雷 蕾 蔣瑾瑾 顧 軍

·論著·

組胺受體H4R對(duì)過(guò)敏性紫癜患兒體內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

雷 蕾1蔣瑾瑾1顧 軍2

目的明確組胺受體H4R對(duì)過(guò)敏性紫癜(HSP)患兒體內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞(dentritic cells, DC)的調(diào)節(jié)作用。方法1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)126例HSP急性期、112例緩解期患者及94名健康對(duì)照外周血單核細(xì)胞(PBMC)中DC標(biāo)志性分子CD80及CD86的表達(dá)情況；2.體外活化和誘導(dǎo)得到DC，分為組胺組，組胺+H4R拮抗劑組和PBS對(duì)照組，Western blot 檢測(cè)組胺、H4R蛋白和人磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子1(p-STAT1)的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)趨化因子CCL17、CXCL16表達(dá)水平。結(jié)果1.HSP患者PBMC中CD86的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組(Plt;0.01)。急性期組CD80的表達(dá)低于緩解期組及健康對(duì)照組(Plt;0.01)，而緩解期組及健康對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(Pgt;0.05)；2.組胺+H4R拮抗劑組p-STAT1和H4R的蛋白及趨化因子CXCL16和CCL17水平明顯低于組胺組。結(jié)論組胺受體H4R可能通過(guò)促進(jìn)DC的趨化因子CXCL16/CCL17的表達(dá)，激活JAK/STAT通路，引起HSP的發(fā)生發(fā)展。

過(guò)敏性紫癜； 樹(shù)突狀細(xì)胞

樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是一類(lèi)專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞，它是能激活初始T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答的唯一一種提呈細(xì)胞，還可進(jìn)一步影響Th細(xì)胞分化以及極化。有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)敏性紫癜(HSP)患兒的DC對(duì)Th細(xì)胞調(diào)控的三條途徑即抗原特異性信號(hào)、協(xié)調(diào)刺激信號(hào)和分化或極化信號(hào)均出現(xiàn)了異常[1]。說(shuō)明其在HSP的發(fā)病與發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用，以DC細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞調(diào)控異常引起了Thl/Th2細(xì)胞功能失衡，應(yīng)當(dāng)是HSP發(fā)病的最主要原因之一。另有研究發(fā)現(xiàn)DC表面可表達(dá)H4R，活化后可以調(diào)控Th細(xì)胞的分化，另外H4R還可以抑制DC生成IL-12p70[2]，上調(diào)朗格漢斯細(xì)胞表達(dá)CCL17 and CCL22[3]等多種細(xì)胞因子，相應(yīng)的影響Th細(xì)胞向Th2型遷移[4,5]。

本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)組胺受體H4R參與了HSP的急性期的炎癥反應(yīng)，通過(guò)對(duì)不同臨床表型的HSP進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)腎臟受累的HSP患兒外周血H4R的表達(dá)要高于單純皮膚組及無(wú)腎臟受累的混合組[6]，在本研究我們將進(jìn)一步觀察DC上組胺受體，細(xì)胞趨化因子的表達(dá)情況，探討H4R可能通過(guò)何種途徑對(duì)下游的細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行調(diào)控。

1 研究對(duì)象

HSP急性期組：收集在上海長(zhǎng)海醫(yī)院就診的126例病程在1周內(nèi)的首次發(fā)病患者，經(jīng)家長(zhǎng)知情同意后，納入HSP急性期組，(男60例，女66例)，年齡為2.5～20歲，平均(9.85±4.73)歲。均為病程在1周內(nèi)的首次發(fā)病，所有患者在入院前1個(gè)月內(nèi)確保未使用任何抗過(guò)敏藥物或免疫抑制劑；患兒在采血前24 h未使用任何藥物。

HSP緩解期組：HSP急性期組的患兒經(jīng)過(guò)規(guī)范的臨床治療后各種急性期臨床表現(xiàn)已消失、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)正常，滿(mǎn)足上述標(biāo)準(zhǔn)的HSP患兒納入HSP恢復(fù)期組，共有112例，其中男52例，女60例，年齡為3.5～14.5歲，平均(7.48±3.85)歲。

健康對(duì)照組：均為同一時(shí)間段來(lái)我科兒保門(mén)診體檢的健康兒童，共94名。其中男52名，女42名，年齡為3.8～10.5歲，平均(6.52±1.86)歲，年齡、性別與HSP組匹配。

2 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

FACS Calibur型流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD公司)；PBS 磷酸鹽緩沖液(上?；鶢栴D生物有限公司)；淋巴細(xì)胞分離液(上?；鶢栴D生物科技)；Human CXCL16/CCL17 ELISA試劑盒，CD80，CD86單克隆抗體(Biotnt公司)；P-STAT1單克隆抗(abcom公司)；RPMI 1640(上海生工)；rhGM-CSF(Peprotech公司)；rhIL-4(Biovision公司)；JNJ-7777120(MCE公司)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 流式細(xì)胞儀FCM檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)情況 采集HSP急性期，緩解期及健康對(duì)照組患兒外周血后，分離PBMC。將PBS懸浮的1 mL待測(cè)細(xì)胞以1x106加人FCM專(zhuān)用管中。在FCM專(zhuān)用管中加入PE標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD80，CD86各20 μL，并設(shè)空白對(duì)照。避光孵育，4℃，30 min，10 min搖一次，再用PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。

3.2 樹(shù)突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)及培養(yǎng) DC誘導(dǎo)培養(yǎng)：采集健康志愿者血漿，采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法制備PBMC，將分離出的PBMC用不含細(xì)胞因子RPMI 1640培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液。于24孔培養(yǎng)板在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育3 h，用37℃預(yù)熱的1640培養(yǎng)液洗板1次，獲得貼壁的單個(gè)核細(xì)胞。再加入含細(xì)胞因子的RPMI 1640完全培養(yǎng)液l mL。同樣在37℃、5% CO2下孵育的培養(yǎng)箱中。通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。隔日半量換液并添加細(xì)胞因子以保證培養(yǎng)液中細(xì)胞因子終濃度不變。培養(yǎng)至第6天時(shí)進(jìn)行分組：1.PBS對(duì)照組；2.組胺組(1×10-5mmol/mL)；3.組胺(1×10-5mmol/mL)+H4R受體拮抗劑(1×10-5mmol/mL)。第8天時(shí)收集懸浮細(xì)胞及細(xì)胞上清以備檢測(cè)H4R、CXCL16和CCL17的表達(dá)。

3.3 Western blot檢測(cè)組胺及其抗體干預(yù)后外周血單個(gè)核細(xì)胞上H4R的蛋白的表達(dá) 前期收集細(xì)胞懸液，加入蛋白裂解液并進(jìn)行收集蛋白樣品，加入SDS-PAGE凝膠，經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，加入稀釋好的兔抗H4R抗體孵育2 h，洗膜后加入二抗羊抗兔工作液孵育1 h，洗滌后顯色，進(jìn)行蛋白檢測(cè)。

3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)CCL17、CXCL16蛋白含量 50 mM的碳酸鹽緩沖液加入前期收集的上清液，調(diào)整抗原濃度為10～20 μg/mL，加以100 μL/每孔的量到酶標(biāo)板，4℃條件下放置過(guò)夜。次日用PBS洗滌3次，加入150 μL 1% BSA在37℃條件下封閉1 h。PBS洗滌3次后，在每孔加入100 μL按照不同倍比稀釋度的血清，同時(shí)加入對(duì)照樣品，37℃條件下孵育2 h。PBS洗滌5次后，加入100 μL稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，在37℃條件下孵育1 h。PBS洗滌5次，加入顯色劑反應(yīng)20 min，酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。

4 結(jié)果

4.1 HSP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的CD80,CD86的表達(dá)情況 首先通過(guò)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了各組受試者PBMC中CD80/CD86表達(dá)變化,見(jiàn)圖1。急性期組和緩解期組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞CD86的表達(dá)均明顯高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)，且急性期組患者升高的程度更大。急性期組CD80的表達(dá)低于緩解期組及健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)。

4.2 組胺受體拮抗劑對(duì)DC表達(dá)H4R、p-STAT1、CCL17及CXCL16的影響

4.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 在培養(yǎng)早期，可看見(jiàn)細(xì)胞成圓形或類(lèi)圓形。培養(yǎng)至3～4天時(shí)，細(xì)胞逐漸聚集，呈集落樣生長(zhǎng)，并且部分細(xì)胞可觀察到突起，培養(yǎng)至7～8天時(shí)，細(xì)胞分散生長(zhǎng)，并可見(jiàn)明顯樹(shù)枝樣突起(圖2)。

4.2.2 DC上H4R、p-STAT1、CCL17及CXCL16的表達(dá)情況 加入組胺刺激后，DC的p-STAT1和H4R的蛋白表達(dá)增高(圖3)，分泌的趨化因子CXCL16和CCL17增多，明顯高于對(duì)照組(Plt;0.01，圖4)；而加入H4R阻斷劑JNJ7777120后，以上分子表達(dá)量均明顯回落。

圖1 各組受試者PBMC中CD86及CD80的表達(dá)

a：培養(yǎng)早期；b：培養(yǎng)3～4天時(shí)；c：培養(yǎng)7～8天時(shí)

圖3 刺激后DC的H4R和p-STAT1的表達(dá)變化 圖4 DC培養(yǎng)上清中的CXCL16和CCL17的表達(dá)變化

4 討論

Th1功能低下，Th2優(yōu)勢(shì)活化是目前公認(rèn)的HSP的病理基礎(chǔ)。而Th細(xì)胞是根據(jù)抗原提呈細(xì)胞提供的不同的信號(hào)分子而進(jìn)一步活化，分化的。CD80(B7-1)，CD86(B7-2)分子作為免疫調(diào)控中重要的共刺激分子，可刺激T細(xì)胞活化，而活化的T細(xì)胞可促進(jìn)B細(xì)胞進(jìn)一步分泌大量免疫球蛋白，影響Th1/Th2平衡。其中DC作為最主要的抗原提呈細(xì)胞，是唯一能夠作用于na ?ve T細(xì)胞的細(xì)胞，從而激發(fā)獲得性免疫應(yīng)答的一類(lèi)抗原提呈細(xì)胞，是聯(lián)系固有免疫與獲得性免疫的樞紐，在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中占有獨(dú)特的地位[7]。同時(shí)也是最主要表達(dá)這兩種分子的細(xì)胞之一。有研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠骨髓細(xì)胞表面CD86表達(dá)明顯升高，使其抗原提呈功能明顯增強(qiáng)，T細(xì)胞過(guò)度活化，尤其主要是向Th2類(lèi)細(xì)胞過(guò)度活化[8]。另有研究者[9]對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行體外T細(xì)胞分化分析，發(fā)現(xiàn)抗CD80(B7-1)單克降抗體使MBP特異性T細(xì)胞向Th2分化，而抗CD86(B7-2)單克隆抗體使之向Thl分化，因此CD80(B7-1)可刺激Thl生成，而CD86(B7-2)則可協(xié)同刺激Th2生成。

本研究首先通過(guò)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了各組受試者PBMC中CD80和CD86表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)急性期組和緩解期組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞CD86的表達(dá)均明顯高于健康對(duì)照組。而急性期組CD80的表達(dá)低于緩解期組及健康對(duì)照組。說(shuō)明HSP患者體內(nèi)的DC出現(xiàn)了異常活化，呈現(xiàn)Th2亢進(jìn)狀態(tài)。如前所述，DC表面的H4R活化后可調(diào)控Th細(xì)胞的分化，影響Th細(xì)胞向Th2型遷移。因此我們進(jìn)一步通過(guò)體外分組培養(yǎng)DC進(jìn)行觀察。分別加入組胺，組胺+H4R受體拮抗劑JNJ7777120進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入組胺刺激后，DC的p-STAT1和H4R的蛋白表達(dá)增高，分泌的趨化因子CXCL16和CCL17增多，明顯高于空白對(duì)照組(Plt;0.01)；而加入H4R阻斷劑JNJ7777120后，以上分子表達(dá)量均明顯回落，尤其是CXCL16的表達(dá)與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異。

綜上所述，DC在HSP患者體內(nèi)呈異?；罨癄顟B(tài)，在體外經(jīng)組胺刺激后其表面的H4R表達(dá)升高，分泌趨化因子增多，而加入H4R拮抗劑后表達(dá)水平明顯回落。我們考慮組胺受體H4R可能通過(guò)促進(jìn)DC的趨化因子CXCL16/CCL17的表達(dá)，激活JAK/STAT通路，引起或加重HSP的發(fā)生發(fā)展。

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(收稿：2017-06-26 修回：2017-07-26)

RegulatoryeffectofH4RondendriticcellinchildrenwithHenoch-Sch?nleinpurpura

LEILei1,JIANGJinjin1,GUJun2.

1.DepartmentofPediatrics,ChanghaiHospitalAffiliatedtotheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China; 2.DepartmentofDermatologyandVenereology,ChanghaiHospitalAffiliatedtotheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

GUJun,E-mail:gujun79@163.com

Objective: To determine the regulatory effect of histamine 4 receptor (H4R) on dendritic cells (DC) in children with Henoch-Sch?nlein purpura (HSP).MethodsThe expression levels of CD80 and CD86 in PBMC from 126 patients at acute stage, 112 at remission stage and 94 healthy controls were detected by flow cytometer. The DC was isolated and divided into the histamine group, histamine+H4R antagonist group and PBS control group. The levels of H4R and P-STAT1 proteins on DC were detected by Western blot and the levels of CCL17and CXCL16 were detected by ELISA.ResultsThe level of CD86 from the patients with HSP was higher than that in healthy controls, with a significant difference (Plt;0.01), while the level of CD80 was lower in the patients at acute stage than that in the patients at remission stage and healthy controls (Plt;0.01). The difference in the level of CD 80 between the patients at remission stage and healthy controls was not significant. The level of H4R and P-STAT1 proteins, CXCL16 and CCL17 on DC in the histamine+H4R antagonist group were lower than those in histamine group.ConclusionH4R is associated with the onset and development of HSP, which may go through up-regulating the levels of CXCL16 and CCL17 and activating the JAK/STAT pathway.

Henoch-Sch?nlein purpura; dendritic cell

1第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院兒科，上海，200433 2第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院皮膚性病科，上海，200433

顧軍，E-mail：gujun79@163.com