戴方偉，杜江濤，周莎桑，呂 宇，桂 飛，宋曉明，褚曉峰*

(1.浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心，杭州 310013； 2.杭州師范大學實驗動物中心，杭州 310036)

普通環(huán)境長爪沙鼠種群中病原體攜帶情況普查

戴方偉1，杜江濤1，周莎桑1，呂 宇1，桂 飛2，宋曉明2，褚曉峰1*

(1.浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心，杭州 310013； 2.杭州師范大學實驗動物中心，杭州 310036)

目的對普通環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠病原感染情況進行初步調查，為制定長爪沙鼠病原體檢測地方標準提供依據。方法參考小鼠、大鼠微生物和寄生蟲檢測方法，對普通環(huán)境飼養(yǎng)的30只長爪沙鼠進行16項細菌、11項病毒和8項寄生蟲的檢測。結果飼養(yǎng)于普通環(huán)境的30只長爪沙鼠有淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒、仙臺病毒、小鼠肺炎病毒、呼腸孤病毒III型、小鼠腦脊髓炎病毒、支原體、泰澤病原體、螺桿菌抗體檢出，其檢出率分別為6.7%、3.3%、100.0%、6.7%、10.0%、6.7%、6.7%和56.7%，同時檢出嗜肺巴斯德桿菌感染率為3.3%，金黃色葡萄球菌感染率為10.0%，大腸埃希菌O115 a, C, K (B)感染率為6.7%，鼠三毛滴蟲感染率為100.0%，鞭毛蟲感染率為100.0%。結論本研究為制定長爪沙鼠等級標準提供了參考數(shù)據。

長爪沙鼠；病原微生物；寄生蟲

長爪沙鼠又稱沙土鼠(Mongolian gerbil,Merionesunguiculatus)，屬哺乳綱，嚙齒目，倉鼠科，沙鼠亞種，沙鼠屬，是一種抗旱能力強、具有獨特生物學特性的“多功能”實驗用動物[1-9]。長爪沙鼠從野生到馴養(yǎng)、再到實驗動物化乃至用于動物實驗已有70多年的歷史。近年來長爪沙鼠作為實驗動物新資源，在品系培育、生物凈化、質量檢測和應用方面都得到快速發(fā)展。標準化是長爪沙鼠作為實驗動物應具備的基本屬性，也是實驗用長爪沙鼠應用必須具備的基本前提條件，而微生物學和寄生蟲學指標則是重要的標準化內容之一。盡管國內已有不少學者開展了長爪沙鼠質量控制方法研究，但國內尚無長爪沙鼠質量控制標準發(fā)布，導致長爪沙鼠質量控制處于“無法可依”的狀態(tài)。這不但制約了長爪沙鼠的應用，也直接影響到科學研究和生物制品的質量，以及人員健康。因此，研究制定長爪沙鼠的質量控制標準、完善長爪沙鼠質量控制體系及提升長爪沙鼠質量是目前亟待解決的問題[10-17]。本文對普通環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠病原感染情況進行初步調查，以期為制定長爪沙鼠質量標準的提供依據。

1 材料和方法

1.1實驗動物

對長爪沙鼠種群所在區(qū)的不同方位隨機抽取30只活體動物，1～2月齡，體重30～50 g，雌雄各半，由某大學實驗動物中心提供。

1.2主要試劑與儀器

DHL培養(yǎng)基、NAC瓊脂培養(yǎng)基、NAC液體培養(yǎng)基、SP培養(yǎng)基和豆粉瓊脂均由青島日水生產，羊血由貝瑞斯特生產，血瓊脂基礎培養(yǎng)基(blood agar base)(No. 2，CM0271)購自英國Oxiod公司。生化鑒定試劑：革蘭氏陰性菌鑒定板(NMIC/ID-4)、革蘭氏陽性菌鑒定板(PMIC/ID-55)及相關鑒定配套試劑購自美國BD公司。革蘭氏染色液、API20E腸道菌鑒定系統(tǒng)(Ref. 20100)、API 20NE非腸道菌鑒定系統(tǒng)(Ref. 20050)、APISTAPH葡萄球和微球菌鑒定系統(tǒng)(Ref. 20500)、API20 STREP鏈球菌、VITEK2革蘭氏陽性細菌鑒定卡，VITEK2革蘭氏陰性細菌鑒定卡，以及有關種類的鑒定系統(tǒng)(Ref. 20600)購自法國生物梅里埃公司(Biomerieux)。生化管購自青島高科技園海博生物技術有限公司。ELISA檢測試劑盒：泰澤病原體抗原板為VRLus提供，其余抗原板購自Xpressbio。沙鼠HRP二抗為GeneTex Rabbit anti-Gerbil HRP(Lot：#821500067)，1∶10 000稀釋于0.05% PBST使用。IFA檢測試劑盒：中檢院IFA抗原片，其中沙鼠二抗為GeneTex Rabbit anti-Gerbil FITC(Lot：#20354)，1∶400稀釋于熒光二抗稀釋液中使用。

生物顯微鏡，培養(yǎng)箱，實體解剖鏡，VITEK2全自動細菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)；LEICA-DM-2500熒光顯微鏡(德國徠卡)；680型酶標儀(美國Bio-Rad)；HF-Ssfe-1800生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1 檢測方法

對11項病毒、16項病原菌和8項寄生蟲進行檢測，檢測方法見表1～3，檢測參照國家標準(GB/T 14926)進行。

1.3.2 細菌分離培養(yǎng)

眼球采血后采用安死術處死沙鼠，嚴格按照無菌操作要求解剖動物，實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷，用一次性接種環(huán)刮取呼吸道分泌物，接種兩個血瓊脂培養(yǎng)基。其中，一個置于5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h，另一個置于普通培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h，根據長出菌落的大小、形態(tài)、顏色、溶血類型等進行分類，然后對每一種類的細菌純培養(yǎng)，革蘭氏染色，以確定下一步的分離鑒定方法。

1.3.3 細菌的鑒定

革蘭氏染色分類后的細菌分別用不同的鑒定條進行鑒定，用分析軟件分析結果。根據軟件提示補充相應的生化項目，對部分不太確定的菌株用全自動細菌鑒定儀進行檢測。

2 結果

2.1長爪沙鼠血清中病毒抗體檢測

用所建立的間接ELISA方法對長爪沙鼠血清中鼠痘病毒(ECT)、漢坦病毒(HV)、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、仙臺病毒(SV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠肺炎病毒(PVM)、呼腸孤病毒III型(REO-3)、小鼠細小病毒(MVM)、小鼠輪狀病毒(MRV)、小鼠腺病毒(MDV)、小鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)等11種病毒抗體進行檢測。檢測結果顯示：LCMV、SV、PVM、REO-3、TMEV有抗體陽性檢出，其檢出率分別為：6.7%(2/30)、3.3%(1/30)、100.0%(30/30)、6.7%(2/30)、10.0%(3/30)，見表1。

2.2長爪沙鼠腸道、呼吸道和血清中細菌攜帶情況檢測

用所建立的間接ELISA方法對長爪沙鼠血清中支原體、泰澤病原體及螺桿菌抗體進行檢測，檢測結果顯示：支原體抗體檢出率為6.7%(2/30)，泰澤病原體抗體檢出率為6.7%(2/30)，螺桿菌感染率為56.7%(17/30)，見表2。同時對其沙門菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、產酸克雷伯桿菌、綠膿桿菌、大腸埃希菌O115 a, C, K (B)、皮膚病原真菌、鼠棒狀桿菌、多殺巴斯德桿菌、支氣管鮑特桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌β等13種細菌進行分離培養(yǎng)與鑒定。檢測結果顯示：嗜肺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌O115 a, C, K (B)有檢出，檢出率分別為3.3%(1/30)、10.0%(3/30)和6.7%(2/30)。

2.3長爪沙鼠體外、腸道寄生蟲和血清抗體篩查

對長爪沙鼠體外寄生蟲、全部蠕蟲、卡氏肺孢子蟲、鼠三毛滴蟲、鞭毛蟲、纖毛蟲、弓形蟲、兔腦原蟲等進行檢測，結果顯示：鼠三毛滴蟲感染率為100.0%(30/30)、鞭毛蟲感染率為100.0%(30/30)，體外寄生蟲、全部蠕蟲、卡氏肺孢子蟲、纖毛蟲、弓形蟲、兔腦原蟲均未陽性檢出，見表3。

表1 普通級環(huán)境長爪沙鼠病毒抗體檢測結果(n=30)

表2 普通級環(huán)境長爪沙鼠細菌檢測結果(n=30)

表3 普通級環(huán)境長爪沙鼠寄生蟲檢測結果(n=30)

3 討論

目前，國內尚無有關長爪沙鼠微生物學和寄生蟲學等級控制標準。本文對飼養(yǎng)于普通環(huán)境中的長爪沙鼠的微生物和寄生蟲感染狀況進行檢測，其結果為制定長爪沙鼠微生物學和寄生蟲學等級控制標準提供了可參考的基礎數(shù)據。

國內對長爪沙鼠病原自然感染的情況已有多個報道。段明麗[17]等曾從野生和馴養(yǎng)的長爪沙鼠中檢出MHV、LCMV和SV抗體陽性，進一步證實長爪沙鼠對以上多種病毒存在自然易感性。杜小燕等[13]從野生和馴養(yǎng)長爪沙鼠中檢出大腸桿菌、巴斯德菌、鏈球菌、葡萄球菌和雞葡萄球菌和豬鏈球菌、支氣管炎博德等條件致病菌。戴方偉等[14]也曾在浙江省普通長爪沙鼠群中檢出支原體和泰澤病原體抗體陽性檢出，除金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌、肺炎鏈球菌、犬巴斯德菌等致病菌外，其它均為非致病菌或條件致病菌。馮育芳等[15-16]對北京群長爪沙鼠的細菌普查中，發(fā)現(xiàn)嗜肺巴斯德桿菌、多殺巴斯德菌、大腸埃希菌、弗氏志賀菌、傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等檢出。本研究檢出的部分致病菌和條件致病菌種類均與以上報到相一致，在標準制定的時候應作為主要推薦指標考慮。王鉅等[12]在普通環(huán)境和清潔級環(huán)境中長爪沙鼠寄生蟲感染狀況觀察，其中有鼠三毛滴蟲等陽性檢出。鼠三毛滴蟲的生活史非常簡單，是廣泛寄生于小鼠、大鼠和野生嚙齒類盲腸的非致病性寄生原蟲，其感染率高達90%～100%，鼠三毛滴蟲的滋養(yǎng)體時期既是生活時期又是傳播階段。本次檢查結果顯示，在普通環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠三毛滴蟲和鞭毛蟲的感染率高達100%。這可能與飼養(yǎng)環(huán)境、飼料和飲水的控制不嚴有關。

綜合上述研究結果，我們建議：在制訂長爪沙鼠微生物和寄生蟲的地方標準或國家標準時，應考慮將淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒、仙臺病毒、支原體、泰澤病原體、大腸埃希菌O115 a, C, K (B)等病原列為清潔級長爪沙鼠應排除的病原微生物，鼠三毛滴蟲作為清潔級長爪沙鼠應考慮排除的寄生蟲；小鼠肺炎病毒、呼腸孤病毒III型、小鼠腦脊髓炎病毒、金黃色葡萄球菌、螺桿菌、嗜肺巴斯德桿菌作為SPF級長爪沙鼠應排除的病原微生物，鞭毛蟲作為SPF級長爪沙鼠應考慮排除的寄生蟲。需補充說明的是，限于診斷試劑盒的選擇，本項目參考了大鼠、小鼠微生物、寄生蟲國家標準進行病原微生物和寄生蟲自然感染篩查。由于大鼠、小鼠與長爪沙鼠在感染病原譜及對相同病原易感性等方面可能存在的差異性，在制訂長爪沙鼠微生物和寄生蟲的地方標準或國家標準時，進一步擴大篩查范圍及擴充已有參考信息(如Charles River企業(yè)標準等)將有助于建立一套符合長爪沙鼠實際的病原控制標準，這對長爪沙鼠的推廣和應用具有非常重要的意義。目前，國內缺乏長爪沙鼠微生物和寄生蟲的檢測試劑。在病原微生物血清抗體檢測方面，我們與國內某研究院合作建立相應的ELISA抗體檢測方法，制備了長爪沙鼠特異性抗血清，并針對各種試劑盒優(yōu)化了滴度，對所建立的方法進行特異性、敏感性及可應用性評價。在此基礎上，還選擇進口試劑盒進行方法學和檢測結果的驗證。應用以上所建立的方法，對普通環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠病原感染情況進行初步調查，獲得的檢測結果，為制定長爪沙鼠質量檢測標準提供了的依據。

[1] Bleich EM, Keubler LM, Smoczek A, et al. Hygienic monitoring of Mongolian gerbils: which mouse viruses should be included? [J]. Lab Anim, 2012, 46(2): 173-175.

[2] Worthington JM, Fulghum RS. Cecal and fecal bacterial flora of the Mongolian gerbil and the chinchilla [J]. Appl Environ Microbiol, 1988, 54(5): 1210-1215.

[3] 王亞芳, 包天桐. 沙鼠作為衰老實驗動物模型的探索 [J]. 實驗動物科學, 2001, 18(1): 8-10.

[4] 嚴杰, 胡愛萍, 李強, 等. 蒙古沙鼠幽門螺桿菌感染動物模型的建立 [J]. 浙江大學學報(醫(yī)學版), 2003, 32(1): 21-23.

[5] 李長龍, 盧領群, 郭紅剛, 等. 長爪沙鼠線粒體DNA控制區(qū)全序列測定及分析 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2010, 20(4): 40-45.

[6] 劉鋒華, 郭紅剛, 樓琦, 等. 鏈脲佐菌素誘導長爪沙鼠I型糖尿病模型的實驗研究 [J]. 中國實驗動物學報, 2010, 18(6): 489-494.

[7] 李長龍, 杜小燕, 陳振文. 長爪沙鼠資源開發(fā)利用進展 [J]. 中國實驗動物學報, 2014, 22(6): 106-109.

[8] 肖麗, 戴方偉, 宋曉明, 等. 長爪沙鼠在病原感染研究中的應用 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2013, 23(7): 61-67.

[9] 柳建發(fā), 蔣雯雯, 周飛, 等. 長爪沙鼠寄生蟲感染和疾病動物模型的建立 [J]. 寧波大學學報(理工版), 2010, 23(4): 117-120.

[10] 田克恭. 實驗動物病毒性疾病 [M]. 北京: 農業(yè)出版社, 1994: 41-44.

[11] GB/T 14926-2001, 實驗動物微生物學檢測方法 [S]. 2001.

[12] 王鉅, 王曉輝, 盧靜, 等. 普通環(huán)境和清潔級環(huán)境中長爪沙鼠寄生蟲感染狀況觀察 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2004, 14(3): 132-134.

[13] 杜小燕, 王鉅, 王迎, 等. 野生和馴養(yǎng)長爪沙鼠攜帶細菌情況的調查研究 [J]. 實驗動物科學, 2008, 25(1): 15-17.

[14] 戴方偉, 周莎桑, 宋曉明, 等. 生物凈化前后長爪沙鼠微生物和寄生蟲攜帶情況的比較 [J]. 實驗動物與比較醫(yī)學, 2012, 32(6): 473-476.

[15] 馮育芳, 邢進, 王吉, 等. 普通環(huán)境長爪沙鼠呼吸道菌群的分離鑒定 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2012, 22(10): 50-54.

[16] 馮育芳, 邢進, 王吉, 等. 普通環(huán)境長爪沙鼠腸道菌群的分離鑒定 [J]. 實驗動物科學, 2012, 29(3): 27-30.

[17] 段明麗, 杜小燕, 王迎. ELISA法檢測野生和馴養(yǎng)長爪沙鼠攜帶病毒情況 [J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘, 2014, 21(3): 110.

InvestigationofpathogeninfectionsinMongoliangerbilsraisedinaconventionalfacility

DAI Fang-wei1, DU Jiang-tao1, ZHOU Sha-sang1, LV Yu1, GUI Fei2, SONG Xiao-ming2, CHU Xiao-feng1 *

(1.Laboratory Animal Center, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, China；2.Laboratory Animal Center, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036)

ObjectiveTo investigate the pathogen infections of Mongolian gerbils raised in a conventional facility, and to provide a basis for the establishment of local standards for pathogen detection in Mongolian gerbils.MethodsA total of 16 species of bacteria, 11 species of viruses and 8 species of parasites were detected in 30 gerbils raised in a conventional facility, according to the national standards of microorganism and parasite detection in mice and rats.ResultsGerbils raised in this conventional facility were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (a positive rate of 6.7%), sendai virus (3.3%), pneumonia virus of mice (100.0%), reovirus type III (6.7%), mouse encephalomyelitis virus (10.0%),mycoplasmaspp. (6.7%), Tyzzer’s organism (6.7%) andHelicobacterspp. (56.7%), according to our antibody detection results. Meanwhile, the detected positive rate ofPasteurellapneumotropicawas 3.3%,Staphylococcusaureus10.0%,EscherichiacoliO115 a, C, K (B) 6.7%,Tritrichomonasmuris100.0% and flagellates 100.0%.ConclusionsThe results of our study provide a reference for the establishment of classification standards for gerbils according to their pathogen and parasite infections.

Mongolian gerbils; Pathogenic microorganisms; Parasites

國家科技支撐計劃項目子項目(編號：2015BAI09B01-02)。

戴方偉(1978 -)，女，副研究員，研究方向：實驗動物病原監(jiān)測研究。E-mail: fangweidai@163.com

褚曉峰(1969 -)，男，研究員，研究方向：實驗動物項目管理和標準化。E-mail: sydw@zjinfo.gov.cn

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0015-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.004

2017-05-23