任 璐, 周建波, 劉慧平, 曹俊宇, 殷 輝, 趙曉軍*

(1. 農業(yè)有害生物綜合治理山西省重點實驗室, 太原 030031; 2. 山西農業(yè)大學農學院,太谷 030801; 3. 山西省農業(yè)科學院植物保護研究所, 太原 030006)

辣椒炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides對啶氧菌酯的敏感基線及抗性突變體生物學性狀

任 璐1,2, 周建波1,3, 劉慧平2, 曹俊宇2, 殷 輝1,3, 趙曉軍1,3*

(1. 農業(yè)有害生物綜合治理山西省重點實驗室, 太原 030031; 2. 山西農業(yè)大學農學院,太谷 030801; 3. 山西省農業(yè)科學院植物保護研究所, 太原 030006)

為評估辣椒炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides對啶氧菌酯的抗性風險,建立了辣椒炭疽病菌對啶氧菌酯的敏感基線,室內篩選獲得了辣椒炭疽病菌抗啶氧菌酯突變體,并對突變體生物學性狀進行了研究。在山西省3個未使用過啶氧菌酯及QoI類藥劑的地區(qū)采集并分離到45株辣椒炭疽病菌。采用菌絲生長速率法測定其對啶氧菌酯的敏感性,結果顯示,EC50值介于1.404～16.650 μg/mL,平均EC50值為(6.783±3.499)μg/mL。啶氧菌酯與水楊肟酸(SHAM)共同處理時(SHAM的處理濃度為100 μg/mL),EC50+S為0.022～0.275 μg/mL,平均(0.109±0.058)μg/mL,EC50+S呈連續(xù)性單峰曲線,且敏感性頻率分布呈近似正態(tài)分布,EC50+S平均值可作為辣椒炭疽病菌對啶氧菌酯的敏感基線。且水楊羥肟酸旁路氧化貢獻值F(F=EC50/EC50+S)最低為6.039,最高為301.441,平均78.026。室內誘導獲得8株抗性突變體,其中低抗突變體6株,中抗突變體2株。中抗突變體無性繁殖10代,其抗性可穩(wěn)定遺傳。突變體產孢量和菌絲生長速率與敏感菌株相比均無顯著差異,但無藥條件下,突變體致病力較敏感菌株有所降低?？垢芯昃缘矸圩鳛樘荚?、硝酸鉀作為氮源時利用率最高;最適pH均為5和6;菌絲的最適生長溫度均為25℃。表明辣椒炭疽病菌抗啶氧菌酯突變體具有較高的適合度,對啶氧菌酯具有較高抗性風險,這一研究結論為指導生產用藥,延緩抗藥性發(fā)展提供理論依據。

辣椒炭疽病菌; 啶氧菌酯; 敏感基線; 抗性風險; 生物學性狀

辣椒炭疽病是辣椒生產中常見的真菌性病害,也是辣椒生產過程中三大病害之一。該病害由子囊菌門炭疽菌屬Colletotrichum的多個種侵染造成,如Colletotrichumgloeosporioides、C.capsici、C.acutatum等。炭疽病菌可危害辣椒葉片和果實,尤以對果實危害最為明顯與嚴重,導致辣椒腐爛,失去經濟價值。在夏季天氣悶熱、濕度大時易發(fā)生,造成辣椒大面積減產[1]。報道顯示,在很多亞洲國家,如韓國、印度、泰國,由于該病害的發(fā)生,辣椒產量明顯下降[2]。Colletotrichumspp.還可以侵染甜椒[3]。有報道指出,C.acutatum是引起韓國辣椒和甜椒炭疽病的主要致病菌,C.capsici是泰國辣椒炭疽病的主要致病菌[3-4],而在我國的各主要辣椒產區(qū),不同省份所報道的優(yōu)勢致病菌有所不同[5-6],根據我們的取樣和調查,C.gloeosporioides是引起山西省辣椒產區(qū)辣椒炭疽病的優(yōu)勢致病菌。

目前,化學防治是生產上果蔬炭疽病的主要防治手段,常用殺菌劑主要有芳烴類、有機硫類及苯并咪唑類等。已有報道顯示炭疽病菌對多種常用藥劑產生了不同程度的抗性。例如,Sander等[7]報道,南非芒果上的C.gloeosporioides已對多種苯并咪唑類殺菌劑敏感性降低。Maymon等[8]報道,羽扇豆和鱷梨上C.gloeosporioides對苯并咪唑類殺菌劑產生了抗性。在中國,有些省份也出現炭疽病菌對多種類型的藥劑敏感性下降。曹學仁等[9]報道了海南省橡膠炭疽病菌Colletotrichumspp.對多菌靈和咪鮮胺的敏感性降低;韓國興等[10]發(fā)現浙江省杭州地區(qū)的草莓炭疽病菌C.gloeosporioides對多菌靈和乙霉威產生了抗性,抗性頻率高達90%以上;葉佳等[11]分別對遼寧和浙江的葡萄炭疽病菌群體Colletotrichumspp.對多菌靈及甲基硫菌靈的敏感性進行測定,發(fā)現病菌已產生一定程度抗性。

啶氧菌酯(picoxystrobin)于2001年由先正達在歐洲首次推出,并于2006年被杜邦公司收購,之后在拉美、北美市場登記,在中國于2012年7月獲得臨時登記并于同年11月正式登記,是甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑中內吸活性最強的品種,主要用于防治蔬菜灰霉病菌Botrytiscinerea、黃瓜霜霉病菌Pseudoperonosporacubensis、香蕉黑星病菌Macrophomamusae、辣椒炭疽病菌Colletotrichumspp.和葡萄黑痘病菌Sphacelomaampelinum等。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的作用位點主要是線粒體上的細胞色素b,通過抑制線粒體氧化呼吸所必經的細胞色素b和c1 之間的電子轉移來阻斷生物的呼吸路徑,從而起到殺菌效果[12-13]。啶氧菌酯可用于防治已對14α-脫甲基抑制劑和苯并咪唑類殺菌劑產生抗性的植物病原菌。炭疽菌屬Colletotrichumspp.對啶氧菌酯抗性的相關報道還很少見,但不同病原真菌對QoI類殺菌劑的抗性分子機理顯示,抗性突變位點單一,抗性風險較高[14-17]。

山西省氣候干燥、陽光充足、熱量豐富,是中國華北地區(qū)主要的辣椒種植和生產區(qū)域。據我們調查,截至2015年,山西省辣椒種植面積近4萬 hm2。在發(fā)病較為嚴重的山西省朔州市應縣的辣椒產區(qū),辣椒炭疽病的發(fā)病率高達30%,該病害的防治不利給生產上帶來較為嚴重的損失。啶氧菌酯在山西省辣椒產區(qū)還未廣泛應用。本研究于2014-2016年從山西省各地區(qū)的辣椒上采集并分離了炭疽病菌菌株,通過建立敏感基線,檢測未使用啶氧菌酯的辣椒產區(qū)辣椒炭疽病菌的敏感性,對比抗感菌株適合度及其他生物學特性,評估辣椒炭疽病菌對啶氧菌酯的抗性風險,為生產上指導用藥,延緩抗藥性產生、延長藥劑使用壽命提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

用于建立敏感基線的辣椒炭疽病菌菌株采自山西省晉中市3個未使用過啶氧菌酯及QoI類殺菌劑的辣椒種植地。將具有典型辣椒炭疽病病狀的辣椒果實帶回實驗室,用無菌去離子水沖洗表面3次后,挑取病組織接種于PDA培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)3 d,分離純化菌種至新的PDA平板,25℃培養(yǎng)5 d后進行單孢分離,共獲得68株辣椒炭疽病菌菌株,經鑒定,其中45株為C.gloeosporioides,23株為C.capsici,菌株以采集地首字母+數字分別命名。本研究檢測了其中45株C.gloeosporioides對啶氧菌酯的敏感性。

1.2 供試藥劑

95%啶氧菌酯(picoxystrobin)原藥,湖北健源化工有限公司生產。用丙酮制成10 000 μg/mL母液,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

99%水楊羥肟酸(salicylhydroxamic acid,簡稱SHAM)分析試劑,上海伊卡生物技術有限公司生產。用丙酮制成10 000 μg/mL母液,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 含藥培養(yǎng)基制備

配制10 mg/mL啶氧菌酯及10 mg/mL水楊羥肟酸,用無菌水分別稀釋成所需濃度,按照藥劑與加熱后冷卻至50℃左右的熔融狀態(tài)PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～17 g、水1 000 mL)1∶9比例混合均勻。

1.4 辣椒炭疽病菌對啶氧菌酯及對啶氧菌酯+SHAM的敏感性測定

根據Rebollar-Alviter等[18]及Zhou等[19]的試驗結果,培養(yǎng)基中加入SHAM可抑制病原菌的旁路氧化途徑,從而更有效抑制病菌菌絲的生長。因此本研究參照Rebollar-Alviter等[18]及Markoglou等[16]的方法設計試驗。根據預試驗結果(未提供數據)配制含藥PDA培養(yǎng)基,其中啶氧菌酯的終濃度分別為0、1、2、4、8、10和50 μg/mL,SHAM的終濃度為100 μg/mL。對照只在PDA培養(yǎng)基中加入相同濃度的SHAM。

將保存?zhèn)溆玫木杲臃N到PDA平板中培養(yǎng)5 d,用打孔器從菌落邊緣打取5 mm菌餅接種到含不同濃度啶氧菌酯和SHAM的PDA平板上,每濃度重復處理3次。放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,用十字交叉法測量菌落直徑,計算各個濃度藥劑對辣椒炭疽病菌的菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率(%)=[1-(待測菌落直徑-5 mm)/(對照菌落直徑-5 mm)]×100。對抑菌率進行線性回歸分析,求出回歸方程及有效抑制中濃度EC50。將啶氧菌酯單獨作用下測得的敏感性記為EC50;啶氧菌酯與SHAM(100 μg/mL)共同作用下得到的EC50記為EC50+S。計算出旁路氧化的貢獻值F=EC50/EC50+S。

1.5 啶氧菌酯抗性突變體的獲得

在室內,采用紫外誘導和藥劑馴化篩選辣椒炭疽病菌對啶氧菌酯的抗性突變菌株。紫外誘導:從來源于3個采集地的辣椒炭疽病菌中隨機挑選3株敏感菌株SN13、JX3、YZ6,接種于PDA平板上培養(yǎng)3 d,在距20 W紫外燈10 cm距離下照射20、40、60 min后在黑暗環(huán)境下接種到含亞致死劑量(50 μg/mL)的啶氧菌酯PDA平板上,每處理重復3次,在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)3～4 d,將能夠在含藥PDA平板上形成扇形菌落的角變區(qū),用相同方法連續(xù)紫外照射及黑暗培養(yǎng),增加啶氧菌酯的濃度,直到其可以在500 μg/mL啶氧菌酯平板上生長,測定其敏感性,確定其抗性倍數。

藥劑馴化:隨機選取辣椒炭疽病菌敏感菌株SN1、JX1、YZ1在PDA平板上培養(yǎng)5 d,在菌落邊緣打取5 mm的菌餅,接種到含20 μg/mL啶氧菌酯的平板上,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d后,采用相同的方法將菌餅接種到更高濃度的含藥平板上,濃度每次增加10 μg/mL,且每增加一次算作一代,直到其可以在500 μg/mL啶氧菌酯濃度含藥平板生長,測定其敏感性,確定其抗性倍數。

抗性倍數(resistance factor, RF)=抗性菌株EC50/敏感菌株EC50。當菌株抗性水平達到5倍,則表明有抗性產生,抗性水平大于5倍的菌株在整個群體中所占的比例即為抗性頻率?？剐苑旨墭藴?抗性倍數<5倍為敏感;5倍≤抗性倍數<10倍為低抗;10～40倍為中抗;40倍以上為高抗[20]。

1.6 抗性突變體遺傳穩(wěn)定性測定

將抗性突變體在無藥PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗條件下培養(yǎng)10代,每5 d將菌株轉到新的無藥培養(yǎng)基上,轉接10次,分別測其第2、4、6、8、10代菌株的EC50值。

1.7 抗性突變體生物學特性測定

選取敏感菌株JX3、SN13、YZ6與抗性突變體JX3R2、SN13R1、YZ6R2、JX3MR3、YZ6MR4進行以下試驗。

1.7.1 抗性突變體生長速率及產孢量測定

將培養(yǎng)5 d的敏感菌株與抗性突變體,用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣相同位置打取菌塊,接種于無藥PDA培養(yǎng)基上,25℃下恒溫黑暗培養(yǎng),每處理重復3次,每24 h用十字交叉法測量菌落直徑。培養(yǎng)10 d后,在每個平板中加入約10 mL滅菌水,用玻璃棒輕輕在菌落表面不斷地撥動,用4層紗布過濾,定容至5 mL,充分混勻,在血球計數板上計算抗感菌株的產孢量。

1.7.2 抗性突變體與敏感菌株致病力測定

用離體組織法測定抗性突變體與敏感菌株致病力。取健康的辣椒果實用水清洗其表面,再用滅菌水沖洗3次,然后切成直徑為3 cm大小的辣椒圓片。將辣椒片在75%乙醇中浸泡2 min左右,然后在濃度為150 μg/mL的啶氧菌酯藥液中浸泡2 min,以無菌水浸泡為對照,最后放入帶有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中,采用針刺法將該病菌的孢子懸浮液接種到辣椒片中央,每個培養(yǎng)皿中4片,每處理4次重復。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),用潮濕的無菌濾紙進行保濕培養(yǎng),3 d后用坐標紙計算病斑面積。

1.7.3 抗感菌株在不同酸堿度下的生長狀況

在無菌操作臺中,用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH調節(jié)PDA培養(yǎng)基的酸堿度,使其pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11。在辣椒炭疽病菌菌落邊緣打取5 mm的菌餅,接入含梯度酸堿度的PDA平板上,每處理3次重復,倒置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),6 d后用十字交叉法測定菌落直徑。

1.7.4 抗感菌株在不同碳、氮營養(yǎng)條件下的生長狀況

供試碳源為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、丙三醇和淀粉。供試氮源為蛋白胨、尿素、硫酸銨和硝酸鉀。測定碳源對抗感菌株的影響時,將理查培養(yǎng)基(氯化鐵FeCl30.02 g、硫酸鎂MgSO42.5 g、硝酸鉀KNO310 g、磷酸二氫鉀KH2PO45 g、蔗糖50 g、瓊脂17 g、無菌水1 000 mL)中的蔗糖換成待測碳源,研究氮源時,將理查培養(yǎng)基中的硝酸鉀置換成待測氮源,取直徑為5 mm的抗感菌株的菌餅接到不同碳、氮源平板上,每處理3次重復,25℃培養(yǎng)6 d后測定菌落直徑。

1.7.5 抗感菌株在不同溫度下的生長狀況

從抗感菌株菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅于無藥PDA平板中,分別放置于15、20、25、30、35℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),每處理設置3次重復,6 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

2 結果與分析

2.1 辣椒炭疽病菌對啶氧菌酯、啶氧菌酯+SHAM的敏感性

45株C.gloeosporioides的敏感性測定結果表明,在啶氧菌酯單獨作用下,其EC50介于1.404～16.650 μg/mL,平均值為(6.783±3.499)μg/mL,EC50呈連續(xù)性變化(圖1a)。在啶氧菌酯與SHAM共同作用下,其EC50+S的范圍在0.022～0.275 μg/mL(圖1b),平均值為(0.109±0.058)μg/mL,最大與最小值相差12.5倍,亦呈連續(xù)性變化。菌株對啶氧菌酯+SHAM的敏感性頻率分布呈單峰曲線(圖2),以S-W法對45株菌株的敏感性分布進行正態(tài)性檢驗,其W值為0.973,P=0.635>P0.05,表明病原菌對啶氧菌酯的敏感性分布呈近似正態(tài)分布,未出現敏感性明顯下降的群體。因此,其EC50+S均值可作為辣椒炭疽病菌對啶氧菌酯的敏感基線。

圖1 啶氧菌酯(a)和啶氧菌酯+SHAM(b)對45株辣椒炭疽病菌的EC50值Fig.1 EC50 values of picoxystrobin (a) and picoxystrobin+ SHAM (b) to 45 Colletotrichum gloeosporioides isolates

圖2 辣椒炭疽病菌對啶氧菌酯的敏感性頻率分布Fig.2 Frequency distribution of Colletotrichum gloeosporioides isolates with different sensitivities to picoxystrobin

與啶氧菌酯單獨作用相比較,啶氧菌酯與SHAM共同作用下,EC50下降明顯,表明旁路氧化抑制劑SHAM對啶氧菌酯抑制C.gloeosporioides菌絲生長的活性表現出補償作用,即增效作用,使得啶氧菌酯的抑菌活性大大加強。且旁路氧化貢獻值F[F=EC50/(EC50+S)]最低為6.039,最高為301.441,平均78.026(圖3),而且從圖中可以明顯看到4個尾點,這主要是由于SHAM在不同菌株中的旁路氧化貢獻值不同所造成的。

圖3 水楊肟酸旁路氧化貢獻值(F值)Fig.3 Compensation efficiency value in the bypass oxidation (F values)

2.2 啶氧菌酯抗性突變體的抗性水平

在室內通過紫外誘導和藥劑馴化共獲得8株抗性突變體,分別為SN13R1、JX3R1、JX3R2、JX3MR3、YZ6R1、YZ6R2、YZ6R3、YZ6MR4,其中6株為低抗菌株,2株為中抗菌株(表1)。

表1室內紫外誘導及藥劑馴化抗性突變體抗性水平

Table1Resistanceleveltopicoxystrobinofpicoxystrobin-resistantmutantsofColletotrichumgloeosporioidesobtainedinthelaboratoryviaUVradiationandfungicideselection

菌株Isolate毒力回歸方程RegressionequationEC50/μg·mL-1抗性倍數Resistancefactor抗性水平ResistancelevelSN13R1y=4．0910+0．4832x76．069512．6563低抗JX3R1y=3．6429+0．8342x42．34536．9008低抗JX3R2y=4．2772+0．4143x55．52689．0489低抗YZ6R1y=4．2140+0．5256x31．28745．1200低抗YZ6R2y=4．2804+0．4780x32．02005．2399低抗YZ6R3y=4．4665+0．2910x68．163311．1546低抗JX3MR3y=4．3871+0．2726x177．191228．8759中抗YZ6MR4y=3．8934+0．4741x215．870935．3261中抗

2.3 抗性突變體遺傳穩(wěn)定性測定

從表2中可以看出,低抗菌株JX3R1、YZ6R2經過10代的無性繁殖后,抗性倍數下降較為明顯,抗藥性不能穩(wěn)定遺傳。低抗菌株SN13R1、中抗菌株JX3MR3、YZ6MR4的抗性倍數雖略有下降,但其菌絲生長良好,且經過10代的連續(xù)培養(yǎng)后,其抗性倍數仍然比較穩(wěn)定,表明其抗藥性能夠遺傳,不會喪失。

表2抗性突變體遺傳穩(wěn)定性

Table2StabilityoftheresistantmutantsofColletotrichumgloeosporioides

菌株IsolateEC50/μg·mL-1 EC50valueafterdifferenttransfercultivations第0代第2代第4代第6代第8代第10代JX3R142．345342．013335．421930．131528．730320．1681SN13R176．069575．945874．636173．321471．283470．6372YZ6R232．020031．490229．834530．751125．335420．5716JX3MR3177．1912175．3215170．8321168．8694171．3824161．5210YZ6MR4215．8709208．0728210．3421206．4891208．5243201．0324

2.4 抗性突變體生物學特性

2.4.1 抗性突變體與敏感菌株菌絲生長速率及產孢量

表3結果顯示，低抗突變體菌絲生長速率略低于敏感菌株，但差異不顯著；其中，YZ6R2、SN13R1菌絲生長與產孢量均與其敏感菌株YZ6和SN13沒有顯著差異。而中抗突變體JX3MR3、YZ6MR4菌絲生長速率顯著低于敏感菌株JX3和YZ6；其中，JX3MR3的產孢量與其親本敏感菌株JX3差異顯著。

表3抗性突變體與敏感菌株生長速率與產孢量1)

Table3Myceliumgrowthandsporeproductionofsensitiveisolatesandresistantmutants

菌株Isolate菌落直徑/cm Colonydiameter1d2d3d4d5d6d7d8d平均速率/cm·d-1Average產孢量/×106SporenumberJX31．59002．76003．92004．65005．58006．85007．85007．9800(1．03±0．43)a(5．80±0．20)cSN131．41672．95003．72174．58335．60677．25007．97008．5367(1．07±0．41)a(5．53±0．12)cdYZ61．94333．23334．00835．01006．06677．06507．97008．2417(1．03±0．47)a(6．75±0．22)aJX3R21．33332．33833．40174．25835．23336．33337．29177．5750(0．95±0．30)a(4．40±0．20)eSN13R11．23332．52173．33174．01675．19176．76177．50508．3617(1．05±0．32)a(4．96±0．32)dYZ6R21．95603．28334．06335．00506．04507．04677．94178．1333(1．02±0．50)a(6．27±0．12)aJX3MR31．55831．85172．59833．38834．78335．18676．20837．1333(0．89±0．44)b(4．00±0．10)fYZ6MR41．25501．65502．50173．29504．17504．80675．56006．2683(0．78±0．24)b(6．00±0．10)ab

1) 表中同列數據后標有不同字母者表示經Duncan氏新復極差法檢驗在P<0.05水平差異顯著。下同。

Data followed by different lowercase letters indicate significant difference atP<0.05 level by Duncan’s new multiple range test. The same below.

2.4.2 抗性突變體與敏感菌株致病力

從表4中可知,在不含藥的情況下,接種敏感菌株的所有辣椒圓盤均會產生病斑,侵染率分別為62.35%、62.63%、58.32%;抗性突變體在不含藥圓盤上侵染率較敏感菌株低,接種后引起的發(fā)病面積較小,且突變體抗性倍數越高,所致發(fā)病面積及侵染率越低。低抗菌株JX3R2和YZ6R2致病力與親本菌株差異不顯著,但SN13R1與敏感菌株SN13差異明顯;而中抗菌株致病力較親本敏感菌株均顯著降低。

在含50 μg/mL啶氧菌酯的辣椒圓盤上,接種敏感菌株的發(fā)病面積與侵染率均顯著低于接種抗性突變體,說明抗性突變體均表現出一定的抗藥性,其中，中抗菌株JX3MR3、YZ6MR4侵染率達到16.14%、34.01%。

表4抗性突變體及敏感菌株致病性

Table4Pathogenicityofresistantandsensitiveisolates

菌株Isolate發(fā)病面積/cm2 LesionareaCK50μg/mL侵染率/% InfectionfrequencyCK50μg/mLJX3(17．62±0．38)a(0．95±0．07)e62．35a3．36eSN13(17．70±0．29)a(0．96±0．07)e62．63a3．40eYZ6(16．48±0．68)b(0．96±0．07)e58．32b3．40eJX3R2(17．16±0．05)ab(2．51±0．11)d60．72ab8．89dSN13R1(16．82±1．33)b(2．95±0．28)c59．52b10．44cYZ6R2(15．75±0．19)b(2．81±0．22)c55．73b9．94cJX3MR3(16．83±0．08)b(4．56±0．04)b59．55b16．14bYZ6MR4(15．54±0．08)c(9．61±0．21)a54．99c34．01a

2.4.3 抗感菌株在不同酸堿度下的生長狀況

抗感菌株在pH為5和6時生長狀況均最好(表5)。敏感菌株與低抗菌株在強酸或強堿條件下生長較差,且敏感菌株與低抗菌株間差異顯著,說明低抗菌株在不同pH生長條件下的適應能力低于敏感菌株。中抗菌株JX3MR3、YX6MR4在pH 3時均不能生長,但偏酸偏堿條件下,JX3MR3、YX6MR4菌落直徑均大于其親本敏感菌株,說明中抗菌株對偏酸偏堿條件的適應性均優(yōu)于敏感菌株。

2.4.4 抗感菌株在不同碳、氮營養(yǎng)條件下的生長狀況

從表6中可以看出,抗感菌株在幾種供試碳源下均能正常生長,其中低抗菌株SN13R1在含有甘露糖的培養(yǎng)條件下生長最快,而其余菌株均在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基中生長最快。敏感菌株JX3、SN13及抗性突變體JX3R2、SN13R1、YZ6R2、YX6MR4在以丙三醇作為碳源的條件下生長最慢,敏感菌株YZ6在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上生長速率最低,中抗菌株JX3MR3在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長的最慢。說明不同病原菌對不同碳源的利用率有差異。

表5不同pH下抗感菌株的菌落直徑

Table5ColonydiameterofsensitiveisolatesandresistantmutantsunderdifferentpHvalues

pH菌落直徑/cm ColonydiameterJX3SN13YZ6JX3R2SN13R1YZ6R2JX3MR3YZ6MR43(1．07±0．19)f -(1．34±0．07)f -----4(3．14±0．12)cd(3．05±0．45)d(2．04±0．43)e(1．74±0．04)b(1．74±0．01)bc(1．30±0．02)g(3．71±0．33)b (2．24±0．10)d 5(4．40±0．07)a(4．63+0．26)a(4．00±0．08)a(1．86±0．09)b(2．01±0．03)b(1．68±0．02)f(4．94±0．06)a(4．93±0．16)a6(3．94±0．19)ab(4．09±0．32)b(3．71±0．12)ab(4．05±0．21)a(4．12±0．15)a(4．02±0．04)a(4．62±0．06)a(4．37±0．15)a7(3．40±0．46)c(3．59±0．04)c(3．19±0．19)bc(1．98±0．30)b(2．07±0．33)b(2．98±0．07)b(3．55±0．07)c(2．95±0．33)c8(3．13±0．32)cd(3．07±0．07)d(2．70±0．22)cd(1．86±0．49)b(1．98±0．62)b(2．49±0．01)c(4．59±0．16)a(4．30±0．43)abc9(3．58±0．21)bc(2．38±0．08)e(2．42±0．43)de(2．03±0．16)b(2．11±0．17)b(2．24±0．16)d(4．28±0．59)ab(4．61±0．15)ab10(2．64±0．10)d(1．98±0．01)e(2．16±0．07)de(1．94±0．01)b(1．96±0．01)b(2．05±0．05)e(4．34±0．03)ab(4．01±0．44)bc11(1．77±0．07)e(1．29±0．05)f(1．27±0．06)f(1．82±0．01)b(1．20±0．01)cd(1．11±0．12)h(3．75±1．07)b(3．75±0．45)c

表6不同碳源條件下敏感菌株和抗性突變菌落直徑

Table6Colonydiametersofsensitiveisolatesandresistantmutantsindifferentcarbonsources

碳源Carbonsource菌落直徑/cm ColonydiameterJX3SN13YZ6JX3R2SN13R1YZ6R2JX3MR3YX6MR4葡萄糖Glucose(5．42±0．08)b(4．92±0．19)b(5．49±0．71)b(5．06±0．10)c (4．92±0．07)c (4．84±0．06)d(4．84±0．06)c(4．98±0．08)b麥芽糖Maltose(4．79±0．11)c(4．04±0．13)c(4．27±0．26)c(4．44±0．44)d(4．29±0．01)d(4．20±0．04)e(4．28±0．04)d(4．33±0．50)c蔗糖Sucrose(4．75±0．10)c(4．05±0．05)c(4．37±0．07)c(4．13±0．11)de(4．05±0．002)d(4．02±0．03)e(3．98±0．15)d(4．30±0．03)c甘露糖Mannitol(6．18±0．09)a(5．94±0．22)a(6．04±0．07)a(5．77±0．03)b(6．66±0．05)b(5．68±0．06)b(5．68±0．05)a(5．96±0．19)a丙三醇Glycerol(4．72±0．10)a(3．73±0．34)c(4．45±0．07)c(4．03±0．03)e(3．43±0．38)e(3．71±0．26)f(4．05±0．54)d(4．03±0．26)c淀粉Starch(6．32±0．12)c(6．04±0．04)a(6．18±0．15)a(6．33±0．18)a(6．15±0．09)a(6．08±0．07)a(6．01±0．19)a(6．27±0．01)a

由表7可知,菌株在蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸鉀4種氮源培養(yǎng)基上都可生長,但生長差異明顯。其中硝酸鉀為最適氮源,且與其他氮源處理差異顯著。其次是蛋白胨;而在以尿素、硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長緩慢?？垢芯暝诓煌刺幚淼呐囵B(yǎng)基上生長狀況一致,說明抗感菌株對不同氮源環(huán)境的適應性沒有顯著差異。

表7不同氮源條件下敏感菌株和抗性突變體的菌落直徑

Table7Colonydiametersofsensitiveisolatesandresistantmutantsindifferentnitrogensources

氮源Nitrogensource菌落直徑/cm ColonydiameterJX3SN13YZ6JX3R2SN13R1YZ6R2JX3MR3YX6MR4蛋白胨Peptone(4．31±0．24)b(3．54±0．16)b(3．64±0．32)b(3．57±0．20)b(3．57±0．19)b(3．51±0．09)b(6．01±0．12)a(3．89±0．18)b尿素Urea(2．37±0．34)c(1．99±0．11)c(2．04±0．08)c(1．81±0．03)c(1．86±0．29)c(1．98±0．05)c(3．27±0．10)b(1．98±0．20)c硫酸銨Ammoniumsulfate(0．65±0．03)d(0．81±0．08)d(0．74±0．07)d(0．87±0．08)d(0．68±0．04)d(0．80±0．01)d(1．46±0．09)c(0．78±0．01)d硝酸鉀Nitrate(5．36±0．07)a(4．87±0．19)a(5．08±0．12)a(4．68±0．27)a(5．06±0．14)a(4．98±0．15)a(6．24±0．17)a(5．25±0．15)a

2.4.5 抗感菌株在不同溫度下的生長狀況

試驗結果(表8)表明,抗感菌株在15～35℃下均可生長,但最適溫度均為25℃,與其他處理溫度相比差異顯著。在溫度為15℃、35℃時,抗感菌絲生長速率均顯著下降。

表8不同溫度處理下抗感菌株的菌落直徑差異

Table8Colonydiametersofsensitiveisolatesandresistantmutantsatdifferenttemperatures

溫度/℃Temperature菌落直徑/cm ColonydiameterJX3SN13YZ6JX3R2SN13R1YZ6R2JX3MR3YX6MR415(1．65±0．05)cd(1．43±0．18)d(1．83±0．17)c(1．40±0．10)cd(1．67±0．21)c(1．81±0．10)c(1．75±0．05)c(1．38±0．18)d20(3．48±0．05)b(3．19±0．12)b(3．23±0．04)b(3．25±0．03)b(3．20±0．18)b(3．65±0．18)b(4．02±0．12)b(3．86±0．19)b25(5．58±0．65)a(5．62±0．04)a(6．07±0．48)a(5．24±0．52)a(5．19±0．33)a(6．04±0．30)a(4．49±0．02)a(4．12±0．12)a30(1．97±0．05)c(1．73±0．08)c(1．79±0．04)c(1．74±0．21)c(1．59±0．39)cd(2．00±0．12)c(1．75±0．07)c(1．74±0．09)c35(1．32±0．01)d(1．19±0．05)e(1．22±0．01)d(1．15±0．10)d(1．15±0．13)d(1．36±0．14)d(1．17±0．05)d(1．20±0．04)d

3 結論與討論

啶氧菌酯在中國被用于防治多種病害,但在山西省該藥劑目前還未被廣泛用于辣椒炭疽病的防治。本試驗用菌絲生長速率法測定了從山西省晉中市3個未使用過QoI類殺菌劑的辣椒種植區(qū)分離的45株C.gloeosporioides對啶氧菌酯的敏感性。在啶氧菌酯及SHAM共同作用下,EC50+S平均值為(0.109±0.058)μg/mL,正態(tài)性檢驗顯示敏感性分布呈近似正態(tài)分布,未出現敏感性明顯下降的群體,其EC50+S平均值可作為C.gloeosporioides對啶氧菌酯的敏感基線,作為田間抗藥性監(jiān)測的參考標準。

由于QoI類殺菌劑獨特的作用位點,一些病原菌可以通過旁路氧化補償作用來降低對殺菌劑的敏感性[21]。旁路氧化途徑可以在電子傳遞主路被阻斷時,交替運行,以維持生物的活性。因此,病原菌體內所存在的旁路氧化補償機制使離體條件下病原菌菌絲生長對QoI類殺菌劑敏感性下降。SHAM是旁路氧化途徑中的交替氧化酶抑制劑,它可以阻斷病菌體內的旁路氧化途徑。在用菌絲生長速率法測定該類藥劑敏感性時,加入SHAM可提高抑菌活性[22-23]。從SHAM+啶氧菌酯的聯合毒力測定可知,其EC50+S的范圍在0.022～0.275 μg/mL,旁路氧化的平均貢獻值為78.026,說明旁路氧化途徑在C.gloeosporioides菌絲生長過程中起著重要作用。陳聃所報道的葡萄炭疽病對吡唑醚菌酯旁路氧化平均貢獻值為3.78[24],葉佳等報道的葡萄炭疽病菌對醚菌酯旁路氧化途徑平均貢獻值為20.09[11],明顯低于本文中的78.026,推斷旁路氧化作用在不同甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑對不同病原菌中的貢獻值存在較大差異。

QoI類殺菌劑通常被認為具有高的抗性風險[12,14,23], Zheng 等[25]和De Miccolis等[26]的研究也證實,在室內采用紫外線照射和藥劑馴化的方式很容易得到抗性水平較高的抗性突變體。但低抗菌株抗藥穩(wěn)定性較差,推測可能是由于病原菌在藥劑選擇壓下暫時表現出的耐藥性反應,但在生產中有可能在持續(xù)用藥的情況下,進一步突變?yōu)楦呖咕?加劇了病原菌產生抗性的風險。另外,突變位點不同的抗性突變體抗性水平和適合度差異很大,如F129L點突變表現為中等抗性,G143A點突變表現為高抗;又如Magnaporthegrisea和MycosphaerellagraminicolaG143A突變體與敏感菌株相比,適合度沒有顯著差異[19, 27],但G143S突變體的生長速率和產孢量與敏感菌株差異顯著[28]。本研究比較了C.gloeosporioides抗感菌株的生長速率、產孢量,發(fā)現與敏感菌株相比,低抗突變體均沒有顯著差異。但在無藥條件下,接種抗性突變體所產生的病斑面積以及侵染率明顯低于敏感菌株,表明無藥情況下,敏感菌株的致病能力強于抗性突變體;在藥劑存在下,抗性突變體表現出一定的耐藥性仍能使果實產生病斑面積。

抗感菌株在不同營養(yǎng)條件、溫度、酸堿度下菌絲生長速率結果表明:在不同碳源條件下,抗感菌株均能正常生長,且淀粉為抗感菌株最佳碳源。在不同氮源條件下,抗感菌株均在以硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基上生長最快,而在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中幾乎不生長,說明抗感菌株對不同氮源適應性沒有明顯差別。在不同溫度下,抗感菌株的最適溫度均為25℃,溫度偏高和偏低抗感菌株的菌絲生長速率均會下降。不同酸堿度下低抗菌株與敏感菌株菌絲生長狀況差異不明顯,但中抗菌株較敏感菌株對不同酸堿度的調節(jié)能力表現出一定優(yōu)越性。總的來說,辣椒炭疽病菌C.gloeosporioides對啶氧菌酯產生抗性后,與敏感菌株相比,抗性突變體適合度沒有明顯下降,說明其對啶氧菌酯具有較高的抗性風險,因此,在生產中建議輪換使用不同作用機制的殺菌劑,使得C.gloeosporioides對啶氧菌酯始終保持低水平抗性頻率,即能很大程度上延緩抗藥性的產生。

今后,將進一步研究和比較Colletotrichum屬不同種之間對啶氧菌酯敏感性的差異,探索Colletotrichum屬中不同種的抗性突變體適合度及對啶氧菌酯的抗性風險。并針對高效藥劑建立敏感基線,加強田間抗藥性監(jiān)測,根據抗性出現頻率制定科學的用藥策略,延長藥劑的使用壽命。

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(責任編輯： 田 喆)

BaselinesensitivityofColletotrichumgloeosporioidestopicoxystrobinandbiologicalcharacteristicsofresistantmutants

Ren Lu1,2, Zhou Jianbo1,3, Liu Huiping2, Cao Junyu2, Yin Hui1,3, Zhao Xiaojun1,3

(1.ShanxiKeyLaboratoryofIntegratedPestManagementinAgriculture,Taiyuan030031,China; 2.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 3.InstituteofPlantProtection,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan030006,China)

To evaluate the resistance risk ofColletotrichumgloeosporioidesto picoxystrobin, the baseline sensitivity ofC.gloeosporioidesto this fungicide was established, and the biological characteristics of the picoxystrobin-resistant mutants obtained in the laboratory were studied. Forty-fiveC.gloeosporioidesisolates were collected from three areas of Jinzhong, Shanxi Province, where picoxystrobin and the other fungicides with the same mode of action had not been used before. The sensitivities of 45C.gloeosporioidesto picoxystrobin were determined by growth rate method. The results showed that the EC50values ranged from 1.404 μg/mL to 16.650 μg/mL, with a mean of (6.783±3.499)μg/mL. The EC50+Svalues of 45C.gloeosporioidesto picoxystrobin combined with 100 μg/mL salicylic acid oxime (SHAM) ranged from 0.022 μg/mL to 0.275 μg/mL, with a mean of (0.109±0.058)μg/mL. The frequency of EC50+Svalues was distributed as a unimodal curve, and the frequency of sensitivity was in approximately normal distribution, and the mean EC50+Svalues could be used as the relative baseline sensitivity ofC.gloeosporioidesto picoxystrobin. The compensation efficiency value in the bypass oxidation way showed that the lowest value was 6.039, and the highest was 301.441, with a mean value of 78.026. Eight picoxystrobin-resistant mutants were obtained, of which 6 were low resistance and 2 medium resistance to picoxystrobin. The resistance of moderately resistant mutants was stable after 10 generations of asexual cultivation. The mycelium growth rates, spore germination rates of mutants were similar with those of sensitive isolates, but the pathogenicity of the mutants was lower than that of the sensitive ones in absence of fungicides. The best carbon source of both sensitive and resistant isolates was starch and best nitrogen source was potassium nitrate; the optimum pH values were 5 and 6 and the optimum temperature was 25℃ for the mycelial growth of both sensitive and resistant isolates. The results showed that theC.gloeosporioidesresistant mutants were in high fitness and in high risk of resistance to picoxystrobin. The conclusion provides the theoretical basis for guiding fungicide use and the strategic buildup of delaying resistance development.

Colletotrichumgloeosporioides; picoxystrobin; baseline sensitivity; resistance risk; biological characteristics

2016-12-21

2017-02-04

山西省重點研發(fā)計劃重點項目(201603D21110-2)；農業(yè)有害生物綜合治理山西省重點實驗室開放課題(YHSW2015002)；山西省農業(yè)科學院特色農業(yè)技術攻關項目(YGG17114)；山西省農科院重點攻關項目(YGG1603)

* 通信作者 E-mail：zhaoxiaojun0218@163.com

S 481.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.005