楊其彬 李運東 江世貴 黃建華 姜 松 邱麗華朱彩艷 周發(fā)林

(1. 中國水產科學研究院南海水產研究所, 廣州 510300; 2. 農業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室, 廣州 510300)

斑節(jié)對蝦α-淀粉酶基因的克隆及其表達分析

楊其彬1,2李運東1,2江世貴1,2黃建華1,2姜 松1,2邱麗華1,2朱彩艷1,2周發(fā)林1,2

(1. 中國水產科學研究院南海水產研究所, 廣州 510300; 2. 農業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室, 廣州 510300)

為了研究斑節(jié)對蝦α-淀粉酶基因的結構和生物學功能, 根據原實驗室構建的斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon) cDNA文庫得到的EST序列, 利用RACE技術獲得了斑節(jié)對蝦α-淀粉酶基因(PmAmy)的cDNA全長序列。該基因序列全長2465 bp, 包括2175 bp的開放閱讀框, 編碼724個氨基酸, 分子總量為78.9 kD, 理論等電點為4.66。PmAmy包含一個α-淀粉酶家族保守的A結構域(Thr34-Ser410)和一個C結構域(Glu420-Ala496)。PmAmy氨基酸序列與其他物種的相似性為47%—99%, 利用PmAmy構建的進化樹顯示斑節(jié)對蝦和凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的親緣關系最近。基因表達結果顯示PmAmy在肝胰腺組織中的表達量顯著高于其他組織(P＜0.05)。斑節(jié)對蝦PmAmy基因在卵巢發(fā)育的過程中均有表達, 表達量有所變化, 雖然沒有發(fā)現顯著性的差異(P=0.09)。斑節(jié)對蝦PmAmy在整個生長階段的檢測中都有表達, 其中幼體發(fā)育過程中存在顯著性差異,糠蝦時期PmAmy表達量顯著高于無節(jié)幼體、溞狀幼體和仔蝦時期(P＜0.05)。以上實驗結果初步說明了PmAmy可能與斑節(jié)對蝦的幼體發(fā)育相關。

斑節(jié)對蝦; α-淀粉酶; 基因克隆; 基因表達; 幼體發(fā)育

α-淀粉酶(α-Amylase)是a-1,4-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶(α-1,4-glucan-glucanhydrolase)的簡稱, 屬于糖基水解酶13家族(Glycosyl hydrolase family 13),即a-淀粉酶家族[1]。甲殼動物的生長、發(fā)育、繁殖等過程所需的營養(yǎng)素基本來源于消化酶對餌料或儲存營養(yǎng)物質的消化及機體的重新合成。甲殼動物肝胰腺中的多種酶類的作用也決定了對營養(yǎng)物質的消化能力, 大量研究表明生物的高生長率、低死亡率和體重等都與消化能力有著緊密的聯(lián)系[2]。α-淀粉酶是甲殼動物消化腺中一種重要的碳水化合物水解酶類, 它以隨機作用的方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內的任意α-1,4葡萄糖苷鍵,生成麥芽糖、葡萄糖和低聚糖等化合物供予機體,與其他類型如β-淀粉酶家族、葡萄糖糖化酶、異淀粉酶等水解淀粉的酶類相比, α-淀粉酶類具有更快的作用[3], 其分泌機能的強弱直接影響生物對食物的消化能力, 從而影響生長繁殖等其他生理過程[4]。

目前α-淀粉酶基因已從多種生物中克隆得到并進行研究, 如黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)[5]、斑馬魚(Danio rerio)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)[6]、長牡蠣(Crassostrea gigas)[7]、合浦珠母貝(Pinctada fucata)[8]等。對α-淀粉酶功能的研究也有很多報道, 如Vanwormhoudt等[9]測定了多種從甲殼動物肝臟提取物的α-淀粉酶活性, 發(fā)現α-淀粉酶活性在一些蝦蟹類(Penaeid, Brachyura, Anomura)中很高, 而在濱蟹屬(Carcinus)、龍蝦(Palinurus)等品種中非常低。在魚類上有研究發(fā)現, 淀粉酶活性水平與腸道填充度和動物的營養(yǎng)條件相關, 魚類淀粉酶水平飽腹時較高, 幼魚比成魚高[10—12]。Huvet等[13]對太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)α-淀粉酶基因多態(tài)性與生長性狀、消化特性的相關性進行了研究,α-淀粉酶基因對牡蠣的攝食及吸收效率有顯著影響, 進而影響牡蠣的生長。此外, Prudence等[14]的研究發(fā)現, α-淀粉酶基因的多態(tài)性與牡蠣的生長顯著相關, 并認為淀粉酶基因的分子標記在育種中具有潛在應用價值。對蝦上的現有研究表明α-淀粉酶是對蝦的重要消化酶, α-淀粉酶基因對生長發(fā)育過程具有重要影響, 被認為是與對蝦生長性狀相關的重要候選基因之一[15,16]。

斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)是對蝦類中體形最大的一種對蝦, 具有生長快、適應性強、營養(yǎng)價值高的優(yōu)點, 是當前世界上三大蝦類養(yǎng)殖品種之一,也是中國和東南亞地區(qū)重要的傳統(tǒng)優(yōu)質對蝦資源。因此本研究對斑節(jié)對蝦α-淀粉酶基因cDNA序列克隆分析, 初步探究該基因對斑節(jié)對蝦生長發(fā)育的影響和潛在生物學功能, 為下一步α-淀粉酶基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點篩選及其與生長性狀的關聯(lián)性分析、分子標記輔助育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物: 斑節(jié)對蝦來源于南海水產研究所(深圳基地)斑節(jié)對蝦遺傳育種中心, 在水溫(25±2)℃、鹽度為30‰的循環(huán)水池中暫養(yǎng)3d后取樣, 用于cDNA克隆及組織表達等實驗。選取雌性斑節(jié)對蝦3尾(體質量20—50 g)取組織樣品, 包括腦、眼柄、鰓、心、肝胰腺、腸、胃、神經、肌肉、卵巢等組織用于組織表達實驗。根據形態(tài)學特征[17,18]初步判斷卵巢發(fā)育期, 取斑節(jié)對蝦(體質量20—200 g)發(fā)育為Ⅰ期至Ⅴ期的卵巢組織用于熒光定量實驗。參照江世貴等[19]對斑節(jié)對蝦生命史的研究, 分別采集斑節(jié)對蝦的無節(jié)幼體、溞狀幼體、糠蝦和仔蝦時期的幼體, 和后期仔蝦、幼蝦、亞成蝦和成蝦生長階段的肝胰腺組織, 用于各生長階段的基因定量表達實驗。以上樣品組織都采用RNAlater?Solution保存, 4℃過夜后–80℃保存。

實驗試劑: RNAlater Tissue Collection購自普博生物公司; RNA提取試劑盒(RNeasy Plus Mini Kit)購自QIAGEN公司; Trizol Reagent購自Invitrogen公司; 逆轉錄試劑盒PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自Promega公司; pMT18-T Vector、T4 DNA Ligase和DL5000 DNA Marker, 熒光定量試劑盒TaKaRa SYBR、PrimeScriptTM RTPCR Kit (Perfect Real Time)購自TaKaRa公司; 感受態(tài)細胞大腸桿菌菌株由本實驗制備。

1.2 試驗方法

總RNA提取及cDNA的合成用于cDNA克隆的模板來源于卵巢、精巢、肝胰腺的混合樣品(總質量30 mg), 提取斑節(jié)對蝦上述樣品組織的總RNA。提取的RNA經瓊脂糖凝膠電泳確定其完整度, 經分光光度計測定純度。以總RNA (2 μg)為模板采用逆轉錄試劑盒, 經過42℃ 15min延伸和70℃15min逆轉錄反應后得到cDNA的第一條鏈。

斑節(jié)對蝦α-淀粉酶基因cDNA的克隆對已經構建的cDNA文庫中的EST序列進行BLAST分析, 結果顯示有一條EST序列與凡納濱對蝦α-淀粉酶基因高度同源。利用Premier5.0軟件設計引物,引物由華大基因生物公司合成。利用cDNA末端快速擴增技術(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)、降落PCR技術和半巢式PCR (Semi-nest PCR)技術擴增目的基因的3′末端。在3′RACE中,降落PCR使用正向引物AMY-F1和接頭通用引物UPM (引物見表1), 所得PCR產物稀釋50倍后取2 μL用于巢式PCR, 反應程序及條件參照實驗室研究文獻設置[20]。反應結束后的產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 膠回收目的片段后與pMT18-T載體進行連接, 然后在大腸桿菌感受態(tài)細胞中轉化, 將轉化后的大腸桿菌均勻涂到培養(yǎng)基上, 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8—10h后挑取平板中的陽性克隆, 經過菌液PCR鑒定后送往華大公司測序。

表1 實驗中所用引物序列Tab. 1 Primers sequences used in this experiment

1.3 序列分析

測序結果采用Dnaman軟件分析拼接, 運用EdiSeq程序預測開放閱讀框及氨基酸序列, 通過GOR4方法(http://www.expasy.org/)進行二級結構分析, 用SMART (Simple Modular Architecture Research Tool)(http://smart.emblheidelberg.de/)軟件分析蛋白的結構域, 通過NCBI中BLAST對斑節(jié)對蝦及其他物種的淀粉酶氨基酸序列進行多重比對,3D結構預測和查看采用phyre2軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)軟件、Swiss-model (http://swissmodel.expasy.org)程序和FirstGlance in Jmol(http://bioinformatics.org/firstglance/)程序, 用Clustalx2.0.11和Bioedit軟件進行多序列比對, 采用鄰位相接法構建系統(tǒng)進化樹, 軟件使用MEGA5.0。

1.4 斑節(jié)對蝦α-淀粉酶基因的表達分析

利用RNA提取試劑盒提取斑節(jié)對蝦各組織(包括心臟、肝胰腺、淋巴、性腺、肌肉、腦、鰓、腸、胃、眼柄和胸腺神經)的總RNA, 并反轉錄合成cDNA, 以備熒光定量RT-PCR模板使用。運用同樣的方法獲得卵巢發(fā)育Ⅰ—Ⅴ期的熒光定量RTPCR模板和8個生長時期的熒光定量模板。每個時期設置3個平行, 實驗中每個時期樣本使用的質量約為30 mg。

根據斑節(jié)對蝦α-淀粉酶基因的cDNA序列設計特異性引物AMY (RT)-F和AMY (RT)-R, 參照已有研究報道[20]選用β-actin為內參基因, 引物序列為βactin-F和βactin-R (表1)。依照TaKaRa SYBR Premix ExTaqTMKit (Perfect Real Time)試劑盒說明書進行PCR反應。以蒸餾水代替模板作為陰性對照,樣品和內參均設3個重復。實驗數據采用相對ΔCt法(2–ΔΔCt法)分析PmCatL基因在斑節(jié)對蝦各組織中的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學分析

所得數據采用SPSS18.0軟件的單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行處理, 結果值以平均值±標準差(Mean±SD)表示。采用Duncan檢驗顯著性差異(P＜0.05)。

2 結果

2.1 斑節(jié)對蝦α-淀粉酶基因序列分析

利用特異性引物進行擴增, 將擴增產物測序后與EST序列拼接, 獲得斑節(jié)對蝦α-淀粉酶基因的cDNA序列, 命名為PmAmy, 其在NCBI的GenBank登錄號為KU308415。PmAmy基因全長2465 bp, 包括73 bp的5′端非編碼區(qū)(Untranslated region, UTR),217 bp的3′端非編碼區(qū)和2175 bp的開放閱讀框(Open reading frame, ORF), 含有polyA加尾信號AATAAA。經過對其編碼氨基酸序列預測分析,PmAmy編碼的氨基酸序列含有724個氨基酸, 其中含量最多的是甘氨酸(Gly)和纈氨酸(Val)分別占總氨基酸含量的11.3%和8.6%。分子總量為78.9 kD,理論等電點為4.66。結構域分析表明,PmAmy的N端含有21個氨基酸組成的信號肽;PmAmy還包含有一個α-淀粉酶家族保守的A結構域(Thr34-Ser410)和一個C結構域(Glu420-Ala496)。

2.2 斑節(jié)對蝦與其他動物α-Amylase同源性分析

PmAmy與凡納濱對蝦的一致性最高為99%。與長牡蠣、合浦珠母貝、人、牛的一致性分別為55%、48%、47%和48%。通過與其他動物α-Amylase的比對, 該基因編碼氨基酸中的半胱氨酸位點、活性催化位點、鈣結合位點和氯離子結合位點在物種間都非常保守。

通過鄰位相連法構建的進化樹如圖1所示, 斑節(jié)對蝦與凡納濱對蝦的親緣關系最近, 其次是羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii), 三者聚為一小支, 與哺乳動物的親緣關系較遠。這樣的進化關系與一致性分析結果一致, 也符合傳統(tǒng)形態(tài)學上各物種的分類地位。

2.3 斑節(jié)對蝦PmAmy基因表達特征分析

組織表達結果顯示,PmAmymRNA在所檢測組織中, 表達量存在顯著差異。肝胰腺組織中的表達量顯著高于其他各個組織(P＜0.05), 在淋巴、鰓、腸中也有一定的表達, 表達量最低的是眼柄神經和心臟組織(圖2)。

斑節(jié)對蝦PmAmy基因在卵巢發(fā)育的過程中均有表達, 表達量有所變化, 但是統(tǒng)計學分析顯示并沒有發(fā)現顯著性的差異(P=0.09)(圖3)。斑節(jié)對蝦PmAmy在整個生長階段的檢測中都有表達。在幼體發(fā)育過程中存在顯著性差異, 糠蝦時期PmAmy表達量達到峰值, 顯著高于無節(jié)幼體、糠蝦和仔蝦三個生長階段(P＜0.05)。隨后表達量下降, 此后一直到成蝦階段, 這期間各生長時期的表達量也有變化,但在后期仔蝦、幼蝦、亞成蝦和成蝦生長時期并沒有發(fā)現顯著性差異(圖4)。

3 討論

圖1 利用Clustal W程序和MEGA 5.0軟件構建的PmAmy系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of the AMY amino acid sequence in different groups by program Clustal W and MEGA 5.0

圖2 節(jié)對蝦PmAmy基因在不同組織中的表達分布Fig. 2 Distribution of PmAmy gene expression in different tissues of P. monodon

α-淀粉酶在許多水生動物中控制著碳水化合物的代謝, 并且對生長有著重要的影響。以往較多的研究主要采用測定酶活力的分析方法, 但由于消化酶的活性會受到多種因子的影響, 從酶學水平測定消化酶分布或表達差異存在著方法上的局限性,然而從分子水平檢測α-淀粉酶基因的轉錄水平變化有著很強的特異性, 可以精確地了解α-淀粉酶的合成和分泌情況[8,22]。本研究結果表明斑節(jié)對蝦α-淀粉酶基因在被檢測的多種組織中廣泛分布, 且在肝胰腺中的表達量顯著高于其他部位。這一結果與鱖(Siniperca chuatsi)、青魚(Mylopharyngodonpiceus)的組織表達[23]有所不同, 但與合浦珠母貝[8]、草魚[22]具有相似性, 尤其與甲殼動物中的克氏原螯蝦[24](Procambarus clarkii)的研究結果較為一致。本研究中PmAmy基因在肝胰腺中表達量較高的結果可能與肝胰腺是斑節(jié)對蝦淀粉酶中心合成場所有關[8,20], 而在其他多個組織中的表達同時也說明了肝胰腺并不是PmAmy基因在斑節(jié)對蝦體內發(fā)揮作用的唯一場所。

圖3 斑節(jié)對蝦PmAmy基因在卵巢發(fā)育各時期的表達特征Fig. 3 Relative expression level of PmAmy mRNA in different development stages of ovary

圖4 斑節(jié)對蝦PmAmy基因在不同生長時期的表達Fig. 4 Expression level of PmAmy in different growth stage of P.monodon

在個體早期發(fā)育階段的功能作用, 一直是α-淀粉酶研究的重要方向之一, 國內外有很多相關報道。阮國良[3]在草魚和鳡孵化后第二天即檢測到α-淀粉酶基因的表達, 并在第7天表現出最大的α-淀粉酶mRNA表達量。其他多種魚類如日本鰻鱺、太平洋多指馬鲅(Polydactylus sexfilis)、湖鱘(Acipenser fulvescens)、河鱸(Perca fluviatilis)、赤鯛(Pagrus pagrus)等[25—28], 也都發(fā)現在仔魚的早期發(fā)育階段有較高的淀粉酶活性, 之后逐漸降低。這些研究表明, 很多魚類在發(fā)育早期缺乏完善的消化腺和穩(wěn)定消化系統(tǒng), 這時包括α-淀粉酶在內的多種消化酶在餌料和營養(yǎng)物質的消化過程中發(fā)揮著至關重要的作用[23]。本研究在斑節(jié)對蝦的整個生長階段均檢測到PmAmy基因的表達, 在糠蝦時期PmAmy基因表達量達到峰值, 這可能與斑節(jié)對蝦幼體逐漸攝食大量的輪蟲和藻類作為餌料有一定的關系, 這一結果和其他甲殼動物的研究類似但不完全一致。中國明對蝦和日本囊對蝦在幼體發(fā)育過程中, 淀粉酶活性在溞狀幼體Ⅲ期時出現一個峰值,以后逐漸減弱[29]。但是也有研究表明淀粉酶基因表達變化與個體自身發(fā)育有關, 如在中華絨螯蟹的研究中, 發(fā)現整個胚胎發(fā)育過程中, 淀粉酶的變化趨勢不明顯, 但溞狀幼體期, 酶的活性顯著升高, 這可能與幼體孵化后開口攝食的自身調控機理有關系[30], 影響α-淀粉酶表達量變化的因素還有很多,如蛻皮、溫度、鹽度等環(huán)境因子等[31]。已有研究表明, α-淀粉酶基因在凡納濱對蝦[32,33]、克氏原螯蝦[24]等多種甲殼動物的蛻皮誘導應答和生長發(fā)育中具有重要作用, 此外還與多種蝦蟹類幼體發(fā)育過程中食性的變化密切相關, 根據本研究結果推測[22,31], α-淀粉酶基因在斑節(jié)對蝦生長發(fā)育過程中的表達變化特征可能與斑節(jié)對蝦不同發(fā)育階段的食性變化有關, α-淀粉酶基因可能參與調控斑節(jié)對蝦的幼體發(fā)育過程[33]。

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CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF ALPHA AMYLASE CDNA OF PENAEUS MONODON

YANG Qi-Bin1,2, LI Yun-Dong1,2, JIANG Shi-Gui1,2, HUANG Jian-Hua1,2, JIANG Song1,2, QIU Li-Hua1,2,ZHU Cai-Yan1,2and ZHOU Fa-Lin1,2
(1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China;2. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation amp;Utilization, Ministry of Agriculture,Guangzhou 510300, China)

In order to study the structure and biological function of the alpha-amylase gene inPenaeus monodon, the full-length cDNA sequence of α-Amylase fromPenaeus monodon(PmAmy) was obtained by high throughput transcriptome sequencing and RACE. ThePmAmycDNA included an open reading frame of 2175 bp encoding a polypeptide of 724 amino acids, and the predicted molecular mass and isoelectric point were 78.9 kD and 4.66, respectively. ThePmAmycontained a conservative A domain (Thr34-Ser410) and a C domain (Glu420-Ala496) of alpha amylase family. Homology analysis revealed that the PmAmy shared 47%—99% identity to other known amylase sequences, and the phylogenetic tree showed that the PmAmy was closely related toLitopenaeus vannamei. The expression levels ofPmAmyin hepatopancreas were significantly higher than those of the other tissues (P＜0.05). ThePmAmyexpression was found in five ovarian development stages. The expression level in yolky stage (stageⅣ) was the highest among the five stages, and was the lowest in ovogonium stage (stageⅠ). The expression levels ofPmAmyshowed no significantly difference in ovary development stages. Expression ofPmAmywas detected in all tested growth stages, and the expression level in mysis was significantly higher than that in nauplius, zoea and post larval (P＜0.05). These results suggested thatPmAmymight be associated with larval development inP. monodon.

Penaeus monodon; α-Amylase; Gene cloning; Gene expression; Larval development

Q781

A

1000-3207(2017)06-1186-07

2016-07-28;

2017-04-25

現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-48); 廣東省省級科技計劃項目(2014B020202003); 廣東省海洋與漁業(yè)科技推廣專項(A201501A06); 深圳市生物產業(yè)發(fā)展專項資金現代農業(yè)生物產業(yè)推廣扶持計劃項目(NYSW201400331010053)資助[Supported by China Agriculture Research System (CARS-48); Guangdong Province Project of China (2014B020202003);Guangdong Oceanic and Fisheries Project of China (A201501A06); Shenzhen Biological Industry Development Project of China(NYSW201400331010053)]

楊其彬(1972—), 男, 廣東高州人; 本科; 主要從事水產動物遺傳育種與分子生物學研究。E-mail: yangqibin@163.com

周發(fā)林(1975—); E-mail: zhoufalin@aliyun.com

10.7541/2017.147

doi: 10.7541/2017.148