宣俊好, 張元博, 蒙城功, 彭彪彪, 楊瑞先

(洛陽理工學(xué)院環(huán)境工程與化學(xué)學(xué)院, 洛陽 471023)

洛陽地區(qū)牡丹3種主要葉部病害病原菌的分離與鑒定

宣俊好, 張元博, 蒙城功, 彭彪彪, 楊瑞先*

(洛陽理工學(xué)院環(huán)境工程與化學(xué)學(xué)院, 洛陽 471023)

為明確引起洛陽牡丹Paeoniasuffruticosa葉部主要病害的病原菌種類及其癥狀特點,于2016年從洛陽市的4個牡丹種植區(qū)采集葉部病害樣本,采用組織分離法進(jìn)行病原菌的分離和純化,柯赫氏法則回接驗證病原菌的致病性,利用形態(tài)學(xué)與基因序列分析相結(jié)合的方法鑒定病原菌的種類。結(jié)果表明,洛陽地區(qū)牡丹葉部主要病害種類為牡丹紅斑病、炭疽病和黑斑病,引起這三種病害的病原菌分別鑒定為枝孢霉菌Cladosporiumsp.、膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides和鏈格孢菌Alternariaalternata。本研究為牡丹葉部病害的快速診斷與防治提供了理論依據(jù)。

牡丹; 葉部病害; 病原菌; 鑒定

牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.為芍藥科芍藥屬多年生落葉灌木,兼具觀賞和藥用價值,是我國的傳統(tǒng)名花之一,在我國已有一千多年的栽培歷史[1]。河南洛陽作為中國牡丹的主要栽培地之一,其栽培歷史悠久,栽培面積大,且品種繁多。近年來隨著洛陽觀賞牡丹和油用牡丹生產(chǎn)面積的擴(kuò)大,牡丹病害的發(fā)生日益突出,嚴(yán)重影響了牡丹的正常生長發(fā)育,降低了牡丹的觀賞效果和后期開發(fā)應(yīng)用效果[2],牡丹病害的發(fā)生發(fā)展已逐漸成為牡丹生產(chǎn)中的重要限制因素。近年來研究表明,牡丹病害大約有20多種,主要以葉部病害為主,多造成牡丹葉片產(chǎn)生病斑和穿孔等癥狀,嚴(yán)重時危及花和莖稈,甚至導(dǎo)致植株死亡[3]。目前關(guān)于牡丹病害的研究多集中于癥狀的描述,多數(shù)病原菌種類的鑒定也僅限于形態(tài)學(xué)特征的觀察。而研究發(fā)現(xiàn)利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行植物病原菌的分類鑒定,存在準(zhǔn)確性較差的缺點,因此引起牡丹病害發(fā)生的病原菌種類的準(zhǔn)確鑒定已成為急需解決的問題。

基于傳統(tǒng)的病原真菌分類和鑒定的局限性,克隆和測序真菌5.8S rDNA核糖體基因及其兩側(cè)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed space, ITS區(qū))基因,根據(jù)其基因序列的差異進(jìn)行真菌菌株的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的研究已成為植物病原學(xué)的研究熱點[4-5]。尤其是真菌的ITS區(qū)進(jìn)化速度較快,在不同菌種內(nèi)高度保守,通過與數(shù)據(jù)庫中同源序列的比較可以確定真菌屬種關(guān)系,其使用尤為廣泛[6-7]。為明確引起洛陽地區(qū)牡丹主要葉部病害的病原菌種類和分類地位,本研究從洛陽不同牡丹種植地進(jìn)行牡丹葉部病害癥狀的觀察和病原菌的分離,同時基于形態(tài)學(xué)特征和ITS序列測定分析準(zhǔn)確鑒定病原菌種類,為進(jìn)一步研究牡丹葉部病害的發(fā)病規(guī)律、防治措施和牡丹抗病品種的培育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物材料:牡丹葉片病害標(biāo)本于2016年4-9月采自洛陽隋唐城遺址公園、中國國花園、國家牡丹園和洛陽理工學(xué)院牡丹種植區(qū),通過葉片發(fā)病特征加以區(qū)別分類,并拍照記錄,將癥狀不同的病葉置于不同自封袋內(nèi)保存,做好標(biāo)記,帶回實驗室用于病原菌的分離。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離

采用組織分離法對牡丹葉部病害進(jìn)行病原菌分離和純化[8]。用自來水沖洗病葉,將病健交界處組織剪成2～3 mm的小塊,75%乙醇消毒后用10%次氯酸鈉溶液浸泡10 min,再用滅菌水漂洗3次后接種在PDA培養(yǎng)基上,每皿接種4塊,25℃恒溫培養(yǎng),待長出菌落后進(jìn)行純化,再轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基中,并于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌致病性檢驗

采集健康的牡丹葉片,自來水沖洗干凈后用75%乙醇擦拭葉片表面后,晾干備用。采用針刺接種法進(jìn)行病原菌的致病性測定,即將純化后獲得的病原菌轉(zhuǎn)至PDA平板,于25℃培養(yǎng)7 d后,用4 mm滅菌打孔器在PDA平板的菌落邊緣均勻切取菌餅,用針輕度刺傷葉片后,取菌餅反貼于傷口處,對照為不接菌的PDA培養(yǎng)基。接種后的牡丹葉片置于直徑20 cm的培養(yǎng)皿內(nèi),25℃保濕培養(yǎng),3 d后開始觀察并記錄發(fā)病情況。選取菌餅接種處產(chǎn)生明顯病斑的葉片,重新分離純化病原菌,觀察與初始分離菌株是否一致。

1.2.3 病原菌鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定:將純化后的病原菌分離物MDHB、MDTJ和MDYB接種于PDA培養(yǎng)基中,25℃條件下培養(yǎng)7 d后,肉眼觀察菌落的培養(yǎng)性狀,主要包括菌落顏色、表面形狀、邊緣形狀和氣生菌絲是否豐盛等特征;同時在光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌菌絲、分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)特征。

分子生物學(xué)鑒定:采用真菌提取試劑盒(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)提取真菌DNA基因組,方法詳見說明書,提取后的DNA置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ谜婢ㄓ靡颕TS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增病原菌rDNA-ITS序列[9]。擴(kuò)增體系為50 μL,PCR反應(yīng)程序為:預(yù)變性94℃ 5 min;變性94℃ 30 s,退火55℃ 30 s,延伸72℃ 1 min,35個循環(huán);72℃ 10 min,4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,DNA片段經(jīng)凝膠回收試劑盒(天根生物工程有限公司)回收,回收產(chǎn)物委托上海生工生物工程公司進(jìn)行測序。

序列分析:利用Blastn軟件將獲得的ITS基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比較,確定與該菌株親緣關(guān)系最近的種屬,并從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)種屬的序列,用ClustalX 2.0軟件進(jìn)行序列的比對排列,利用Mega 7中的鄰接法(neighbour-joining methods,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以確定牡丹病原菌的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹葉部病害癥狀觀察

2016年4-9月對洛陽地區(qū)牡丹葉部病害癥狀進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn),其葉部病害主要有三種,分別為牡丹紅斑病、牡丹炭疽病和牡丹黑斑病。牡丹紅斑病發(fā)病初期表現(xiàn)為葉片正、反面皆出現(xiàn)綠色針狀小點,病斑逐漸擴(kuò)展為近圓形或不規(guī)則形病斑,病斑中央淡褐色、邊緣紫褐色,最后呈現(xiàn)出明顯的同心輪紋,病斑直徑約3～30 mm,發(fā)病后期病部出現(xiàn)墨綠色霉層(圖1a～b)。牡丹炭疽病發(fā)病初期病斑為褐色小點狀,以后逐漸擴(kuò)大成紅褐色近圓形或形狀不規(guī)則的斑塊,病斑直徑約4～25 mm,病斑擴(kuò)展受主脈及大側(cè)脈限制,病斑多為褐色,有些邊緣呈黃褐色,中央灰白色,后期發(fā)病嚴(yán)重時葉緣部位成片出現(xiàn)半圓形病斑,中央會出現(xiàn)穿孔癥狀(圖1e～f)。牡丹黑斑病發(fā)病時葉片上出現(xiàn)褐色至灰黑色近圓形病斑,病斑直徑約為5～10 mm,可觀察到淡淡的輪紋,中央略泛灰白或出現(xiàn)較深的黑褐色,后期發(fā)病嚴(yán)重時造成葉片穿孔和脫落,甚至是植株的死亡,空氣濕度大時在葉片發(fā)病部位出現(xiàn)黑色霉層,即病原菌的分生孢子(圖1i～j)。

圖1 牡丹葉部病害的癥狀特征和致病性測定Fig.1 Symptoms of tree peony leaf disease and results of pathogenicity

2.2 牡丹葉部病害病原菌致病性檢測

牡丹病原菌MDHB接種健康牡丹葉片3 d后,菌餅周圍開始出現(xiàn)病斑,病斑慢慢擴(kuò)大,5 d后移除菌餅,可觀察到病斑為紫褐色,病部有墨綠色霉層出現(xiàn)(圖1c～d)。MDTJ接種健康葉片5 d后,開始出現(xiàn)癥狀,7 d后移除菌餅,可觀察到病斑正面為灰褐色,背面為淺褐色,且僅在接種處出現(xiàn)病斑,病斑擴(kuò)散不明顯,在接種葉片的背面可觀察到明顯的粉紅色分生孢子團(tuán)(圖1g～h)。接種分離物MDTJ后2 d即可觀察到菌絲擴(kuò)散,5 d后移去菌餅,病斑擴(kuò)散較為明顯,病斑正面呈現(xiàn)黑褐色,病斑背面可觀察到明顯的黑色霉層(圖1k～l)。對照處理的葉片均沒有出現(xiàn)發(fā)病癥狀。將接種分離物后的發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌的再分離,均獲得與接種供試菌株培養(yǎng)性狀相同的病原菌,表明從離體牡丹葉片上分離的病原菌為原接種病原菌。

2.3 病原菌菌落與形態(tài)學(xué)特征

將三種牡丹病害的病原菌分離物MDHB、MDTJ和MDYB接種于PDA平板上,培養(yǎng)7d后,牡丹紅斑病菌分離物MDHB的菌落正面為橄欖綠色,背面呈墨綠色,后期形成星裂狀,菌絲短絨狀,菌落生長緩慢,菌落邊緣有一圈白色菌絲(圖2a～b);顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其菌絲有隔,分生孢子多為長橢圓形,大小不等,呈灰色,分生孢子梗多簇生,有2～6個分隔,分生孢子成串著生于分生孢子梗頂端(圖2c～d)。牡丹炭疽病菌分離物MDTJ菌落初期為白色,后變?yōu)榛野咨?氣生菌絲絨毛狀,前期可產(chǎn)生黑色的分生孢子堆,后期產(chǎn)生橘紅色分生孢子團(tuán),菌落背面可觀察到明顯的同心輪紋(圖2e～f);顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其菌絲無色有隔,分生孢子無色,單胞,橢圓形或圓筒形,兩端鈍圓,淺灰色,分生孢子內(nèi)部有1～2個油球(圖2g～h)。牡丹黑斑病菌分離物MDYB菌落生長速度快,氣生菌絲發(fā)達(dá)呈長絨狀,菌落正面初為白色,后漸變?yōu)榘岛稚?中央為灰綠色,菌落背面呈暗褐色至黑色(圖2i～g);顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其菌絲暗色有隔,分生孢子梗暗褐色,單生或數(shù)根叢生,有分支,直立或彎曲,頂生分生孢子,分生孢子單生或鏈狀著生,卵形,長橢圓形或倒棍棒形,淡褐色,1～4個縱、斜隔膜和3～8個橫隔膜,分隔處略縊縮或不縊縮(圖2k～l)。根據(jù)病原菌菌落、菌絲和分生孢子的形態(tài)特征初步將牡丹紅斑病菌分離物MDHB、牡丹炭疽病菌分離物MDTJ和牡丹黑斑病菌分離物MDYB歸于枝孢霉屬Cladosporium、刺盤孢屬Colletotrichum和鏈格孢屬Alternaria真菌。

圖2 牡丹病害病原菌的菌落、菌絲和分生孢子形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of colonies, mycelia and conidia of the pathogenic fungi causing tree peony diseases

2.4 病原菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

利用真菌鑒定通用引物ITS1/ITS4對3個病原菌分離物基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測序后均獲得約500 bp的ITS序列,將獲得的序列提交至GenBank,得到分離物MDHB、MDTJ和MDYB的ITS序列登錄號分別為KY398831、KY398833和KY398832。利用Blastn軟件進(jìn)行序列同源性比對,結(jié)果表明,牡丹紅斑病菌分離物MDHB與枝孢霉屬Cladosporiumsp.(KR492688)序列同源性為99%;牡丹炭疽病菌分離物MDTJ與膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides(AY266374)序列同源性為100%;牡丹黑斑病菌與鏈格孢菌Alternariaalternata(KX016032)序列同源性為100%。從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取與3種牡丹病害病原菌分離物序列同源性較高的菌株,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),系統(tǒng)發(fā)育樹形成3個明顯的分支,將三種牡丹病原菌分離物的ITS序列顯著區(qū)分,且分離物MDHB、MDTJ和MDYB分別與其親緣關(guān)系較近的真菌歸為一類。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察和ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析,最終將牡丹3種病害的病原菌分離物分別鑒定為枝孢霉菌Cladosporiumsp.、膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides和鏈格孢菌Alternariaalternata。

3 結(jié)論與討論

目前關(guān)于牡丹病害的研究仍存在一定的問題,如一些牡丹病害病原菌種類的不確定性;同時關(guān)于牡丹病害病原菌的鑒定也多停留于病原菌形態(tài)特征的觀察,其鑒定的準(zhǔn)確性有待考證。因此本研究調(diào)查了洛陽牡丹葉部3種主要病害,記錄其癥狀特征、進(jìn)行致病性測定,經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS序列鑒定,確定引起洛陽地區(qū)牡丹3種主要葉部病害紅斑病、炭疽病和黑斑病的病原菌分別為枝孢霉菌Cladosporiumsp.、鏈格孢菌A.alternata和膠孢炭疽菌C.gloeosporioides。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)牡丹紅斑病是牡丹生長發(fā)育期間危害嚴(yán)重的葉部病害,目前關(guān)于牡丹紅斑病的報道相對較多,研究認(rèn)為引起牡丹紅斑病的病原菌主要為牡丹枝孢霉C.paeoniae[10-11]。牡丹和芍藥是同屬種,二者常毗鄰栽植,芍藥紅斑病是危害芍藥生長的重要病害,藍(lán)瑩和李麗等研究發(fā)現(xiàn)引起芍藥紅斑病的病原菌有3種,分別為牡丹枝孢霉C.paeoniae[12]、鏈格孢A.alternata和細(xì)極鏈格孢A.tenuissima[13],表明芍藥紅斑病可能由幾種病原菌交叉引起,在不同種植區(qū)其病原菌種類有所不同。本研究分離獲得的牡丹紅斑病原菌其菌落形態(tài)與牡丹枝孢霉相同,但I(xiàn)TS序列卻與牡丹枝孢霉同源性較低,與枝孢霉屬未知種序列相似性較高,表明引起牡丹紅斑病的病原菌除了牡丹枝孢霉外,枝孢霉屬的其他種類也可能參與致病。

植物炭疽菌是廣泛分布于熱帶、亞熱帶的一種全球性植物病原菌,可以引起禾本科植物、果樹、花卉、蔬菜等植物的炭疽病[14],目前關(guān)于多種植物的炭疽病已被詳細(xì)研究[15-17]。牡丹炭疽病在牡丹生長發(fā)育期間也廣泛發(fā)生,為洛陽地區(qū)牡丹的主要葉部病害。但關(guān)于牡丹炭疽病方面的研究還相對較少,研究者僅描述了牡丹炭疽病的發(fā)病癥狀,將其病原菌歸于刺盤孢屬真菌[18]。本研究首次將引起牡丹炭疽病的病原菌鑒定為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides。膠孢炭疽菌分布和寄主范圍廣泛,是炭疽菌屬最常見的種類,其對植物危害性較大[19]。因此,牡丹炭疽病病原菌的準(zhǔn)確鑒定可為該病害的防治提供可靠的依據(jù)。

圖3 基于牡丹病原菌ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic relationship of tree peony pathogenic fungi based on ITS gene homology

牡丹黑斑病多在牡丹生長后期發(fā)生,且危害嚴(yán)重,主要由鏈格孢屬真菌引起。本研究中分離獲得的牡丹黑斑病病原菌為鏈格孢菌A.alternata,與石良紅等[20]的研究結(jié)果一致,但筆者在分離病原菌時,還獲得了另外一種鏈格孢菌,經(jīng)致病性測定,發(fā)現(xiàn)也能引起牡丹黑斑病的發(fā)生。由于鏈格孢屬真菌多為弱寄生性真菌,對寄主的適應(yīng)性較為廣泛,因此推測牡丹黑斑病可能由多種鏈格孢屬真菌引起,其不同種類鏈格孢菌的致病性是否存在差異,有待進(jìn)一步研究。

隨著洛陽地區(qū)牡丹種植面積的增加,尤其是近幾年油用牡丹種植面積的增加,牡丹病害的防控逐漸成為牡丹栽培管理過程中的重要事項,目前有關(guān)牡丹病害的基礎(chǔ)性研究很少,病害防治以化學(xué)防治為主,容易造成環(huán)境污染,且易導(dǎo)致病原菌抗病性的增加,因此今后應(yīng)從病原學(xué)和病害流行學(xué)入手,明確病害流行發(fā)生規(guī)律,找出關(guān)鍵防治時期,開展綠色生態(tài)防控研究,保障牡丹種植產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展;同時,應(yīng)進(jìn)一步開展牡丹病害病原菌致病性分析,調(diào)查和分析病原菌在不同牡丹品種上的致病性差異,獲得抗病性強的品種,為牡丹的抗病育種提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 田 喆)

IsolationandidentificationofthreemainleafpathogensontreepeonyinLuoyang

Xuan Junhao, Zhang Yuanbo, Meng Chenggong, Peng Biaobiao, Yang Ruixian

(DepartmentofEnvironmentalEngineeringandChemistry,LuoyangInstituteofScienceandTechnology,Luoyang471023,China)

In order to identify the symptoms and pathogens of the main leaf diseases of tree peony, infected leaves were collected from four tree peony-growing regions in Luoyang in 2016. The pathogenic isolates were obtained and purified by tissue isolation method. The pathogenicity was proved by the Koch’s rule. The pathogenic isolates were identified based on morphological characteristics and gene sequencing analysis. The results showed that the main leaf diseases on tree peony were red spot, anthracnose and leaf spot. The pathogens of three leaf diseases were identified asCladosporiumsp.,ColletotrichumgloeosporioidesandAlternariaalternata. This research provides theoretical basis for rapid diagnosis and control of tree peony diseases.

tree peony; leaf disease; pathogen; identification

2017-02-23

2017-03-11

國家自然科學(xué)基金(31500008); 河南省科技廳科技攻關(guān)項目(152102210328)

* 通信作者 E-mail: fairy19790805@163.com

S 436.81

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.014