來蔣麗 劉姝， 胡晟源 顧張慧 王淑軍 房耀維，

（1. 淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，連云港 222005；2. 江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，連云港 222005）

一株產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶海洋細(xì)菌的篩選、鑒定及發(fā)酵優(yōu)化

來蔣麗1劉姝1，2胡晟源1顧張慧1王淑軍2房耀維1，2

（1. 淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，連云港 222005；2. 江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，連云港 222005）

利用對硝基-N-乙酰苯胺篩選培養(yǎng)基從海州灣海域海泥中篩選獲得產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶細(xì)菌MCDA02。經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA序列分析初步鑒定該菌株為解角質(zhì)素微桿菌。通過單因素優(yōu)化和正交試驗優(yōu)化，得出最優(yōu)發(fā)酵條件。在單因素優(yōu)化基礎(chǔ)上，利用正交試驗優(yōu)化獲得菌株MCDA02最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度25℃，培養(yǎng)基起始pH7.0，裝液量50 mL/250 mL，幾丁質(zhì)3%，發(fā)酵時間48 h。在此發(fā)酵條件下，菌株MCDA02發(fā)酵水平達(dá)到158.47 U/mL，是優(yōu)化前的3.2倍。試驗結(jié)果為菌株MCDA02幾丁質(zhì)脫乙酰酶的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

幾丁質(zhì)脫乙酰酶；海洋細(xì)菌；鑒定；產(chǎn)酶條件

幾丁質(zhì)普遍存在于昆蟲的外骨骼，甲殼類動物的殼，大多數(shù)真菌和部分藻類的細(xì)胞壁，是僅次于纖維素居世界第二的天然有機(jī)生物大分子［1］。僅在水生生態(tài)系統(tǒng)，幾丁質(zhì)每年的產(chǎn)量就超過1011t［2］。幾丁質(zhì)難溶于水和有機(jī)溶劑，在工業(yè)上難以應(yīng)用［3，4］。幾丁質(zhì)脫乙酰度達(dá)到55%以上得到殼聚糖。殼聚糖分子中有大量游離氨基，具有良好的生物相容性和生物可降解性，并具有抗癌、降低膽固醇、降血壓等生物活性，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕工、環(huán)保和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域［5，6］。

幾丁質(zhì)脫乙?；蓺ぞ厶怯谢瘜W(xué)和生物兩種方法?；瘜W(xué)法需耗費大量的40%NaOH，產(chǎn)品質(zhì)量不均一，且導(dǎo)致環(huán)境惡化［7］。生物法是利用幾丁質(zhì)脫乙酰酶（Chitin deacetylase，E.C. 3.5.1.41）催化幾丁質(zhì)脫乙?；Ρ然瘜W(xué)方法，生物法條件溫和，脫乙酰程度一致，且綠色環(huán)保。此外，將幾丁質(zhì)脫乙酰酶與幾丁質(zhì)酶聯(lián)用，可以生產(chǎn)出化學(xué)法不能生產(chǎn)的具有特定乙酰化位置，以及分子質(zhì)量分布范圍窄的殼聚糖產(chǎn)品［8-10］。

目前，產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的真菌菌株報道較多，有被孢霉屬［11］、根霉屬［12］、帚霉屬［13］等。產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的細(xì)菌有產(chǎn)堿桿菌屬［14］和紅球菌屬［15］。相對于真菌，細(xì)菌產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶速率更快［5，16］。目前報道的幾丁質(zhì)脫乙酰酶存在產(chǎn)酶活力低、脫乙酰效果差，催化溫度較高等問題［17］。海洋中存在大量幾丁質(zhì)，蘊含著大量分泌幾丁質(zhì)脫乙酰酶的微生物。因此，本研究從海洋樣品中篩選產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)脫乙酰酶細(xì)菌，對菌株進(jìn)行鑒定和發(fā)酵條件研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 海泥樣品采集于中國黃海海州灣燕尾港海域，采集后置于冰盒，并盡快帶回實驗室進(jìn)行試驗研究。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L，F(xiàn)ePO40.1 g/L，瓊脂20 g/L，陳海水配制，pH7.0；（2）篩選培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì) 2 g/L，K2HPO40.7 g/L，KH2PO40.3 g/L，MgSO40.5 g/L，對硝基-N-乙酰苯胺0.2 g/L，陳海水配制，pH7.0；（3）種子培養(yǎng)基：酵母粉1 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 10 g/L，陳海水配制，pH7.0；（4）發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿5 g/L，可溶性淀粉 3 g/L，（NH4）2SO43 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO40.5 g/L，粉末幾丁質(zhì)10 g/L，陳海水配制，pH 8.0。

1.1.3 藥品與儀器 幾丁質(zhì)由江蘇澳新生物工程有限公司提供，其它生化試劑均為分析純購于上海博微生物科技有限公司，引物由南京思普金生物公司合成。高速冷凍離心機(jī)購于美國SIGMA公司，分光光度計購于杭州明基科學(xué)儀器有限公司，Nikon 90i全電動顯微鏡購于上海普赫光電科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶菌株的篩選 稱取1 g海泥，加入9 mL滅菌陳海水，攪拌均勻后用滅菌陳海水進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋。分別吸取10-4、10-5、10-6的稀釋液100 μL涂布3個平板。平板倒置于25℃培養(yǎng)，觀察菌落生長及變色圈產(chǎn)生情況。挑選產(chǎn)生黃色變色圈的菌株在2216E培養(yǎng)基三區(qū)劃線純化至單菌落后，斜面保藏。菌株接種于種子培養(yǎng)液培養(yǎng)，再以1%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃，180 r/min培養(yǎng)60 h后，將發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，上清液作為粗酶液測定幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性。

1.2.2 菌株MCDA02的鑒定 根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊，對純化培養(yǎng)的菌株MCDA02進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定［18］。

1.2.3 菌株的16S rDNA序列擴(kuò)增及分析 利用基因組提取試劑盒提取菌株的基因組，進(jìn)行16S rDNA的擴(kuò)增。PCR通用引物為：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反應(yīng)體系為：PCR mix（21 μL），上下游引物（各 1 μL），DNA 模板（2 μL）。反應(yīng)程序 ：94℃ 變性 5 min；94℃變性 30 s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，32個循環(huán)；72℃終延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京思普金生物公司進(jìn)行測序，所得的序列上傳GenBank。通過Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對，并用MEGA7.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹。1.2.4 單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件 將種子液以1%接種量接種至起始pH為8.0的發(fā)酵培養(yǎng)基。以25℃、裝液量30%、180 r/min發(fā)酵60 h為基本條件，分別對發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、裝液量、起始pH、誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)行單因素優(yōu)化。

1.2.5 正交法優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件 采用正交法得出菌株的最佳發(fā)酵條件。選擇發(fā)酵時間、溫度、起始pH、裝液量、誘導(dǎo)劑濃度為5個單因素，每個因素取4個水平，測定幾丁質(zhì)脫乙酰酶的酶活，進(jìn)行L16（45）正交試驗，每個試驗重復(fù)3次。1.2.6 幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活力的測定 試管中加入30℃預(yù)保溫的0.05 mol/L pH7.0磷酸緩沖液3 mL，200 mol/L的對硝基乙酰苯胺水溶液1 mL，酶液1 mL，于30℃水浴反應(yīng)15 min，沸水浴終止酶促反應(yīng)，8 000 r/min離心10 min，測定上清液的吸光度。以添加1 mL同樣濃度沸水浴滅活15 min的酶液作為對照。酶活單位（U）定義：在上述反應(yīng)條件下每小時產(chǎn)生1 μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析 每組試驗設(shè)3組平行，重復(fù)試驗3次，試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差（±s）（n=3）表示，采用SPSS Statistics19.0軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶菌株的篩選和鑒定

2.1.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶菌株的篩選 將稀釋的土樣涂布于含對硝基-N-乙酰苯胺的篩選培養(yǎng)基，挑選產(chǎn)生黃色變色圈的菌落，獲得能夠產(chǎn)生變色圈的菌株5株。菌株MCDA02產(chǎn)生的黃色變色圈見圖1。用接種環(huán)將產(chǎn)生變色圈的菌株接入種子培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，以1% 接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃，180 r/min培養(yǎng)60 h。發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，測定發(fā)酵上清中幾丁質(zhì)脫乙酰酶的酶活。結(jié)果見表1，菌株MCDA02酶活最高，達(dá)到48.13 U/mL。

圖1 菌株MCDA02在篩選平板上生成的變色圈

表1 菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活

2.1.2 菌株MCDA02的形態(tài)學(xué)特征 菌株MCDA02接種于2216E固體培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)48 h后，菌落形態(tài)為黃色，半透明，表面光滑濕潤，圓形，邊緣齊整，中心稍突起，易挑取（圖2-A）。對菌株MCDA02進(jìn)行革蘭氏染色觀察，該菌株為革蘭氏陽性短桿菌，無芽孢（圖2-B）。

圖2 菌株MCDA02的形態(tài)學(xué)特征

2.1.3 菌株MCDA02的生理生化特征 菌株MCDA02的生理生化特征見表2。該菌株淀粉水解、吲哚試驗、硫化氫產(chǎn)生、精氨酸脫羧酶試驗均呈陽性，檸檬酸鹽利用、接觸酶、明膠液化、VP試驗、甲基紅、硝酸鹽還原試驗均為陰性。

表2 MCDA02菌株的生理生化試驗結(jié)果

2.2 菌株MCDA02的16S rDNA鑒定

將菌株MCDA02的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物測序獲得的1 395 bp序列提交至GenBank（登錄號：KY385626），并與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)與菌株Microbacterium keratanolyticum OU01（登錄號：DQ118082.1）16S rDNA相似性達(dá)100%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3，菌株MCDA02與Microbacterium keratanolyticum OU01親緣關(guān)系最近。

圖3 基于MCDA02菌株16S r DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件

2.3.1 發(fā)酵時間對菌株MCDA02產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的影響 發(fā)酵時間對菌株MCDA02產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的影響如圖4。發(fā)酵時間達(dá)到48 h時，其相對酶活達(dá)到最高。隨著發(fā)酵時間的進(jìn)一步增加，酶活呈下降趨勢。

圖4 發(fā)酵時間對菌株MCDA02產(chǎn)酶的影響

2.3.2 發(fā)酵溫度對菌株MCDA02產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的影響 發(fā)酵溫度對菌株MCDA02產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的影響如圖5，幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活從10℃開始隨發(fā)酵溫度的升高而增大，在25-35℃范圍內(nèi)酶活較高，最適發(fā)酵溫度為30℃，當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到40℃以上時，酶活開始迅速下降。

圖5 發(fā)酵溫度對菌株MCDA02產(chǎn)酶的影響

2.3.3 培養(yǎng)基起始pH對菌株MCDA02產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的影響 培養(yǎng)基起始pH對菌株MCDA02產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的影響如圖6，發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH為8.0，培養(yǎng)基的起始pH為4.0或11.0時，該酶的相對酶活較低。但在pH為7.0-9.0時，酶活較高，可保持90%以上的酶活。

2.3.4 裝液量對菌株MCDA02產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的影響 裝液量對菌株MCDA02產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的影響如圖7，裝液量在10%-20%之間時，菌株MCDA02所產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的相對酶活較高。裝液量高于20%時，酶活下降顯著。

2.3.5 誘導(dǎo)劑濃度對菌株MCDA02產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的影響 誘導(dǎo)劑濃度對菌株MCDA02產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的影響如圖8。粉末幾丁質(zhì)濃度為0.5%-3.0%時，其相對酶活呈上升趨勢。粉末幾丁質(zhì)濃度為3.0%-6.0%時，呈下降趨勢。誘導(dǎo)劑的最適濃度為3.0%。

圖6 起始pH對菌株MCDA02產(chǎn)酶的影響

圖7 裝液量對菌株MCDA02產(chǎn)酶的影響

圖8 幾丁質(zhì)濃度對菌株MCDA02產(chǎn)酶的影響

2.4 正交法優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件

L16（45）的正交試驗結(jié)果見表3。根據(jù)試驗結(jié)果，計算kn值和R值，得出的最優(yōu)發(fā)酵方案為：幾丁質(zhì)濃度為3%，培養(yǎng)基起始pH為7.0，裝液量為20%，在溫度為25℃的條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h。在此發(fā)酵條件下，菌株MCDA02發(fā)酵水平達(dá)到158.47 U/mL，是優(yōu)化前的3.2倍。影響發(fā)酵結(jié)果的5個因素中，發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基起始pH、誘導(dǎo)劑濃度的R值較大，發(fā)酵時間、裝液量的R值較小。對比各個因素及交互對比的極差R的大小，5個因素對發(fā)酵結(jié)果的影響力依次為：發(fā)酵溫度＞誘導(dǎo)劑濃度＞培養(yǎng)基起始pH＞發(fā)酵時間＞裝液量。

3 討論

采用生物法，利用殼甲殼素制備殼聚糖較傳統(tǒng)化學(xué)方法優(yōu)勢明顯。篩選幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生菌，發(fā)酵制備幾丁質(zhì)脫乙酰酶是生物法制備殼聚糖的前提條件［12］。目前幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生菌以絲狀真菌居多，細(xì)菌較少。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)酶水平較高。目前報道的多數(shù)幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性較低，催化最適溫度高［16］。海洋里還有大量的幾丁質(zhì)，且環(huán)境奇特多樣，蘊含有大量的催化特性不同的幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生菌，成為該酶產(chǎn)生菌的研究熱點。

微生物發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)酶有顯著的影響，通過發(fā)酵優(yōu)化可以顯著提高酶的發(fā)酵水平。關(guān)于發(fā)酵優(yōu)化提高微生物產(chǎn)酶的報道與日俱增，取得了顯著的成果。目前尚未見解角質(zhì)素微桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的報道。本研究通過發(fā)酵條件優(yōu)化后該菌株發(fā)酵水平達(dá)到158.47 U/mL，具有工業(yè)化應(yīng)用的潛力。

微生物發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)酶有顯著的影響，通過發(fā)酵優(yōu)化可以顯著提高酶的發(fā)酵水平。應(yīng)聰萍等［19］針對已篩選出的一株能生產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的海洋絲狀真菌并研究了其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。通過試驗得出該菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：7 g/L葡萄糖，7 g/L酵母浸膏，0.75 g/L氯化鈣，1.25 g/L幾丁質(zhì)和1.4%NaCl，發(fā)酵108 h。目前對幾丁質(zhì)脫乙酰酶理化性質(zhì)的研究主要集中于溫度、pH 值、金屬離子及反應(yīng)底物對酶催化的影響，有的研究者也考慮了在培養(yǎng)基中添加生長激素、胰島素等因子提高酶活。

同時，不同性質(zhì)的底物也影響幾丁質(zhì)脫乙酰酶的催化活性。本研究將幾丁質(zhì)通過破碎、高溫等處理后將其作為催化反應(yīng)的底物。結(jié)果表明，經(jīng)過處理的幾丁質(zhì)作底物，酶的脫乙酰度顯著提高。多項研究表明乙二醇幾丁質(zhì)是幾丁質(zhì)脫乙酰酶作用較為理想的反應(yīng)底物［12］。

表3 L16（45）正交試驗結(jié)果分析

隨著研究者對幾丁質(zhì)脫乙酰酶研究的逐漸深入。其研究的范圍不僅是從自然界分離純化到幾丁質(zhì)脫乙酰酶，還可通過基因工程的手段對該酶的基因進(jìn)行研究。賈志娟［20］通過對北極深海沉積物的宏基因組測序，獲得了一種新的幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因。閆曉萍等［21］利用RACE-PCR的方法獲得了編碼美國白蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶2基因全長cDNA序列，在大腸桿菌中成功表達(dá)61 kD目的蛋白。

今后還可通過定點突變、射線誘變等方法對幾丁質(zhì)脫乙酰酶進(jìn)行改造，進(jìn)一步優(yōu)化其酶學(xué)性質(zhì)、提高酶的耐受性等，為幾丁質(zhì)脫乙酰酶實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究分離得到一株產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶海洋細(xì)菌MCDA02，鑒定為解角質(zhì)素微桿菌。通過單因素和正交優(yōu)化發(fā)酵條件，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為：誘導(dǎo)劑濃度為3%，培養(yǎng)基起始pH為7.0，裝液量為20%，在溫度為25℃的條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h。在此條件下，產(chǎn)酶量達(dá)到158.47 U/mL，是優(yōu)化前產(chǎn)酶量的3.2倍。

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［21］閆曉平, 趙丹, 郭巍, 等. 美國白蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶的克隆,表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50（5）：849-858.

Screening and Identification of a Marine Bacterium Producing Chitin Deacetylase and Optimization of Its Fermentation Condition

LAI Jiang-li1LIU Shu1，2HU Sheng-yuan1GU Zhang-hui1WANG Shu-jun2FANG Yao-wei1，2
（1. College of Fisheries and Marine Life，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005；2. Jiangsu Marine Resources Development Research Institute，Lianyungang 222005）

A strain MCDA02 producing chitin deacetylase was screened with the media added nitro-N-acetyl aniline from the marine mud of Haizhou bay. Then，it was identified as Microbacterium keratanolyticum through morphological，biochemical characteristics，and 16S rDNA sequence analysis. With single-factor strategy and orthogonal experiments，the fermentation condition was optimized as followings：fermentation period of 48 h，initial pH of 7.0，culture temperature of 30℃，50 mL of liquid medium in a 250 mL flask，and 3% chitin. Under the optimized conditions，the highest chitin deacetylase activity of strain MCDA02 reached 158.47 U/mL，which was about 3.2 times of that before optimization. The results laid a foundation for further study of the chitin deacetylase from the strain MCDA02.

chitin deacetylase；marine bacteria；identification；fermentation condition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0413

2017-05-21

江蘇省自然科學(xué)基金面上項目（BK20151282），江蘇省高校“青藍(lán)工程”，江蘇省“六大人才高峰”第十二批高層次人才項目（swyy-195），中國博士后科學(xué)基金（160034），青島博士后基金，第48批“留學(xué)歸國人員”科研啟動基金，淮海工學(xué)院科研創(chuàng)新基金（Z2014016）

來蔣麗，女，碩士研究生，研究方向：海洋微生物生物技術(shù)；E-mail：laijiangli199310@163.com

房耀維，男，副教授，研究方向：海洋微生物生物技術(shù)；E-mail：foroei@163.com

（責(zé)任編輯 李楠）