張玉鳳 臧寶赫 李雪 趙文靜

大株紅景天注射液對膿毒癥急性肺損傷小鼠肺組織核因子-κB表達(dá)的影響

張玉鳳1，2臧寶赫1，2李雪1，2趙文靜1

目的觀察大株紅景天注射液對膿毒癥小鼠急性肺損傷的影響及可能機(jī)制。方法將72只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為4組(n=18)：假手術(shù)組(Sham組)、急性肺損傷組(ALI組)、溶媒組(Vehicle組)、大株紅景天注射液組(Sofren組)。ALI組、Vehicle組和Sofren組用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥模型。Vehicle組和Sofren組分別于造模完成時立即腹腔注射溶媒或大株紅景天注射液4 mL/kg，以后每12h一次重復(fù)給藥。術(shù)后 12 h、24 h及48 h 取肺組織，行HE染色后光鏡下觀察肺組織病理損傷，Western blot法檢測肺組織磷酸化IκBα(P-IκBα)、IκBα，磷酸化NF-κBp65(P-p65)的表達(dá)。結(jié)果與Sham組相比，ALI組及Vehicle組肺損傷加重，P-IκBα、P-IκBα/IκBα及P-p65表達(dá)明顯增加(Plt;0.05)；與ALI組相比，Sofren組肺損傷輕，P-IκBα、P-IκBα/IκBα及P-p65表達(dá)明顯減少(Plt;0.05)。結(jié)論大株紅景天注射液減輕膿毒癥小鼠急性肺損傷,其機(jī)制可能與抑制P-p65表達(dá)有關(guān)。

膿毒癥；急性肺損傷；NF-κB；IκBα

急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)是嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷等非心源性疾病過程中，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致急性、進(jìn)行性低氧性呼吸功能不全或衰竭。臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫。ALI和ARDS是同一疾病發(fā)展的不同階段，2012柏林定義摒棄ALI這一概念，根據(jù)氧合指數(shù)將ARDS分為輕、中、重三度[1]，但在動物模型中仍然沿用ALI這一概念。ARDS病因復(fù)雜，在眾多致病因素中，膿毒癥導(dǎo)致的ARDS發(fā)病率高、死亡率高，危害大[2]。研究表明大株紅景天注射液改善老年感染性休克及特發(fā)性肺纖維化患者動脈血氧分壓[3-4]。但具體分子機(jī)制尚不明確，本文從動物實(shí)驗(yàn)角度探討大株紅景天注射液對膿毒癥致急性肺損傷的影響及可能機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物、藥品及主要試劑

清潔級雄性昆明小鼠72只，8-10周齡，體重30-35g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；大株紅景天注射液(批號：1001161001，通化玉圣藥業(yè)有限公司，中國)；磷酸化NF-κBp65抗體、磷酸化IκBα抗體、IκBα抗體、及β-Tubulin內(nèi)參購自巴傲得生物科技有限公司。

二、動物分組和模型制備

健康昆明雄性小鼠72只，購自徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組(n=18)： Sham組、ALI組、Vehicle組、Sofren組。盲腸結(jié)扎穿孔致膿毒癥模型參照文獻(xiàn)[5]。具體步驟：腹腔注射10%水合氯醛3mL/kg麻醉小鼠,仰臥位固定，沿腹正中線作1.5 cm切口。開腹后找到盲腸，在距盲腸末端1cm處結(jié)扎，用21G針頭穿通遠(yuǎn)端腸壁兩次形成盲腸漏，然后將盲腸還納腹腔，逐層縫合。Sham組切開腹腔取出盲腸后還納并縫合，ALI組、Vehicle組和Sofren組采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥模型。Vehicle組、Sofren組術(shù)畢分別腹腔注射雙蒸水、大株紅景天注射液4mL/kg,以后按每12小時一次重復(fù)給藥。

三、小鼠一般情況觀察

術(shù)后觀察小鼠活動、飲食、精神及呼吸等。

四、肺組織HE染色后病理學(xué)觀察

取肺組織10%甲醛固定24h,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肺病理組織損傷。

五、肺組織P-IκBα、IκBα、P-p65 蛋白測定

取肺組織制備勻漿，提取細(xì)胞核蛋白及細(xì)胞漿蛋白：細(xì)胞漿蛋白用于P-IκBα和IκBα的測定，細(xì)胞核蛋白用于P-p65的測定。用Western blot法 檢測蛋白，蛋白樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加一抗4℃孵育過夜，漂洗，加二抗室溫孵育2h，漂洗后，用BCIP/NBP堿性磷酸酯酶試劑盒顯色，采用Image J圖像分析系統(tǒng)定量分析。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、一般情況

Sham組小鼠精神狀況及活動佳，飲食攝水正常，呼吸平穩(wěn)。 ALI組及Vehicle組小鼠造模12h后出現(xiàn)倦怠、寒顫、豎毛、少動少食、腹瀉、眼角滲出物、膿性尿、口唇發(fā)紺、呼吸困難等表現(xiàn)。

二、肺組織病理學(xué)觀察

各組小鼠肺組織HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察：術(shù)后12、24及48 h，Sham組肺組織結(jié)構(gòu)完好，肺泡清晰(見圖1A、1E、1I)；ALI組和Vehicle組肺組織病理變化明顯，可見肺泡破裂融合，肺泡間隔增厚，肺泡間隔及肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞聚集(見圖1B、1F、1J，圖1C、1G、1K)；與ALI組相比，Sofren組肺泡結(jié)構(gòu)破壞減輕，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，肺泡間隔未見明顯增厚(見圖1D、1H、1L)。

圖1 小鼠肺組織病理學(xué)改變(HE染色×200)

注： A-D為術(shù)后12h：A:Sham組,B:ALI組,C:Vehicle組,D:Sofren組; E-H為術(shù)后24h：E:Sham組,F:ALI組,G:Vehicle組,H:Sofren組; I - L為術(shù)后48h：I :Sham組,J:ALI組,K:Vehicle組,L:Sofren組。

三、 肺組織P-IκBα、P-p65蛋白表達(dá)變化

術(shù)后同一時間點(diǎn)，與Sham組相比，ALI組和Vehicle組P-IκBα、P-IκBα/IκBα及P-p65表達(dá)明顯增加(Plt;0.05)；與ALI組相比，Sofren組P-IκBα、P-IκBα/IκBα及P-p65表達(dá)明顯減少，Plt;0.05(見圖2-4)。

圖2 術(shù)后12h P-IκBα、IκBα及P-p65蛋白表達(dá)變化

注：與Sham組比較*Plt;0.05；與ALI組比較，#Plt;0.05

圖3 術(shù)后24h P-IκBα、IκBα及P-p65蛋白表達(dá)變化

注：與Sham組相比*Plt;0.05；與ALI組相比，#Plt;0.05

圖4 術(shù)后48h P-IκBα、IκBα及P-p65蛋白表達(dá)變化

討 論

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是導(dǎo)致急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的最常見病因。程曉明等[6]調(diào)查發(fā)現(xiàn)全身性感染是間接肺損傷的首要原因，近年來盡管抗感染治療和器官功能支持取得長足進(jìn)步，但膿毒癥導(dǎo)致ARDS死亡率遠(yuǎn)高于其他病因引起的ARDS，高達(dá)40.6%[2]。中心粒細(xì)胞肺內(nèi)聚集和活化、炎癥介質(zhì)釋放、氧化應(yīng)激是ARDS的重要發(fā)病機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在ARDS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，主要表現(xiàn)為促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管屏障功能障礙[7-8]。此外，NF-κB活化在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡中起重要作用[9-11]，同時氧化應(yīng)激與NF-κB活化又可相互促進(jìn)。

NF-κB/Rel是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，有5種Rel亞基：Rel(cRel)、RelA(p65，NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)[12]。NF-κB是由這5種亞基構(gòu)成的同源或異源二聚體蛋白，P50- p65異二聚體是NF-κB最主要的二聚體形式；IκBα與NF-κB結(jié)合，抑制NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞核。靜息狀態(tài)下NF-κB二聚體與IκBα結(jié)合以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中[13]。在LPS、TNF-α、IL等刺激下，IκBα特定位點(diǎn)的絲氨酸殘基磷酸化、隨后范素化并降解，NF-κB暴露出核定位信號區(qū)，轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞核與特定目DNA序列結(jié)合，啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[12]。

大株紅景天注射液是從大株紅景天中提取的中藥注射液。既往研究表明紅景天具有抗氧化、抗凋亡、抗疲勞、心肌保護(hù)、改善認(rèn)知功能、抗抑郁、調(diào)節(jié)免疫、抗增殖等藥理作用[14-20]。其抗氧化、抗凋亡及免疫調(diào)節(jié)作用可能對膿毒癥所致ARDS具有保護(hù)作用，因此本實(shí)驗(yàn)選擇大株紅景天注射液，研究其對膿毒癥小鼠急性肺損傷的作用。大株紅景天注射液的主要有效成分是紅景天苷、酪醇、紅景天芬(又稱絡(luò)塞維)、紅景天任(又稱絡(luò)塞琳)等，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)這四種成分均具有較強(qiáng)抗氧化能力，其中紅景天苷和酪醇具有明顯羥自由基清除作用[21]。Rahman等[22]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可以促進(jìn)NF-κB的活化，進(jìn)而影響IL-1、IL-6、TNFα等促炎基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示大株紅景天注射液減輕膿毒癥小鼠急性肺損傷癥狀及肺組織病理學(xué)變化。盲腸結(jié)扎穿孔后小鼠肺組織胞漿蛋白P-IκBα表達(dá)增強(qiáng)，P-IκBα/IκBα增加，同時細(xì)胞核蛋白P-p65表達(dá)增加。腹腔注射大株紅景天注射液后，肺組織胞漿蛋白P-IκBα蛋白表達(dá)減少，P-IκBα/IκBα下降，細(xì)胞核蛋白P-p65表達(dá)減少。這些結(jié)果提示膿毒癥早期大株紅景天注射液可能是通過抑制NF-κB的活化，減輕膿毒癥相關(guān)急性肺損傷。

[1] Ranieri VM,Rubenfeld GD,Thompson BT,et al.Acute respiratory distress syndrome: the Berlin Definition[J].JAMA,2012,307(23):2526-2533.

[2] Rubenfeld GD,Caldwell E,Peabody E,et al.Incidence and outcomes of acute lung injury[J].N Engl J Med,2005,353(16):1685-1693.

[3] 郭琳娜,董國嶺,王英杰,等.大株紅景天注射液治療老年感染性休克23例療效觀察[J].河北中醫(yī),2013,35(7):1041-1043.

[4] 楊潔.大株紅景天注射液治療特發(fā)性肺纖維化的臨床研究[J].中醫(yī)臨床研究,2014,6(17):8-9.

[5] Rittirsch D,Huber-Lang MS,Flierl MA,et al.Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture[J].Nat Protoc,2009,4(1):31-36.

[6] 程曉明,朱波,張彥琦,等.急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征604例臨床分析[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2004,14(15):132-135,137.

[7] Zhang Y,Zhang X,Rabbani ZN,et al.Oxidative stress mediates radiation lung injury by inducing apoptosis[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2012,83(2):740-748.

[8] Kratzer E,Tian Y,Sarich N,et al.Oxidative stress contributes to lung injury and barrier dysfunction via microtubule destabilization[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2012,47(5):688-697.

[9] 吳煒景,李理,袁偉鋒,等.NF-κB p65基因在TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞氧化損傷中的作用[J].中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志,2012,11(1):46-51.

[10] 李磊,湯耀卿,紀(jì)玉寶,等.NF-κB對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響[J].中國微循環(huán),2009,13(1):22-24.

[11] 黃英,劉國祥.肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡在急性肺損傷中的作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2002,12(3):35-37.

[12] Karin M,Ben-Neriah Y.Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity[J].Annu Rev Immunol,2000,18:621-663.

[13] Gilmore TD.The Rel/NF-κB signal transduction pathway: introduction[J].Oncogene,1999,18(49):6842-6844.

[14] Panossian A,Wikman G,Sarris J.Rosenroot (Rhodiola rosea): traditional use, chemical composition, pharmacology and clinical efficacy[J].Phytomedicine,2010,17(7):481-493.

[15] Tan CB,Gao M,Xu WR,et al.Protective effects of salidroside on endothelial cell apoptosis induced by cobalt chloride[J].Biol Pharm Bull,2009,32(8):1359-1363.

[16] Punja S,Shamseer L,Olson K,et al.Rhodiola rosea for mental and physical fatigue in nursing students: a randomized controlled trial[J].PLoS One,2014,9(9):e108416.

[17] Zhu L,Wei T,Chang X,et al.Effects of Salidroside on Myocardial Injury In Vivo In Vitro via Regulation of Nox/NF-κB/AP1 Pathway[J].Inflammation,2015,38(4):1589-1598.

[18] Lai W,Zheng Z,Zhang X,et al.Salidroside-Mediated Neuroprotection is Associated with Induction of Early Growth Response Genes (Egrs) Across a Wide Therapeutic Window[J].Neurotox Res,2015,28(2):108-121.

[19] Amsterdam JD,Panossian AG.Rhodiola rosea L. as a putative botanical antidepressant[J].Phytomedicine,2016,23(7):770-783.

[20] Recio MC,Giner RM,Máez S.Immunmodulatory and Antiproliferative Properties of Rhodiola Species[J].Planta Med,2016,82(11-12):952-960.

[21] 馬天翔,史寧,陳乾,等.紅景天中8種成分體外抗氧化作用的比較[J].中國藥理學(xué)通報，2012,28(9):1224-1228.

[22] Rahman I,Marwick J,Kirkham P.Redox modulation of chromatin remodeling: impact on histone acetylation and deacetylation,NF-kappaB and pro-inflammatory gene expression[J].Biochem Pharmacol,2004,68(6):1255-1267.

EffectofsofreninjectiononNF-κBexpressioninacutelunginjurymicewithsepsis

ZHANGYu-feng,ZANGBao-he,LIXue,ZHAOWen-jingDepartment
Anesthesiology,theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221009,China

ObjectiveTo observe the effect of sofren injection on septic acute lung injury in mice and its mechanism.Methods72 male Kunming mice were randomly divided into 4 groups (n=18): the sham group, the ALI group, the vehicle group, and the sofren injection group. Sepsis model was established by cecal ligation and puncture (CLP) in the group ALI, vehicle and sofren. In the group vehicle and sofren, 4mL/kg vehicle or sofren injection were intraperitoneally injected respectively after operation, followed by administration q12h. At 12, 24 and 48 h after operation, the whole lung were removed to observe the lung pathological damage after hematoxylin-eosin staining, and to detect the expression of P-IκBα, IκBα and NF-KBp65 (using Westen blot) in lung tissues.ResultsAs compared with the sham group, the pathological damage of lung and the level of P-IκBα, P-IκBα/IκBα and P-IκBα at 12, 24 and 48 h after operation were significantly increased in the ALI group (Plt;0.05). Compared with the ALI group, the pathological damage of lung and the level of P-IκBα, P-IκBα/IκBα and P-IκBα at each time were significantly decreased in the sofren group (Plt;0.05).ConclusionSofren injection inhibits the expression of P-p65, thus protects sepsis-induced ALI in mice.

sepsis; acute lung injury (ALI); NF-κB; IκBα

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.12.005

江蘇省 2009年度quot;六大人才高峰quot;D類資助項(xiàng)目(No 2009059)

1.221009 江蘇 徐州，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 2.221009 江蘇 徐州，江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

趙文靜，Email:zhaowj886@sina.com

2017-04-07]