葛樹卿 賈桂枝 戴紅良 王玥 梁春光

索拉菲尼通過活化p38MAPK抑制人口腔癌TCA8113細胞增殖

葛樹卿 賈桂枝 戴紅良 王玥 梁春光

目的觀察索拉菲尼對人口腔癌TCA8113細胞增殖的影響并探討其作用機制。方法以濃度(2.5、5、10、20 μg/ml)索拉菲尼干預(yù)人口腔癌TCA8113細胞48 h后，以MTT法及集落形成實驗檢測細胞增殖，蛋白質(zhì)免疫印跡檢測不同濃度拉菲尼對p38MAPK活化的影響；為檢測p38MAPK在索拉菲尼抗TCA8113細胞增殖中的作用，先以10 μmol/L SB203580(p38MAPK特異性抑制劑)預(yù)處理TCA8113細胞30 min，隨后加入不同濃度索拉菲尼繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以MTT法檢測細胞增殖情況。結(jié)果索拉菲尼能顯著抑制TCA8113細胞的增殖，其抗增殖活性具有濃度依賴性；索拉菲尼還可明顯增強p38MAPK的活化，而SB203580可顯著緩解索拉菲尼誘導(dǎo)的TCA8113細胞活力下降。結(jié)論索拉菲尼可抑制人口腔癌TCA8113細胞的增殖，其機制可能與其增強p38MAPK活化有關(guān)。

索拉菲尼； TCA8113； 增殖； p38MAPK

作為最常見的口腔惡性腫瘤，口腔鱗狀細胞癌占頭頸部腫瘤的80%以上[1],其發(fā)病率在過去的十年間增加了50%。患者預(yù)后較差，即使通過手術(shù)切除，口腔癌仍存在著較高的局部復(fù)發(fā)率，患者死亡率并無明顯下降，5 年生存率只有約50%[2-4]。因此，有必要開發(fā)有效的治療藥物以改善口腔癌患者的預(yù)后[5]。

索拉菲尼是一種供口服應(yīng)用的多靶點的生物靶向新藥，其作用靶點為腫瘤細胞及腫瘤周圍血管組織上的受體酪氨酸激酶及其下游的絲/蘇氨酸蛋白激酶[6]。研究顯示索拉菲尼對C-Raf激酶、B-Raf激酶、血管內(nèi)皮生長因子受體-2以及血小板源性生長因子β等均具有強大的抑制作用[7]。通過對上述蛋白激酶的抑制作用，索拉菲尼可顯著抑制腫瘤細胞的增殖及血管化，發(fā)揮其抗腫瘤活性。研究顯示，索拉菲尼可顯著抑制肝癌[8]、胃癌[9]、滑膜肉瘤[10]、乳腺癌[11]等多種人類腫瘤的生長。而目前對索拉菲尼是否可抑制口腔癌的生長尚不清楚。為此，本研究擬探討索拉菲尼對人口腔癌TCA8113細胞增殖的抑制作用及其作用機制，以期為臨床上口腔癌應(yīng)用分子靶向藥物治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人口腔癌TCA8113細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫；索拉菲尼購自拜耳公司；胎牛血清購自Hyclone公司；胰蛋白酶及p38MAPK特異性抑制劑SB203580、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)購于美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國康寧公司；RIPA裂解液購自南京諾維贊生物科技有限公司；p38MAPK、phospho-p38MAPK一抗購自SAB (Signalway antibody)公司, HRP標(biāo)記二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 TCA8113細胞培養(yǎng)

人口腔癌TCA8113細胞株以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，0.25% EDTA胰酶消化細胞，每3天傳代1 次。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞活力檢測

采用MTT比色法檢測索拉菲尼對TCA8113細胞活力的影響。取對數(shù)生長期的細胞接種于96 孔板。待細胞貼壁后，以0.1% DMSO(對照組)及不同濃度的索拉菲尼(2.5、5、10、20 μg/ml)作用TCA8113細胞48 h。隨后加入MTT(終濃度: 5 mg/ml), 置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄去MTT, 加入150 μl DMSO在37 ℃作用10 min并充分振搖直到結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀(Bio-Rad)在波長490 nm處檢測吸光度值。

1.4 集落形成實驗

TCA8113細胞以1 000 個細胞/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后，以0.1% DMSO(對照組)及不同濃度的索拉菲尼作用TCA8113細胞10 d。以PBS清洗后，以4%多聚甲醛于室溫固定20 min，再用PBS洗3 遍，用結(jié)晶紫染色，按下式計算集落形成率(colony-forming efficiency, CFE)：

CFE=(集落數(shù)/接種細胞數(shù))×100%

1.5 Western blot

細胞以預(yù)冷PBS洗3 遍，加入RIPA細胞裂解液 [臨用前加入0.1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride, PMSF)]提取細胞總蛋白， BCA法測定蛋白濃度。取35 μg總蛋白，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。待電泳完成后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。用1%BSA封閉1 h，接著加待檢測蛋白的一抗4 ℃孵育過夜。TBS-T充分洗膜后，以HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。TBS-T洗膜后，化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 索拉菲尼對TCA8113細胞活力的影響

與對照組相比，不同濃度索拉菲尼處理TCA8113細胞48 h后， MTT檢測結(jié)果顯示，隨著索拉菲尼濃度的增加，TCA8113細胞活力逐漸降低(圖 1)。

圖 1 索拉菲尼對TCA8113細胞增殖的影響

Fig 1 The effects of sorafenib on the proliferation of TCA8113 cells

2.2 索拉菲尼對TCA8113細胞集落形成率的影響

與對照組相比，不同濃度索拉菲尼處理TCA8113細胞10 d后， 集落形成實驗結(jié)果示隨著索拉菲尼濃度的增加，TCA8113細胞集落形成率逐漸降低，當(dāng)藥物濃度達到10 μg/ml以上時，幾乎沒有集落形成(圖 2)。

2.3 索拉菲尼對TCA8113細胞p38MAPK活化的影響

與對照組相比，不同濃度索拉菲尼處理TCA8113細胞48 h后，Western blot結(jié)果顯示，TCA8113細胞p38MAPK的表達未發(fā)生明顯變化，而不同濃度的索拉菲尼可明顯增強磷酸化p38MAPK(phospho-p38MAPK)的表達，提示索拉菲尼的抗口腔癌細胞增殖活性可能與其促進p38MAPK的活化有關(guān)(圖 3)。

2.4 SB203580對不同濃度索拉菲尼誘導(dǎo)的TCA8113細胞活力降低的影響

與對照組相比，不同濃度索拉菲尼處理TCA8113細胞48 h后，MTT檢測結(jié)果顯示，隨著索拉菲尼濃度的增加，TCA8113細胞活力逐漸降低；而SB203580預(yù)處理能明顯緩解由索拉菲尼誘導(dǎo)的癌細胞活力降低(圖 4)，進一步表明索拉菲尼的抗口腔癌細胞增殖活性與其促進p38MAPK的活化有關(guān)。

圖 2 索拉菲尼處理TCA8113細胞10 d后對集落形成率的影響

圖 3 索拉菲尼對TCA8113細胞p38MAPK活化的影響

圖 4 SB203580對不同濃度索拉菲尼誘導(dǎo)的TCA8113細胞活力降低的影響

Fig 4 The effects of SB203580 on sorafenib induced TCA8113 cell viability decrease

3 討 論

口腔癌是世界上六種最常見的惡性腫瘤之一[12]。近年來其發(fā)病率逐年增高，并具有年輕化發(fā)展的趨勢[13-14]。盡管口腔癌的診療手段不斷進步，但目前對于其治療仍極為困難，患者預(yù)后較差。舌癌的惡性程度高，往往在早期即出現(xiàn)較大范圍的浸潤和轉(zhuǎn)移[14]。而外科治療帶來的部分或全舌缺如嚴(yán)重地影響患者的生存質(zhì)量。因此，有必要開發(fā)新的抗口腔癌治療藥物及方式。

索拉菲尼的作用靶點為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)上游的受體酪氨酸激酶及其下游的絲/蘇氨酸蛋白激酶。索拉菲尼既可通過抑制Raf/MEK/ERK通路直接抑制腫瘤的生長，又可通過抑制VEGFR、PDGFR及抑制腫瘤新生血管的形成而間接抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。研究證實，索拉菲尼對多種人類腫瘤都顯示出有效的抑制活性[16]。目前對于索拉菲尼是否可抑制口腔癌細胞的增殖尚不清楚。本研究利用MTT及集落形成實驗證實索拉菲尼對口腔癌細胞同樣顯示出強大的抗增殖活性，為我們進一步認(rèn)識索拉菲尼的藥理活性提供了實驗依據(jù)。

p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶通路中的關(guān)鍵分子，大量研究證實p38MAPK的活化水平對于包括肺癌、結(jié)腸癌和宮頸癌等在內(nèi)的多種腫瘤細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡和腫瘤血管生成等均有重要的調(diào)控作用，促進p38MAPK的活化對多種腫瘤細胞有抑制作用[17-19]。如牛蒡苷抗口腔癌TCA8113細胞的增殖活性即與其促進p38MAPK的活化有關(guān)[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼明顯促進p38MAPK的活化，而p38MAPK特異性抑制劑SB203580可顯著緩解索拉非尼引起的癌細胞活力降低，充分說明索拉菲尼抑制TCA8113細胞的增殖的生物活性是通過誘導(dǎo)p38MAPK活化實現(xiàn)的。

本研究首次證實索拉菲尼對口腔癌細胞具有顯著的抗增殖活性，該生物活性與其活化p38MAPK有關(guān)。該實驗表明索拉菲尼有望成為新的抗口腔癌治療藥物。

[1] Ren A, Qiu Y, Cui H, et al. Inhibition of H3K9 methyltransferase G9a induces autophagy and apoptosis in oral squamous cell carcinoma[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 459(1): 10-17.

[2] Wang CQ, Li YJ, Wei ZM, et al. Stable gene-silence of Kif2a synergistic with 5-fluorouracil suppresses oral tongue squamous cell carcinoma growthinvitroandinvivo[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol, 2013, 116(1): 49-54.

[3] 喬光偉,唐海萍,景捷. 氟伐他汀鈉對舌鱗癌Tca8113細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達影響的研究[J]. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 31(2): 262-265.

[4] Shao Y, Sha XY, Bai YX, et al. Effect of A disintegrin and metalloproteinase 10 gene silencing on the proliferation, invasion and migration of the human tongue squamous cell carcinoma cell line TCA8113[J]. Mol Med Rep, 2015, 11(1): 212-218.

[5] 戴紅良, 葛樹卿, 楚明會, 等. 染料木黃酮通過抑制VEGF表達抑制人口腔癌TCA8113細胞增殖[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(3): 464-469.

[6] Hahn O, Stadler W. Sorafenib[J]. Curr Opin Oncol, 2006, 18(6): 615-621.

[7] Chang F, Steelman LS, Lee JT, et al. Signal transduction mediated by the Ras/Raf/MEK/ERK pathway from cytokine receptors to transcription factors: Potential targeting for therapeutic intervention[J]. Leukemia, 2003, 17(7): 1263-1293.

[8] Kanda T, Ogasawara S, Chiba T, et al. Current management of patients with hepatocellular carcinoma[J]. World J Hepatol, 2015, 7(15): 1913-1920.

[9] Juan LW, En LM, Hao L, et al. Sorafenib regulating ERK signals pathway in gastric cancer cell[J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2014, 38(2): 438-443.

[10]Peng CL, Guo W, Ji T, et al. Sorafenib induces growth inhibition and apoptosis in human synovial sarcoma cells via inhibiting the RAF/MEK/ERK signaling pathway[J]. Cancer Biol Ther, 2009, 8(18): 1729-1736.

[11]Kacan T, Altun A, Altun GG, et al. Investigation of antitumor effects of sorafenib and lapatinib alone and in combination on MCF-7 breast cancer cells[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014, 15(7): 3185-3189.

[12]Shao Y, Zhang SQ, Quan F, et al. MicroRNA-145 inhibits the proliferation, migration and invasion of the human TCA8113 oral cancer line[J]. Oncol Lett, 2013, 6(6): 1636-1640.

[14]于四海, 嚴(yán)曉峰. 牛蒡苷通過激活p38 MAPK抑制舌癌Tca8113細胞增殖的實驗研究[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2015, 27(5): 645-647，651.

[15]陸群英, 許雪, 吳原, 等. 新型靶向藥物索拉菲尼對黑色素瘤細胞株A375細胞增殖及遷移能力影響的研究[J]. 全科醫(yī)學(xué)臨床與教育, 2015, 13(4): 376-379，389.

[16]Ng R, Chen EX. Sorafenib (BAY 43-9006): Review of clinical development[J]. Curr Clin Pharmacol, 2006, 1(3): 223-228.

[17]Liu J, Wen D, Fang X, et al. p38MAPK signaling enhances glycolysis through the up-regulation of the glucose transporter GLUT-4 in gastric cancer cells[J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 36(1): 155-165.

[18]Lee EJ, Park HG, Kang HS. Sodium salicylate induces apoptosis in HCT116 colorectal cancer cells through activation of p38MAPK[J]. Int J Oncol, 2003, 23(2): 503-508.

[19]Changchien JJ, Chen YJ, Huang CH, et al. Quinacrine induces apoptosis in human leukemia K562 cells via p38 MAPK-elicited BCL2 down-regulation and suppression of ERK/c-Jun-mediated BCL2L1 expression[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2015, 284(1): 33-41.

(收稿： 2016-10-26 修回： 2016-12-18)

SorafenibinhibitstheproliferationofhumanoralcancerTCA8113cellsthroughtheactivationofp38MAPK

GEShuqing1,JIAGuizhi2,DAIHongliang3,WangYue3,LiangChunguang3.

1. 121001Jinzhou,DepartmentofStomatologyoftheFirstAffiliatedHospital,JinzhouMedicalUniversity,China; 2.DepartmentofPhysiology,JinzhouMedicalUniversity; 3.SchoolofNursing,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou

Objective: To investigate the effect of sorafenib on the proliferation of human oral cancer TCA8113 cells and to explore the underlying mechanisms.MethodsAfter treated with sorafenib at 2.5, 5, 10, 20 μg/ml respectively for 48 h, TCA8113 cell proliferation was examined by MTT and colony formation assay. Western blotting was employed to examine the p38MAPK expression in the cells. TCA8113 cells were pretreated with 10 μmol/L of SB203580 (a specific inhibitor of p38MAPK) for 30 min, and then by different concentrations of sorafenib for 48 h, cell proliferation was tested by MTT assay.ResultsSorafenib significantly inhibited the proliferation of TCA8113 cells in a concentration dependent fashion. Sorafenib also remarkably promoted the activation of p38MAPK of the cells. SB203580 significantly alleviated sorafenib induced TCA8113 cell viability decrease.ConclusionSorafenib can inhibit the proliferation of TCA8113 cells, which may be related to the activation of p38MAPK.

Sorafenib；TCA8113；Proliferation；p38MAPK

121001， 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科[葛樹卿(現(xiàn)在濰坊市人民醫(yī)院口腔頜面外科)]； 錦州醫(yī)科大學(xué)生理教研室(賈桂枝)； 錦州醫(yī)科大學(xué)護理學(xué)院(戴紅良 王玥 梁春光)

戴紅良 E-mail：jy2006hldai@sohu.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.023