宋玉品，陳新新，張紅豆

（石家莊學(xué)院 化工學(xué)院，河北 石家莊 050035）

殼聚糖的改性及納米粒的制備

宋玉品，陳新新，張紅豆

（石家莊學(xué)院 化工學(xué)院，河北 石家莊 050035）

研究了以3種不同分子量的殼聚糖為原料，對其進行季氨化反應(yīng)合成3種不同分子量的三甲基殼聚糖，用紅外光譜對三甲基殼聚糖進行定性檢測，并測定其水溶性.水溶性順序用分子量表示為70萬＞4萬＞10萬.以分子量為70萬的三甲基殼聚糖作為載體材料，三聚磷酸鈉作為交聯(lián)劑，采用離子交聯(lián)法制備納米粒.以成球率為指標，通過單因素篩選得到制備納米粒的最優(yōu)處方：三甲基殼聚糖濃度為0.4 mg/mL，三聚磷酸鈉濃度為0.2 mg/mL，兩者的加入體積比為3∶2.

殼聚糖；三甲基殼聚糖；納米粒

0 引言

生物技術(shù)特別是基因工程和發(fā)酵工程的日益發(fā)展，使得蛋白多肽類藥物的生產(chǎn)成本日益降低，臨床上已經(jīng)成為治療內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病等多種疾病的一線用藥.然而其具有穩(wěn)定性差、半衰期短、吸收差等缺陷，對此類藥物的發(fā)展造成了很大障礙.已上市的蛋白多肽類藥物制劑以注射劑為主.由于使用不便和注射疼痛等缺陷，研究者將目光轉(zhuǎn)向安全、便捷、順應(yīng)性好的口服給藥系統(tǒng)，但面臨巨大挑戰(zhàn)：胃腸道的酸堿環(huán)境、大量酶存在導(dǎo)致蛋白多肽空間構(gòu)型改變、肽鍵斷裂而失活；親脂性差，難以通過細胞膜被動吸收；細胞間隙僅有3-10 ?[1]，只適合小分子藥物通過，蛋白多肽類藥物難以穿過[1].微粒給藥系統(tǒng)使用一定的載體材料將蛋白多肽進行包裹，能有效減少與胃腸道的接觸，降低了酸堿環(huán)境和酶對蛋白多肽的破壞.同時微粒給藥系統(tǒng)一般能夠在小腸的Peyer’s區(qū)吸收[2]，提高蛋白多肽類藥物的生物利用度.因此，尋找恰當(dāng)?shù)妮d體材料，建立微粒給藥系統(tǒng)，是開發(fā)蛋白多肽類藥物口服制劑的有效途徑.

理想的藥物載體應(yīng)該具備低成本、水溶性好、低毒性、非免疫原性、良好的理化性質(zhì)等特點[3].殼聚糖（CS）是數(shù)量僅次于纖維素的一種天然高分子化合物，由甲殼素在高溫強堿條件下脫乙酰基得到，具備很多優(yōu)良的生物學(xué)和制劑學(xué)性質(zhì)：細胞相容性好，可生物降解，毒性低；具有粘膜粘附性，增加藥物在胃腸道的滯留時間；能可逆地打開細胞旁路，促進親水性大分子物質(zhì)的吸收；易于同親電性基團反應(yīng)進行化學(xué)修飾；可以和帶負電的小分子或蛋白多肽在溫和、無有機試劑參與的條件下交聯(lián)構(gòu)建微粒給藥系統(tǒng)，而不影響其生物學(xué)活性.因此，在口服給藥系統(tǒng)中得到了廣泛應(yīng)用.由于殼聚糖在腸道生理條件下溶解性差，氨基不能質(zhì)子化，限制了其吸收促進作用的發(fā)揮.三甲基殼聚糖（TMC）是殼聚糖的季氨化衍生物，能夠在中性及堿性溶液中溶解.TMC具有與殼聚糖類似的生物學(xué)性質(zhì)，打開細胞旁路的能力增加，且未引起細胞膜損傷[4].因此，TMC成為構(gòu)建口服主動靶向給藥系統(tǒng)的理想載體.

本研究選用3種不同分子量的殼聚糖進行季氨化反應(yīng)，合成3種不同分子量的TMC，以增加其水溶性.測定三甲基殼聚糖的水溶性，選出水溶性最大的TMC作為納米粒的載體，三聚磷酸鈉（TPP）作為交聯(lián)劑，采用單離子交聯(lián)法制備TMC空白納米粒，通過單因素篩選，選出較優(yōu)處方，為進一步制備蛋白多肽類藥物殼聚糖納米粒提供依據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器試劑

實驗使用儀器及設(shè)備和原料及試劑分別見表1和表2.

表1 實驗使用儀器及設(shè)備

表2 實驗使用原料及試劑

1.2 實驗方法

1.2.1 三甲基殼聚糖的合成

將2 g CS和4.8 g碘化鈉溶于80 mL N-甲基-2-吡咯烷酮中，60℃油浴條件下加熱，冷凝回流，避光反應(yīng)60 min.向反應(yīng)液中加入11 mL濃度為15%的氫氧化鈉溶液和11.5 mL碘甲烷。繼續(xù)避光反應(yīng)90 min，得到棕色反應(yīng)液，用乙醇沉淀3次后，離心分離.沉淀用乙醇洗滌，然后溶于40 mL水中，加入250 mL濃度為1 mol/L的鹽酸乙醇溶液，以Cl-交換I-，離心分離.沉淀用乙醇浸泡過夜，乙醚洗滌3次，得到白色水溶性粉末，40℃真空干燥.將產(chǎn)物溶于30 mL去離子水中透析3 d，冷凍干燥，得白色海綿狀固體即為TMC[5].反應(yīng)流程見圖1.

圖1 TMC反應(yīng)流程

1.2.2 納米粒的制備

1.2.2.1 儲備液的制備

TMC溶液：精密稱取制得的不同粘度的TMC（分子量分別為4萬、10萬、70萬）溶于蒸餾水中，獲得濃度為2 mg/mL的溶液.

TPP溶液：精密稱取適量TPP溶于蒸餾水中，獲得濃度為1 mg/mL的溶液.

1.2.2.2 空白納米粒的制備

量取上述儲備液，分別稀釋成不同濃度，用磁力攪拌器在500 rpm條件攪拌下，將TPP溶液逐滴緩慢地加入到TMC溶液中，繼續(xù)攪拌10 min，即得藍色乳光的膠體溶液.

1.2.3 性質(zhì)測定

1.2.3.1 紅外測定

把經(jīng)過干燥的樣品進行KBr壓片法處理，然后分別對CS和TMC進行紅外光譜分析，在400-4 000 cm-1范圍內(nèi)測定CS和TMC的紅外光譜圖[6].

1.2.3.2 水溶性測定

分別精密量取3種不同的TMC各5 mg，置于西林瓶中，緩慢地加入適量蒸餾水，磁力攪拌器攪拌，觀察TMC的溶解情況，根據(jù)溶解消耗蒸餾水的量對比3種TMC的溶解性.

1.2.4 納米粒的處方篩選

預(yù)實驗結(jié)果表明，當(dāng)TMC和TPP濃度在一定范圍內(nèi)制得的納米粒具有明顯的乳光和較好的膠體成型性，且這兩種材料的濃度對納米粒性質(zhì)影響較大.所以，該部分實驗以TMC和TPP的濃度及TMC與TPP加入比例作為考察因素，以納米粒成球率作為考察指標進行單因素實驗，以獲得納米粒的較優(yōu)處方.將制得的納米粒的膠體溶液在10 000 rpm條件下離心10 min，分離出納米粒，烘干，稱重，得到納米粒的重量，計算其成球率.

1.2.4.1 TMC濃度的影響

將上述制備的 TPP儲備液稀釋成 0.2 mg/mL，TMC儲備液依次稀釋成0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mg/mL，將 TPP 溶液緩慢滴加到 TMC 溶液中，以 500 rpm 的速度攪拌 10 min，在0.2-1.0 mg/mL范圍內(nèi)考察TMC濃度對納米粒成球率的影響.

1.2.4.2 TPP濃度的影響

通過上述實驗得出成球率最高的TMC濃度，將TMC儲備液稀釋成相應(yīng)濃度.TPP儲備液依次稀釋成0.1，0.15，0.2，0.25，0.3 mg/mL，將TPP溶液緩慢滴加到TMC溶液中，以500 rpm速度攪拌，攪拌時間為10 min.在0.1-0.3 mg/mL范圍內(nèi)考察TPP濃度對納米粒成球率的影響.

1.2.4.3 TMC與TPP加入比例的影響

通過上述實驗，得出成球率較高的TMC和TPP濃度.把TMC和TPP分別稀釋到相應(yīng)濃度，兩者按不同加入體積比制備納米粒，攪拌速度為500 rpm，攪拌時間為10 min.在1∶2-5∶2的范圍內(nèi)考察TMC與TPP加入比例對納米粒成球率的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外測定

對CS和TMC的紅外光譜進行分析，測定的IR光譜圖如圖1所示.通過CS和TMC的IR圖譜可知，CS的IR中，在1 595 cm-1處有氨基變形振動峰，而在TMC的IR中，該峰減弱，在2 933 cm-1和1 473 cm-1出現(xiàn)了新吸收峰，分別是CH3伸縮振動峰和N-CH3的變形振動峰，這就表明CS分子中氨基上的部分氫已被甲基所取代.此結(jié)果與文獻[6]中報道結(jié)果一致.

2.2 水溶性測定

3種分子量的CS均難溶于中性和堿性水溶液，改性后得到的3種TMC均能溶于水，水溶性得到改善.3種TMC的溶解性順序為TMC（70萬）＞TMC（4萬）＞TMC（10萬）.CS引入季銨鹽基團，由于季銨鹽的位阻大、水合能力強，大大削弱了CS分子間氫鍵的作用，同時有利于水分子與CS分子中的羥基和氨基形成氫鍵，另外氨基陽性基團的強水溶性也使得CS衍生物水溶性增加，從而增加了CS衍生物的水溶性[7].TMC分子量越大，生物粘附性越強，制備成納米粒后在體內(nèi)停留的時間越長，能更好地發(fā)揮緩釋作用.TMC溶解性越好，分子在水中的伸展程度越高，包載蛋白藥物的能力越強.因此選擇分子量70萬的TMC制備納米粒.

2.3 TMC納米粒制備的單因素篩選

2.3.1 TMC濃度的影響

分別以濃度為 0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mg/mL 的 TMC 溶液，和濃度為 0.2 mg/mL 的 TPP 溶液為材料制備納米粒得到的成球率結(jié)果見表3.以TMC濃度為橫坐標，成球率為縱坐標作圖見圖3.表3中的數(shù)據(jù)和圖3中成球率的變化趨勢均表明，在0.2-1.0 mg/mL范圍內(nèi)，隨著TMC濃度增加，納米粒成球率先增加后減小，濃度在0.4 mg/mL時成球率最大.

圖2 CS 與 TMC 的紅外光譜圖.（a1）分子量為 4 萬的 CS，（a2）分子量為 4 萬的 TMC；（b1）分子量為 10 萬的 CS，（b2）分子量為10萬的TMC；（c1）分子量為70萬的CS，（c2）分子量為70萬的TMC

TMC納米粒的制備方法包括乳化交聯(lián)法、沉淀法、噴霧干燥法、乳滴聚集法、離子交聯(lián)法、反向膠束法[7，8].離子交聯(lián)法是利用TMC中帶正電的季氨基與帶負電的磷酸根，通過靜電作用，在磁力攪拌下形成球形微粒.這種相互作用取決于磷酸根和TMC的電荷密度及分子大小.當(dāng)TMC濃度為0.4 mg/mL時，季氨基的正電荷與0.2 mg/mL的TPP中磷酸根的負電荷相互作用最強，制得的納米粒最多.

2.3.2 TPP濃度的影響

分別以濃度為0.1，0.15，0.2，0.25，0.3 mg/mL的TPP溶液和濃度為0.4 mg/mL的TMC溶液為材料制備納米粒得到的成球率結(jié)果見表4.以TPP濃度為橫坐標，成球率為縱坐標作圖見圖4.

表3 TMC濃度對納米粒成球率的影響（n=3）

圖3 TMC濃度對納米粒成球率的影響

表4中的數(shù)據(jù)和圖4中成球率的變化趨勢均表明在0.1-0.3 mg/mL范圍內(nèi)，隨著TPP濃度增加，納米粒成球率先增加后減小，當(dāng)TPP濃度為0.2 mg/mL時成球率最大.即當(dāng)TPP濃度為0.2 mg/mL時，磷酸根的負電荷與0.4 mg/mL的TMC中季氨基的正電荷相互作用最強，制得的納米粒最多.

2.3.3 TMC與TPP比例的影響

以濃度為0.4 mg/mL的TMC和0.2 mg/mL的TPP為材料，采用離子交聯(lián)法制備納米粒，兩者的加入比例在 1∶2-5∶2 之間變化，考察加入比例對成球率的影響.結(jié)果見表5.以加入比例為橫坐標，成球率為縱坐標作圖見圖5.表5中的數(shù)據(jù)和圖5中成球率的變化趨勢均表明，TMC與TPP投入體積比在1∶2-5∶2之間，隨著比例的增加，納米粒成球率先增加后減小，當(dāng)TMC與TPP投入體積比為3∶2時納米粒成球率最高.即用0.4 mg/mL的TMC溶液和0.2 mg/mL的TPP溶液制備納米粒，當(dāng)兩者的投入體積比為3∶2，TMC中季氨基的正電荷與TPP中磷酸根的負電荷相互作用最強，制得的納米粒最多.

表4 TPP濃度對納米粒成球率的影響

圖4 TPP濃度對成球率的影響

表5 TMC與TPP比例對成球率的影響（n=3）

圖5 TMC與TPP比例對成球率的影響

3 結(jié)論

采用離子交聯(lián)法利用TMC中帶正電的季氨基與TPP中帶負電的磷酸根，通過靜電作用而形成了納米粒.獲得納米粒的較優(yōu)處方是TMC的濃度為0.4 mg/mL，TPP的濃度為0.2 mg/mL，TMC與TPP投入量比例為3∶2.采用此處方成功制得了三甲基殼聚糖納米粒，為進一步制備載蛋白納米粒提供了依據(jù).

[1]ROGER E，LAGARCE F，GARCION E，et al.Biopharmaceutical Parameters to Consider in order to Alter the Fate of Nanocarriers after Oral Delivery[J].Nanomedicine，2010，5（2）：287-306.

[2]李盈.蛋白多肽類藥物制劑的研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2012，12（19）：3 762-3 765.

[3]Huang Suting，Du Yongzhong，Yuan Hong，et al.Synthesis and Anti-hepatitis B Virus Activity of Acyclovir Conjugated Stearic Acid-chitosan Oligosaccharide Micelle[J].Carbohydrate Polymers，2011，83（4）：1 715-1 722.

[4]THANOUMM，KOTZéAF，SCHARRINGHAUSENT，etal.Effectof Degreeof Quaternizationof N-Trimethyl Chitosan Chloridefor Enhanced Transportof Hydrophilic Compoundsacross Intestinal Caco-2 Cell Monolayers[J].Journal of Controlled Release，2000，64（13）：15-25.

[5]陳浮.載蛋白三甲基殼聚糖納米?？诜o藥系統(tǒng)的研究[D].成都：四川大學(xué)，2007.

[6]泥國徽.改性殼聚糖交聯(lián)微球的合成及其蛋白吸附性能的研究[D].濟南：山東大學(xué)，2009.

[7]胡小娟.新型低毒性兩親性殼聚糖衍生物的合成及其蛇床子素膠束的研制[D].蘇州：蘇州大學(xué)，2013.

[8]沈巍.殼聚糖改性及在化妝品中的應(yīng)用研究[D].無錫：江南大學(xué)，2007.

The Modification of Chitosan and Preparation of Nanoparticles

SONG Yu-pin,CHEN Xin-xin,ZHANG Hong-dou
(School of Chemical Engineering,Shijiazhuang University,Shijiazhuang,Hebei 050035,China)

In this project,N,N,N-trimethyl(TMC)is synthesized from three kinds of chitosan with different viscosity through quaternization reaction.The obtained TMC is characterized by FTIR.Testing its water solubility,the result shows that 70w＞4w＞10w is indicated by TMC’s molecular weight.Subsequently,TMC nanoparticles are prepared by ionic gelation method with TPP as the cross linking agent,and characterized by the precipitation efficacy.Single factor screening is carried out to study the best prescription composition:the concentration of TMC is 0.4 mg/mL,the concentration of TPP is 0.2 mg/mL,and the proportion of TMC and TPP is 3:2.

chitosan;N,N,N-trimethyl;nanoparticle

R943

A

1673-1972（2017）06-0009-06

2017-07-20

河北省自然科學(xué)基金（H2016106034）；石家莊學(xué)院化工制藥實驗教學(xué)示范中心本科生科技創(chuàng)新基金（口服艾塞那肽納米粒的研制）

宋玉品（1986-），女，河北深澤人，講師，主要從事藥物新制劑與新劑型研究.

（責(zé)任編輯 王穎莉）