和雜種優(yōu)勢(shì)評(píng)價(jià)方面展開深入研究，因此，在后續(xù)研究中，進(jìn)一步將得到的3抗材料與優(yōu)良恢復(fù)系親本進(jìn)行配組，并評(píng)價(jià)綜合指標(biāo)，以便使得到的水稻改良品種能夠被廣泛應(yīng)用。此外，還應(yīng)對(duì)改良得到的同一恢復(fù)系的遺傳背景、配合力及農(nóng)藝性狀等方面的差異展開評(píng)價(jià)。

參考文獻(xiàn)：

[1]湯國(guó)華，謝紅軍，余應(yīng)弘. 雜交水稻機(jī)械化制種研究的現(xiàn)狀、問題與對(duì)策[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（3）：133-136.

[2]王躍星，吳 昆，方云霞，等. 水稻小粒密穗突變體sep1的遺傳分析、基因定位與育種利用[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2014，28（3）：229-234.

[3]裴慶利，王春連，劉丕慶，等. 分子標(biāo)記輔助選擇在水稻抗病蟲基因聚合上的應(yīng)用[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2011，25（2）：119-129.

[4]趙 鵬，馮冉冉，肖巧珍，等. 聚合抗褐飛虱基因bph20（t）和bph21（t）及抗稻瘟病基因Pi9水稻株系篩選[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，44（6）：885-892.

[5]樓 玨，楊文清，李仲惺，等. 聚合稻瘟病、白葉枯病和褐飛虱抗性基因的三系恢復(fù)系改良效果的評(píng)價(jià)[J]. 作物學(xué)報(bào)，2016，42（1）：31-42.

[6]李玉營(yíng)，李聲春，李曉方. 分子標(biāo)記輔助選擇聚合水稻抗蟲抗病基因育種研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（6）：119-126.

[7]HeangD，SassaH.An atypical bHLH protein encoded by positive

regulator of grain length 2 is involved in controlling grain length and weight of rice through interaction with a typical bHLH protein APG[J]. Breeding Science，2012，62（2）：133-141.

[8]Song X J，Kuroha T，Ayano M. Rare allele of a previously unidentified histone H4 acetyltransferase enhances grain weight，yield，and plant biomass in rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2015，112（1）：76-81.

[9]官華忠，陳志偉，潘潤(rùn)森，等. 通過標(biāo)記輔助回交育種改良優(yōu)質(zhì)水稻保持系金山B-1的稻瘟病抗性[J]. 分子植物育種，2006，4（1）：49-53.

[10]李進(jìn)波，王春連，夏明元，等. 分子標(biāo)記輔助選擇Xa23基因培育雜交稻抗白葉枯病恢復(fù)系[J]. 作物學(xué)報(bào)，2006，32（10）：1423-1429.

[11]Dixit S，Swamy B P M，Vikram P，et al. Fine mapping of QTLs for rice grain yield under drought reveals sub-QTLs conferring a response to variable drought severites[J]. Theoretical and Applied Genetics，2012，125（1）：155-169.

[12]李冬虎，傅 強(qiáng)，王 鋒，等. 轉(zhuǎn)sck/cry1Ac雙基因抗蟲水稻對(duì)二化螟和稻縱卷葉螟的抗蟲效果[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2004，18（1）：43-47.

[13]陳學(xué)偉，李仕貴，馬玉清，等. 水稻抗稻瘟病基因Pi-d（t）1、Pi-b、Pi-ta2的聚合及分子標(biāo)記選擇[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2004，20（5）：708-714.

[14]朱 禎. 高效抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的研究與開發(fā)[J]. 中國(guó)科學(xué)院院刊，2001（5）：353-357.

[15]陽海寧，韋紹麗，李孝瓊，等. 標(biāo)記輔助培育水稻抗稻褐飛虱和稻白葉枯病基因聚合系[J]. 分子植物育種，2010，8（1）：11-19.

[16]毛鐘警，劉丕慶，蔣利和，等. 分子標(biāo)記輔助選擇聚合水稻Xa23和bph20（t）基因[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，42（8）：835-838.

[17]田大剛，陳在杰，陳子強(qiáng)，等. 分子標(biāo)記輔助選育聚合抗稻瘟病基因和抗白葉枯病基因的水稻改良新恢復(fù)系[J]. 分子植物育種，2014，12（5）：843-852.

[18]陳 圣，倪大虎，陸徐忠，等. 分子標(biāo)記輔助選擇聚合Xa23，Pi9和Bt基因[J]. 生物學(xué)雜志，2009，26（3）：7-9. 龍瑞平，李貴勇，夏瓊梅，等. 不同秧齡與多效唑噴施對(duì)機(jī)插水稻生長(zhǎng)特性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（19）：158-160.endprint